本發(fā)明涉及泛醇-細(xì)胞色素c還原酶核心蛋白1(ubiquinol-cytochromecreductasecoreprotein1，uqcrc1)激動(dòng)劑在制備治療缺血缺氧性心臟病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心臟是重要的生命器官，心臟規(guī)律的收縮和舒張運(yùn)動(dòng)能夠?qū)⒀跬ㄟ^血液循環(huán)傳輸至機(jī)體組織，保障機(jī)體能量代謝進(jìn)行，而心臟運(yùn)動(dòng)需要消耗大量的atp，因此心肌的能量供應(yīng)影響到機(jī)體生命活動(dòng)的進(jìn)行。缺血缺氧導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞獲得的氧減少，而氧是機(jī)體atp生成的必要因素，缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞atp水平下降，心臟供能不足而導(dǎo)致功能下降，另外缺氧會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物如丙二醛(mda)等濃度上升，導(dǎo)致細(xì)胞膜和亞細(xì)胞膜通透性增加，堆積的脂酰coa，脂肪酸可致心肌細(xì)胞死亡，破壞心臟的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致功能下降，最終導(dǎo)致缺血缺氧性心臟病，如心絞痛、心肌梗塞、心肌梗死、高原心臟病等。因此，保護(hù)缺血缺氧的心肌細(xì)胞是防治缺血缺氧性心臟病的重要治療策略，對維持機(jī)體生命活動(dòng)具有重要的意義。有研究表明，泛醇-細(xì)胞色素c還原酶核心蛋白1(ubiquinol-cytochromecreductasecoreprotein1，uqcrc1)表達(dá)上調(diào)參與了心肌保護(hù)效應(yīng)。

缺血預(yù)處理(ischemiapreconditioning，ipc)是通過觸發(fā)機(jī)體內(nèi)源性抗損傷機(jī)制而增強(qiáng)心肌細(xì)胞對缺血缺氧的耐受能力。ipc的保護(hù)作用呈雙相過程，第一相稱為預(yù)處理的快速相，出現(xiàn)在預(yù)處理的數(shù)分鐘，持續(xù)1-3h。第二相稱為預(yù)處理的延遲相(secondwindowofprotection，swop)，出現(xiàn)在初次缺血后的12-72h。研究結(jié)果表明，ipc時(shí)心肌保護(hù)效果最強(qiáng)的時(shí)間位點(diǎn)是在延遲相。uqcrc1是線粒體呼吸鏈復(fù)合體iii上的一個(gè)亞單位，具有重要的生理功能。近年來的研究結(jié)果表明，uqcrc1的表達(dá)改變與大鼠心肌的swop呈正相關(guān)。線粒體katp通道是ipc和藥物預(yù)處理如嗎啡、舒芬太尼、七氟醚、異氟醚等延遲預(yù)處理的共同“終末效應(yīng)器”，開放線粒體katp通道是它們產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的共同信號(hào)通路。二氮嗪(diazoxide，dz)是線粒體katp通道的特異性開放劑，通過開放氧糖剝奪(oxygenglucosedeprivation，ogd)模型缺血/再灌注損傷后心肌細(xì)胞的線粒體katp通道來實(shí)現(xiàn)uqcrc1蛋白表達(dá)的上調(diào)，使細(xì)胞保護(hù)性蛋白bcl-2和cox-2等表達(dá)增加、bcl-2/bax比率增高，繼而抑制caspase-3凋亡信號(hào)通路激活，激活akt/gsk-3β細(xì)胞保護(hù)信號(hào)通路，顯著增加ogd損傷后的心肌細(xì)胞的存活率，從而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。采用線粒體katp通道特異性阻滯劑5-羥葵酸(5-hydroxydecanote，5-hd)進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，會(huì)使二氮嗪預(yù)處理時(shí)線粒體katp通道關(guān)閉，則完全消除二氮嗪延遲預(yù)處理后uqcrc1的表達(dá)上調(diào)，消除swop對心肌細(xì)胞bcl-2和cox-2蛋白表達(dá)的影響，其心肌保護(hù)作用也隨之消失。

因此uqcrc1是swop中的保護(hù)性蛋白，它可能成為心肌保護(hù)的新靶點(diǎn)。提示能夠與uqcrc1結(jié)合且有激動(dòng)作用，是能夠增強(qiáng)uqcrc1活性的化合物，具有治療缺血缺氧性心臟病的藥理效應(yīng)，如心絞痛、心肌梗塞、心肌梗死、高原心臟病等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種uqcrc1激動(dòng)劑，并將其應(yīng)用于制備治療缺血缺氧性心臟病藥物。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：先確定一個(gè)uqcrc1的藥物口袋。通過計(jì)算機(jī)輔助，將小分子化合物作用于該藥物口袋，進(jìn)行生物學(xué)活性檢測。最后用藥理學(xué)試驗(yàn)予以驗(yàn)證。具體如下：

1)、采用同源建模法確定靶蛋白u(yù)qcrc1的結(jié)構(gòu)，確定一個(gè)uqcrc1的藥物口袋。

對人、牛的uqcrc1蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對顯示，uqcrc1為高度保守的蛋白質(zhì)，在四個(gè)物種間，序列差異很小。由于牛的該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，因此使用同源建模工具swiss-model，以牛2.26a分辨率的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)1fyu為模板，建立人uqcrc1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，如圖1所示。

從結(jié)構(gòu)可以看出，uqcrc1蛋白質(zhì)表面有一個(gè)很大的疏水“口袋”，該口袋為該蛋白質(zhì)與complexsubunit2形成復(fù)合物的主要結(jié)合部位。因此理論上，作用于該“口袋”的小分子化合物，將對該蛋白質(zhì)的功能帶來影響。

2)使用ledock分子對接程序進(jìn)行初步活性篩選。

使用vmd1.9.3來處理人uqcrc1蛋白質(zhì)。先使用lepro_linux_x64程序，去除雜原子，并加極性氫，殘基的名字也改為charmm的命名方式。然后在vmd中打開受體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使用pythom程序boxer計(jì)算對接盒子，將口袋中心設(shè)為盒子中心，設(shè)定邊長40a的立方體盒子的空間作為對接盒子，該盒子包含了整個(gè)疏水口袋和周邊區(qū)域。設(shè)置好的受體盒子如圖2所示。

在高性能計(jì)算平臺(tái)上，使用ledock分子對接程序包來處理受體和配體。使用shell編程，調(diào)用lefrag_linux_x64程序，將chemdiv的約170萬個(gè)化合物分割到15個(gè)目錄，每個(gè)目錄下約110000個(gè)化合物小分子。準(zhǔn)備ligands文件、dock文件，編寫sge作業(yè)腳本，使用ledock_linux_x64程序，將每個(gè)分割包中的小分子分別與受體蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對接。調(diào)用200個(gè)cpu進(jìn)行并行計(jì)算。每次對接均計(jì)算10個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)，對接區(qū)域以蛋白質(zhì)表面疏水口袋為中心，邊長40a的立方體盒子。

使用python編程，提取每個(gè)小分子對接結(jié)果中最優(yōu)的得分，保存到文本文件中。然后通過matlab程序，從文本文件中篩選出228個(gè)對接自由能小于-8kj/mol，對接效率高于0.3的小分子化合物。

3)使用autodock_vina軟件進(jìn)行二次篩選。

首先使用autodocktools1.5.6對人uqcrc1蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，去掉水分子和雜原子，添加極性氫鍵，保存為pdtqt格式。對接盒子包含整個(gè)蛋白質(zhì)表面，如圖3所示，box設(shè)置為邊長66a的立方體盒子。

然后從zinc數(shù)據(jù)庫批量下載228個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，使用lefrag分割為單個(gè)mol2結(jié)構(gòu)的小分子，使用python腳本程序和autodocktools，將mol2格式的小分子轉(zhuǎn)換為pdbqt格式。最后，編寫sge作業(yè)腳本，提交計(jì)算任務(wù)到計(jì)算節(jié)點(diǎn)，使用autodock_vina程序，將228個(gè)小分子分別于受體蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對接。使用shell編程提取對接自由能最低的結(jié)果，保存到文本文件。對autodock_vina分子對接結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和篩選，結(jié)果顯示在228個(gè)化合物中，有24個(gè)低于-8.6kj/mol，14個(gè)低于-9kj/mol。

4)對接自由能低于-8.6kj/mol的化合物與人uqcrc1具有高親和力，選擇這24個(gè)合物作為uqcrc1激動(dòng)劑，用于制備治療缺血缺氧性心臟病藥物。這24個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及其與人uqcrc1的對接自由能如表1所示。

表1：24個(gè)化合物與人uqcrc1的對接自由能及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式

附圖說明

圖1是人uqcrc1蛋白質(zhì)cartoon形式的三維結(jié)構(gòu)。

圖2是使用vmd1.9.3設(shè)置好的人uqcrc1蛋白質(zhì)受體盒子。

圖3是使用autodocktools1.5.6設(shè)置好的人uqcrc1蛋白質(zhì)受體盒子。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

從與人uqcrc1結(jié)合親和力最高的24個(gè)化合物選擇4個(gè)作為實(shí)施例，進(jìn)行藥理活性評價(jià)。本發(fā)明的分子結(jié)構(gòu)有的存在藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體，這些藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體在實(shí)施例中未全部說明但不限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

化合物a：compoundid為zinc35429578，純度為99.5％，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

化合物b：compoundid為zinc35429587，純度為99.7％，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

化合物c：compoundid為zinc46031528，純度為99.6％，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

化合物d：compoundid為zinc06193999，純度為99.8％，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

化合物a、b、c、d對缺氧原代心肌細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)：

分組與給藥：雄性sd大鼠乳鼠70只，單籠喂養(yǎng)3天后，按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組、給藥a組、給藥b組、給藥c組、給藥d組，提取心肌細(xì)胞，溶劑對照組和模型對照組給予生理鹽水20ul/ml，陽性對照組給予氟桂利嗪20ug/ml，給藥a組給予化合物a20ug/ml，給藥b組給予化合物b20ug/ml，給藥c組給予化合物c20ug/ml，給藥d組給予化合物d20ug/ml，正常環(huán)境培養(yǎng)5d。

實(shí)驗(yàn)方法：將培養(yǎng)好的sd大鼠乳鼠放入75％酒精中浸泡消毒1min，取出后開胸取心臟放入預(yù)冷的d-hanks液中。剔除心臟周邊的血凝塊及纖維組織，置于另一含d-hanks液的小燒杯中，將心臟剪成1mm3左右的碎塊。取0.08％胰酶，0.05％ii型膠原酶混合消化液6ml37℃消化6min，加600ul胎牛血清終止消化。200目網(wǎng)篩濾過，1500rpm離心取沉淀后用含1％青鏈霉素、10％fbs、0.1mmbrdu的dmem完全培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中。37℃、5％的co2飽和濕度下培養(yǎng)貼壁1.5h，收集未貼壁細(xì)胞，即為純度較高的心肌細(xì)胞。離心，顯微鏡下計(jì)數(shù)后隨機(jī)接種在24孔板中，每孔放在co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5d后，更換不含胎牛血清的dmem培養(yǎng)基?？瞻捉M在正常氧氣濃度為21％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，模型組、陽性組、給藥a組、給藥b組、給藥c組和給藥d組細(xì)胞放入溫度為37℃，co2濃度為5％，o2濃度為1％的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧處理，缺氧時(shí)間為8h。缺氧后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒的要求分別測試乳酸脫氫酶(ldh)、丙二醛(mda)、肌酸激酶(ck)、超氧化物歧化酶(sod)的水平。取余下細(xì)胞按凱基細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的要求，用流式細(xì)胞儀測試細(xì)胞凋亡的情況及用mtt法，在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值，計(jì)算心肌細(xì)胞的活力水平。

檢測指標(biāo)：細(xì)胞凋亡指數(shù)、細(xì)胞活力、細(xì)胞上清液酶學(xué)指標(biāo)：ldh、mda、ck、sod。

統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對變量進(jìn)行組間二樣本等方差假設(shè)的t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見表2和表3。

表2化合物a、b、c、d對缺氧培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞活力的影響

注：^△p＜0.05，^△△p＜0.01，^△△△p＜0.001vs模型對照組

表3化合物a、b、c、d對原代缺氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞酶學(xué)的影響

注：^△p＜0.05^，△△p＜0.01，^△△△p＜0.001vs模型對照組

結(jié)果分析與結(jié)論：

與空白組相比，模型組細(xì)胞活力顯著下降，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著上升，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中l(wèi)dh、ck、mda含量顯著增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sod含量顯著下降，說明缺氧對大鼠原代心肌細(xì)胞活力以及心肌細(xì)胞酶學(xué)產(chǎn)生了影響顯著，缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、凋亡。

與模型組相比較，給藥a組、給藥b組、給藥c組、給藥d組大鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降，lhd、ck、mda濃度顯著降低，sod濃度顯著增高，說明化合物a、b、c、d對保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞，減輕因細(xì)胞壞死造成心肌酶的外溢以及對缺氧引起的氧化應(yīng)激有較好的保護(hù)作用。提示化合物a、b、c、d具有治療缺血缺氧性心臟病的作用，如心絞痛、心肌梗塞、心肌梗死、高原心臟病等。