本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種腦靶向遞藥系統(tǒng)，具體涉及一種短肽angiopep-2修飾的、由高強(qiáng)度聚焦超聲(hifu)控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤glioblastomamultiforme(gbm)作為顱內(nèi)最常見且死亡率最高的原發(fā)性惡性腫瘤，其平均生存期僅有14個(gè)月。傳統(tǒng)的外科切除難以將腫瘤組織完全清除而易導(dǎo)致復(fù)發(fā)?；熜Ч质苎X屏障(blood-brainbarrier,bbb)的限制，僅有10～20％的諸如替莫唑胺、卡莫司汀等化療藥物能透過血腦屏障，致使藥物入腦率極低，加之目前臨床化療藥物多缺乏靶向性，最終到達(dá)腫瘤組織的藥量少之又少，使得化療效果并不理想，同時(shí)一系列的毒副作用也嚴(yán)重影響到患者的生存質(zhì)量，術(shù)后生存期一般不超過半年。1986年腫瘤的增強(qiáng)穿透與滯留(enhancedpermeabilityandretention,epr)效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)為大分子藥物被動(dòng)靶向遞送開啟了一扇窗，然而腦部腫瘤的epr效應(yīng)相對(duì)較弱，其平均孔徑僅為7～100nm，為此腦部腫瘤遞藥系統(tǒng)的尺寸受到了很大限制。

近年來，納米靶向遞藥系統(tǒng)憑借其在尺寸及表面修飾方面的優(yōu)勢(shì)，受到越來越多的關(guān)注。作為四大入胞途徑之一，內(nèi)源性受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用被廣泛應(yīng)用于血腦屏障及腦腫瘤的靶向藥物遞送。其中，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein,lrp)作為近年來公認(rèn)且有效的腦靶向marker之一，同時(shí)高表達(dá)于血腦屏障及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面。其配體aniopep-2短肽常用于腦靶向遞藥系統(tǒng)的修飾，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血腦屏障以及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的雙重靶向作用。

阿霉素(doxorubicin,dox)作為最有效的廣譜抗腫瘤藥之一，被用于循環(huán)腫瘤以及腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的等多種實(shí)體瘤的治療。它能插入dna雙鏈、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅱ的活性，從而阻斷dna的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。然而由于缺乏靶向性，對(duì)正常組織尤其是心臟的毒副作用很大程度上限制了阿霉素的發(fā)展?，F(xiàn)用于臨床的脂質(zhì)體阿霉素雖然顯著提高了阿霉素的體內(nèi)安全性，但增加靶向性仍是阿霉素遞藥系統(tǒng)改良優(yōu)化的主要方向之一。

隨著科學(xué)家們對(duì)腫瘤微環(huán)境的研究深入，針對(duì)腫瘤微環(huán)境來調(diào)控藥物釋放的遞藥系統(tǒng)層出不窮，大致分為對(duì)內(nèi)源性刺激響應(yīng)和外源性刺激響應(yīng)的兩大類藥物控釋系統(tǒng)。其中，外源性的機(jī)械力刺激一般可從聲、電、磁等途徑獲得。超聲，是指大于20khz的聲波，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)造影、碎石、組織消融、經(jīng)皮給藥等用途。超聲以其高頻聚焦的特性，通過對(duì)空間及溫度的調(diào)控，以微創(chuàng)且遠(yuǎn)程的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)“刺激”的控制。醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，超聲通過熱效應(yīng)及空穴效應(yīng)兩方面來發(fā)揮作用。跟據(jù)頻率的高低，超聲可分為低頻超聲(20～200khz)和高頻超聲(＞200khz)兩類。低頻超聲具有強(qiáng)穿透力、低衰減的優(yōu)勢(shì)，但難以聚焦以及產(chǎn)生的強(qiáng)大空穴效應(yīng)均會(huì)對(duì)人體造成損傷。而高頻超聲的高聚焦能力及高衰減特性則對(duì)焦點(diǎn)以外的組織不會(huì)造成損傷，因此被廣泛應(yīng)用于疾病的診斷和治療。近些年興起的高強(qiáng)度聚焦超聲(high-intensityfocusedultrasound,hifu)---“海扶刀”(0.8～3.2mhz)因其毫米級(jí)的超高聚焦能力在腫瘤組織消融方面?zhèn)涫芮嗖A，高頻超聲波到達(dá)組織后急劇衰減轉(zhuǎn)化為熱能，使得焦點(diǎn)溫度瞬間升高至60℃以上，導(dǎo)致蛋白變性及組織細(xì)胞不可逆凝固性壞死；而空穴效應(yīng)也使組織間液、細(xì)胞間液汽化膨脹以致爆破，所產(chǎn)生的輻向力最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷、壞死。

同時(shí)，超聲也應(yīng)用于合成化學(xué)尤其是高分子化學(xué)中，有文獻(xiàn)報(bào)道高頻超聲可以誘導(dǎo)高分子解聚，這為藥物的控釋提供了新的思路。但目前由普通高頻超聲調(diào)控的遞藥系統(tǒng)還比較局限，多為脂質(zhì)體或膠束，粒徑均偏大，所適用的疾病類型范圍較窄。而高強(qiáng)度聚焦超聲hifu的治療目前也主要集中在乳腺癌、前列腺癌等皮下瘤的可視化組織消融方面，hifu的其他應(yīng)用領(lǐng)域還未被開發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的：

1)提供一種hifu控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)，該遞藥系統(tǒng)通過納米粒表面修飾的短肽(angiopep-2)對(duì)血腦屏障以及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的雙重靶向作用，來增強(qiáng)藥物阿霉素(dox)在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的蓄積，再通過高強(qiáng)度聚焦超聲(hifu)誘導(dǎo)藥物阿霉素(dox)在腦膠質(zhì)瘤部位瞬時(shí)充分釋放，從而顯著提高對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療效果。

2)提供構(gòu)建該hifu控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)的制備方法及用途。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種hifu控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)，特點(diǎn)是，該遞藥系統(tǒng)包括靶向分子、藥物、發(fā)泡劑和納米載體，所述靶向分子為angiopep-2短肽，藥物為阿霉素dox，發(fā)泡劑為全氟辛烷pfob，納米載體為末端羧基修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物plga-cooh、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇dspe-peg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺dspe-peg-mal三者的混合物；所述靶向分子angiopep-2通過共價(jià)連接的方式與納米載體表面的聚乙二醇相連；所述藥物和發(fā)泡劑以包裹的方式共包載在納米載體內(nèi)；所述發(fā)泡劑在hifu作用下瞬時(shí)汽化，產(chǎn)生的輻向力使納米載體迅速崩解，加速釋藥；所述靶向分子的序列為5’-tyr-glu-glu-thr-lys-phe-asn-asn-arg-lys-gly-arg-ser-gly-gly-tyr-phe-phe-thr-3’；所述納米載體中plga-cooh與dspe-peg、dspe-peg-mal之和的質(zhì)量比為4:1～5:1；所述納米載體中dspe-peg與dspe-peg-mal的摩爾比為15:1～20:1；所述遞藥系統(tǒng)即angiopep-2修飾的載阿霉素/發(fā)泡劑的納米粒anp-d/p的粒徑為35～45nm，粒徑分散度為0.1～0.2。

一種上述hifu控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)的制備方法，該方法包括以下具體步驟：

步驟1：取末端羧基修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物plga-cooh、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇dspe-peg和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺dspe-peg-mal溶于丙酮，再加入阿霉素dox甲醇溶液和全氟辛烷pfob并混合均勻；其中plga-cooh與dspe-peg、dspe-peg-mal之和的質(zhì)量比為4:1～5:1；dspe-peg與dspe-peg-mal的摩爾比為15:1～20:1；dox與plga-cooh、dspe-peg、dspe-peg-mal之和的質(zhì)量比為1:100～2:100；pfob與plga-cooh、dspe-peg、dspe-peg-mal之和的質(zhì)量比為1:100～2:100；plga-cooh的分子量為50000～70000；dspe-peg的分子量為2000；dspe-peg-mal的分子量為3400；dox甲醇溶液濃度為5～10mg/ml；pfob的濃度為15～20mg/ml；丙酮、甲醇、全氟辛烷均為分析純；

步驟2：將步驟1所得的混合溶液快速注入至tris-hcl溶液中，其中丙酮與tris-hcl溶液的體積比為1:1～1:3；tris-hcl溶液的濃度為10mm，ph為8.0；40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即可得到tris-hcl分散的載dox和pfob的納米粒np-d/p溶液；

步驟3：將步驟2所得納米粒溶液移至超濾管，2000g離心10min后再加入去離子水重懸，其中截留分子量為20000～50000；重復(fù)此步驟2～3次，即可得到去離子水分散的納米粒np-d/p溶液；

步驟4：向步驟3所得納米粒溶液中逐滴加入angiopep-2短肽水溶液，其中dspe-peg-mal與angiopep-2的摩爾比為2:1～4:1；25℃、350rpm條件下磁力攪拌2h，即可得到angiopep-2短肽修飾的納米粒anp-d/p溶液；

步驟5：將步驟4所得納米粒溶液移至超濾管，2000g離心10min后再加入去離子水重懸，其中截留分子量為20000～50000；重復(fù)此步驟2～3次，除去未結(jié)合的angiopep-2短肽，即得到純化后的納米粒anp-d/p溶液；

步驟6：將步驟5所得納米粒溶液真空冷凍干燥，即得到所述的hifu控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)。

一種權(quán)利要求1所述hifu控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)的用途，該納米遞藥系統(tǒng)作為化療藥物，用于對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療，具體包括以下步驟：

步驟1：靜脈注射該遞藥系統(tǒng)；

步驟2：當(dāng)該遞藥系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤部位充分蓄積后，即給藥后24～48h，在腦膠質(zhì)瘤部位給予hifu輻照，誘導(dǎo)藥物在腫瘤部位瞬時(shí)充分釋放。

本發(fā)明的hifu控釋的腦膠質(zhì)瘤靶向納米遞藥系統(tǒng)通過以下幾方面來發(fā)揮作用：

1)本發(fā)明所述遞藥系統(tǒng)具有對(duì)血腦屏障(bbb)及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的雙重靶向功能。首先，通過增強(qiáng)藥物的血腦屏障穿透效率來提高藥物的入腦量，其次，通過對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步地提高藥物在腦膠質(zhì)瘤部位的蓄積，從而達(dá)到顯著提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的目的，進(jìn)而提高腦膠質(zhì)瘤的化療效果。

2)本發(fā)明所述遞藥系統(tǒng)在對(duì)腦膠質(zhì)瘤的靶向遞藥基礎(chǔ)上，通過hifu輻照誘導(dǎo)藥物在腦膠質(zhì)瘤部位的瞬時(shí)充分釋放，從而進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)腦膠質(zhì)瘤的化療效果。

3)本發(fā)明所述遞藥系統(tǒng)中，hifu輻照本身所產(chǎn)生的熱效應(yīng)和空穴效應(yīng)也可以對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞起到誘導(dǎo)凋亡的作用。

4)本發(fā)明所述遞藥系統(tǒng)通過藥物的靶向遞送以及hifu控制的藥物定點(diǎn)釋放這兩方面來大大減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

1)本發(fā)明遞藥系統(tǒng)具有較小的粒徑(35～45nm)和較好的均一度(pdi＝0.1～0.2)。相比粒徑100nm左右的普通納米遞藥系統(tǒng)，該遞藥系統(tǒng)非常適合腦部腫瘤的遞藥。

2)本發(fā)明遞藥系統(tǒng)具有血腦屏障、腦膠質(zhì)瘤的雙重靶向作用。相比臨床中用于腦膠質(zhì)瘤的非靶向藥物以及普通非靶向納米遞藥系統(tǒng)，能夠顯著增加藥物在腦膠質(zhì)瘤部位的蓄積，從而提高腦膠質(zhì)瘤的化療效，同時(shí)有效降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用。

3)本發(fā)明遞藥系統(tǒng)具有定點(diǎn)釋藥的顯著優(yōu)勢(shì)。在顯著增加藥物在腦膠質(zhì)瘤部位蓄積的基礎(chǔ)上，給予高強(qiáng)度聚焦超聲(hifu)輻照，可以使得藥物在腦膠質(zhì)瘤部位瞬時(shí)充分釋放，從而進(jìn)一步提高腦膠質(zhì)瘤的化療效果，同時(shí)也從另一方面有效降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用。而沒有定點(diǎn)控釋的普通遞藥系統(tǒng)在腫瘤部位的釋藥往往不充分，化療效果并不理想，普通遞藥系統(tǒng)一般通過提高藥物的長循環(huán)能力來提高化療效果，但這往往會(huì)增加藥物對(duì)正常組織毒副作用。

4)本發(fā)明遞藥系統(tǒng)首次將藥物的靶向遞送與hifu誘導(dǎo)的定點(diǎn)釋藥有效地結(jié)合在一起并用于腦膠質(zhì)瘤的治療。本發(fā)明遞藥系統(tǒng)中給予的hifu輻照，其產(chǎn)生的熱效應(yīng)和空穴效應(yīng)本身也可以對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞起到誘導(dǎo)凋亡的作用，可以協(xié)同藥物的化療作用進(jìn)一步提高腦膠質(zhì)瘤的治療效果。相比單一的靶向遞送或hifu熱療，該遞藥系統(tǒng)取得了極佳的治療效果。

5)本發(fā)明遞藥系統(tǒng)通過藥物的靶向遞送以及hifu控制的定點(diǎn)釋藥這兩方面來減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。相比單一的靶向遞送或定點(diǎn)控釋，該遞藥系統(tǒng)可以顯著降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明遞藥系統(tǒng)的制備及釋藥流程圖；

圖2為本發(fā)明中不同納米粒np，np-d/p，anp和anp-d/p的粒徑對(duì)比圖；

圖3為本發(fā)明中不同納米粒np，np-d/p，anp和anp-d/p的表面電勢(shì)對(duì)比圖；

圖4為本發(fā)明納米粒anp-d/p穩(wěn)定性測(cè)定；

圖5為本發(fā)明納米粒anp-d/p在有無hifu輻照條件下的表面形態(tài)對(duì)比圖；

圖6為本發(fā)明納米粒anp-d/p在不同hifu輻照條件下的粒徑變化對(duì)比圖；

圖7為本發(fā)明納米粒anp-d/p在不同hifu輻照條件下的表面電勢(shì)變化對(duì)比圖；

圖8為有無hifu輻照對(duì)本發(fā)明納米粒anp-d/p藥物釋放的影響；

圖9為u87mg細(xì)胞對(duì)本發(fā)明中不同納米粒的攝取---共聚焦顯微鏡熒光定性對(duì)比圖；

圖10為u87mg細(xì)胞對(duì)本發(fā)明中不同納米粒的攝取---流式細(xì)胞熒光定性對(duì)比圖；

圖11為u87mg細(xì)胞對(duì)本發(fā)明中不同納米粒的攝取---流式細(xì)胞熒光定量對(duì)比圖；

圖12為本發(fā)明中不同納米粒的跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)比圖；

圖13為本發(fā)明中不同納米粒的跨血腦屏障滲透速率對(duì)比圖；

圖14為本發(fā)明中不同納米粒的體內(nèi)靶向性---荷瘤小鼠體內(nèi)熒光成像對(duì)比圖；

圖15為本發(fā)明中不同納米粒的體內(nèi)靶向性---荷瘤小鼠腦部離體熒光成像對(duì)比圖；

圖16為本發(fā)明中不同納米粒的體內(nèi)靶向性---荷瘤小鼠腦部熒光定量對(duì)比圖；

圖17為本發(fā)明中不同治療組荷瘤小鼠的生存曲線對(duì)比圖；

圖18為本發(fā)明中不同治療組荷瘤小鼠的腦膠質(zhì)瘤切片h&e染色對(duì)比圖；

圖19為本發(fā)明中不同治療組荷瘤小鼠的腦膠質(zhì)瘤切片tunel染色對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖及具體實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

納米粒np的制備：

1)納米粒np采用改良的納米沉淀法制備，準(zhǔn)確稱量末端羧基修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物plga-cooh(分子量50000,16mg)，二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇dspe-peg(分子量2000,3.6mg,1.8μmol)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺dspe-peg-mal(分子量2000,0.4mg,0.1μmol)，溶于1ml的丙酮并充分混勻。再將該溶有高分子聚合物的丙酮溶液快速注入至2ml的tris-hcl(10mm,ph8.0)溶液中，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，即得到tris-hcl分散的納米粒np溶液。

2)將步驟1)所得的溶液加入4ml超濾管(截留分子量30000)，2000g離心10min后，加入去離子水重懸至4ml，重復(fù)此步驟3次，即得到去離子水分散的納米粒np溶液。

實(shí)施例2

angiopep-2修飾的納米粒anp的制備：

1)向?qū)嵤├?所得的納米粒np溶液中逐滴加入100μl的angiopep-2短肽水溶液(1mg/l)，25℃、350rpm磁力攪拌2h，即得到angiopep-2短肽修飾的納米粒anp溶液。

2)將步驟2)所得的納米粒anp溶液加入4ml超濾管(截留分子量30000)，2000g離心10min后，加入去離子水重懸至4ml，重復(fù)此步驟3次，除去未結(jié)合的angiopep-2短肽。

實(shí)施例3

angiopep-2修飾的載阿霉素dox、阿霉素/全氟辛烷(dox/pfob)、熒光素dir、熒光素did的納米粒anp-d、anp-d/p、anp-dir、anp-did的制備：

1)準(zhǔn)確稱量末端羧基修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物plga-cooh(分子量50000,16mg)，二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇dspe-peg(分子量2000,3.6mg,1.8μmol)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺dspe-peg-mal(分子量2000,0.4mg,0.1μmol)，溶于1ml的丙酮并充分混勻后，再加入60μl阿霉素dox甲醇溶液(6.66mg/ml)，或60μl阿霉素dox甲醇溶液(6.66mg/ml)與10μl全氟辛烷pfob(19.23mg/ml)的混合溶液，或2μl熒光素dir溶液(1mg/ml)，或2μl熒光素did溶液(1mg/ml)。接著再將該高分子聚合物、藥物、發(fā)泡劑、熒光素的混合溶液快速注入至2ml的tris-hcl(10mm,ph8.0)溶液中，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即可得到tris-hcl分散的載阿霉素dox、阿霉素/全氟辛烷(dox/pfob)、熒光素dir、熒光素did的納米粒np-d、np-d/p、np-dir、np-did溶液。

2)向步驟1)所得的溶液中分別加入4ml超濾管(截留分子量30000)，2000g離心10min后，加入去離子水重懸至4ml，重復(fù)此步驟3次，即可得到去離子水分散的載阿霉素dox、阿霉素/全氟辛烷(dox/pfob)、熒光素dir、熒光素did的納米粒np-d、np-d/p、np-dir、np-did溶液。

3)向步驟2)所得的溶液中分別逐滴加入100μl的angiopep-2短肽水溶液(1mg/l)，25℃、350rpm磁力攪拌2h，即可得到angiopep-2短肽修飾的載阿霉素dox、阿霉素/全氟辛烷(dox/pfob)、熒光素dir、熒光素did的納米粒anp-d、anp-d/p、anp-dir、anp-did溶液。

4)將步驟3)所得的溶液分別加入4ml超濾管(截留分子量30000)，2000g離心10min后，加入去離子水重懸至4ml，重復(fù)此步驟3次，除去未結(jié)合的angiopep-2短肽，即可得到純化后的納米粒anp-d、anp-d/p、anp-dir、anp-did溶液。

如圖1所示，①為載阿霉素/全氟辛烷的納米粒np-d/p；②為angiopep-2修飾的載阿霉素/全氟辛烷的納米粒anp-d/p。③為在hifu輻照下的angiopep-2修飾的載阿霉素/全氟辛烷的納米粒anp-d/p。圖中①→②代表本發(fā)明遞藥系統(tǒng)——納米粒anp-d/p的制備過程。

實(shí)施例4

1)納米粒anp-d/p中dox包封率的測(cè)定：實(shí)施例3所得的anp-d/p溶液，50000g超速離心1h后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清中的阿霉素dox含量。anp-d/p中dox的包封率根據(jù)以下公式算得：本實(shí)驗(yàn)anp-d/p中dox的包封率為91％。

2)納米粒anp-d/p中dox載藥量的測(cè)定：實(shí)施例3所得的anp-d/p溶液，50000g超速離心1h后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清中的阿霉素dox含量。anp-d/p中dox的載藥量根據(jù)以下公式算得：本實(shí)驗(yàn)anp-d/p中dox的載藥量為1.8％。

3)納米粒anp-d/p中angiopep-2接枝率的測(cè)定：將實(shí)施例3中步驟3)4ml超濾管收集的未結(jié)合的angiopep-2短肽，用高效液相法(hplc)測(cè)定其含量。其中流動(dòng)相a為含0.1％三氟乙酸的去離子水溶液，流動(dòng)相b為含0.09％三氟乙酸的乙腈溶液。angiopep-2短肽的接枝率根據(jù)以下公式算得：本實(shí)驗(yàn)中angiopep-2的接枝率為89.0％。

實(shí)施例5

納米粒的粒徑、電位測(cè)定：

分別制備納米粒np，np-d/p，anp和anp-d/p溶液并稀釋至1mg/ml，震蕩混勻后，用馬爾文激光粒度測(cè)定儀測(cè)定其粒徑、粒徑分布以及表面電勢(shì)。如圖2所示，a、b、c、d分別代表np，anp，np-d/p和anp-d/p，其粒徑大小分別為33nm，39nm，36nm和41nm，且測(cè)得np，anp，np-d/p和anp-d/p的粒徑分布pdi分別為0.166，0.187，0.181和0.161。由圖2可知，納米粒載藥物及發(fā)泡劑后、連接angiopep-2后，其粒徑均有增加，盡管如此，anp-d/p的粒徑也僅為41nm，相比較常見的100nm左右的納米粒，該納米粒更容易通過血腦屏障，更適合腦腫瘤的遞藥。另外，各種納米粒的粒徑分布均在0.1～0.2之間，說明該方法制備的納米粒大小非常均一。如圖3所示，a、b、c、d分別代表np，anp，np-d/p和anp-d/p，其的表面電勢(shì)分別為-48mv，-20mv，-49mv和-20.7mv。由圖3可知，表面連接angiopep-2后納米粒的表面電勢(shì)顯著升高，較為中性的電勢(shì)具有更高的穩(wěn)定性也更有利于腫瘤細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取。

實(shí)施例6

納米粒anp-d/p的穩(wěn)定性測(cè)定：

將制備的納米粒anp-d/p溶液并稀釋至1mg/ml，按照實(shí)施例5的方法分別監(jiān)測(cè)其一周內(nèi)的粒徑及表面電勢(shì)變化情況。如圖4所示，d-1和d-2分別代表anp-d/p一周內(nèi)的粒徑變化和表面電勢(shì)變化，由圖4可看出anp-d/p在一周內(nèi)粒徑及表面電勢(shì)幾乎沒有太大變化，說明anp-d/p具有良好的穩(wěn)定性。

實(shí)施例7

納米粒anp-d/p在有無hifu輻照條件下的表面形態(tài)鑒定：

將制備的納米粒anp-d/p溶液并稀釋至0.1mg/ml并分成2份，一份為無hifu輻照組，另一份為接受8.5w，5min的hifu輻照組，之后進(jìn)行2％磷鎢酸染色，最后用透射電鏡觀察兩組納米粒的表面形態(tài)。如圖5所示，d組代表無hifu輻照下的anp-d/p納米粒；h組代表接受hifu輻照后的anp-d/p納米粒；圖中標(biāo)尺為50nm。由圖5可以看出，d組中的anp-d/p納米粒均勻且表面圓整，粒徑約為40nm；而h組中的anp-d/p納米粒在接受hifu輻照后粒徑顯著增大，結(jié)構(gòu)崩塌，崩解為兩個(gè)甚至多個(gè)小納米粒。

實(shí)施例8

納米粒anp-d/p在不同hifu輻照條件下的粒徑及表面電勢(shì)變化監(jiān)測(cè)：

將5mg/ml的納米粒anp-d/p樣品溶液平均分成5份，分別接受不同條件的hifu輻照。對(duì)照組不接受hifu輻照，其余4組分別接受8.5w，5min；8.5w，10min；10.5w，5min；10.5w，10min的hifu輻照。之后5組樣品震蕩混勻，并用馬爾文激光粒度測(cè)定儀測(cè)定其粒徑和表面電勢(shì)。如圖6所示，d、h-1、h-2、h-3、h-4分別代表對(duì)照組、(8.5w，5min)組、(8.5w，10min)組、(10.5w，5min)組和(10.5w，10min)組，其粒徑大小分別為39nm、69nm、78nm、104nm和171nm。由圖6可以看出，經(jīng)過hifu輻照后的納米粒anp-d/p粒徑顯著變大，且粒徑大小分別與hifu輻照的功率(w)和時(shí)間(min)成正比。如圖7所示，d、h-1、h-2、h-3、h-4分別代表對(duì)照組、(8.5w，5min)組、(8.5w，10min)組、(10.5w，5min)組和(10.5w，10min)組，其表面電勢(shì)分別為-20.0mv、-48.0mv、-48.6mv、-50.0mv和-50.7mv。由圖7可以看出，經(jīng)過hifu輻照后的納米粒anp-d/p表面電勢(shì)顯著變小，這是由納米粒結(jié)構(gòu)崩塌后更多帶負(fù)電的羧基裸露在納米粒表面所致。綜合圖6與圖7可以看出，hifu輻照有助于納米粒anp-d/p的結(jié)構(gòu)崩解。

實(shí)施例9

有無hifu輻照對(duì)納米粒anp-d/p藥物釋放的影響：

將新制備好的5mg/ml的納米粒anp-d/p樣品溶液平均分成2份，一份用于監(jiān)測(cè)無hifu輻照條件下納米粒anp-d/p的藥物釋放情況，另一份于60min時(shí)接受10.5w，10min的hifu輻照。兩組分別于0min、60min、hifu輻照后的2min、5min、10min用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液中阿霉素dox的含量。如圖8所示，d和h-4分別代表對(duì)照組和(10.5w，10min)組，由圖8可以看出，在無hifu輻照情況下即0min～59min內(nèi)，納米粒anp-d/p藥物釋放緩慢，但h-4組在接受hifu輻照后2min、5min、10min內(nèi)納米粒anp-d/p的藥物釋放分別達(dá)到47％、65％、76％，而未接受hifu輻照的d組70min內(nèi)的藥物釋放僅為2.5％。顯而易見，hifu輻照極大的加速了納米粒anp-d/p藥物釋放。如圖1中③所示，即為本發(fā)明遞藥系統(tǒng)——納米粒anp-d/p的釋藥機(jī)制，在hifu輻照下，發(fā)泡劑pfob瞬時(shí)汽化使得納米粒anp-d/p崩解，加速藥物dox的釋放。

實(shí)施例10

納米粒anp-d/p對(duì)腦膠質(zhì)瘤u87細(xì)胞的體外靶向性實(shí)驗(yàn)(共聚焦定性實(shí)驗(yàn))：

將腦膠質(zhì)瘤u87mg細(xì)胞以2×10⁴cell/ml的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5％co2、飽和濕度條件下用完全培養(yǎng)基(dmem+10％fbs+1％s/p)培養(yǎng)細(xì)胞24h，再向每孔分別加入600μml含藥物lip-d、np-d、anp-d、anp-d/p或anp-d/p+a(dox含量為50μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0.5h，pbs清洗細(xì)胞2次除去多余藥物后，用4％多聚甲醛固定15min，dapi染色5min。最后通過激光共聚焦顯微鏡觀察u87mg細(xì)胞對(duì)不同藥物的攝取情況。其中，anp-d/p+a為藥物anp-d/p與200μg的angiopep-2的混合物。如圖9所示，c代表藍(lán)色熒光(dapi)通道，r代表紅色熒光(dox)通道，m代表藍(lán)色熒光(dapi)通道與紅色熒光(dox)通道的疊加；u代表u87mg細(xì)胞空白對(duì)照組，l代表lip-d給藥組，a代表np-d給藥組，b代表anp-d給藥組，d代表anp-d/p給藥組，e代表anp-d/p+a給藥組；圖中標(biāo)尺代表100μm。由圖9可看出，b組和d組熒光強(qiáng)度明顯高于a組和e組，且遠(yuǎn)高于l組和u組，表明相比np-d，連接angiopep-2后的anp-d與anp-d/p對(duì)u87mg細(xì)胞具有顯著增強(qiáng)的靶向性；而e組與a組熒光強(qiáng)度并無顯著性差異，也同時(shí)說明anp-d與anp-d/p是通過angiopep-2與u87mg表面高表達(dá)的lrp受體結(jié)合后在胞吞作用下進(jìn)入u87mg細(xì)胞內(nèi)，而不是非特異性攝取。該實(shí)驗(yàn)也同時(shí)證明了相比臨床用的lip-d，anp-d/p對(duì)腦膠質(zhì)瘤u87mg細(xì)胞具有顯著增強(qiáng)的體外靶向性。

實(shí)施例11

納米粒anp-d/p對(duì)腦膠質(zhì)瘤u87細(xì)胞的體外靶向性實(shí)驗(yàn)(流式細(xì)胞儀定量實(shí)驗(yàn))：

將腦膠質(zhì)瘤u87mg細(xì)胞以2×10⁴cell/ml的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5％co2、飽和濕度條件下用完全培養(yǎng)基(dmem+10％fbs+1％s/p)培養(yǎng)細(xì)胞24h，再向每孔分別加入600μml含藥物lip-d、np-d、anp-d、anp-d/p或anp-d/p+a(dox含量為50μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0.5h，pbs洗去多余藥物，用胰蛋白酶-edta(0.25％)消化細(xì)胞，1000rpm離心4min后用pbs重懸細(xì)胞，最后由流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞攝取情況。其中，anp-d/p+a為藥物anp-d/p與200μg的angiopep-2的混合物。如圖10為u87mg細(xì)胞對(duì)不同藥物攝取的流式結(jié)果，圖11為圖10中的熒光定量結(jié)果。如圖10、11所示，u代表u87mg細(xì)胞空白對(duì)照組，l代表lip-d給藥組，a代表np-d給藥組，b代表anp-d給藥組，d代表anp-d/p給藥組，e代表anp-d/p+a給藥組。由圖10、11可以看出，b組和d組熒光強(qiáng)度均遠(yuǎn)高于u、l組，且b組和d組的熒光強(qiáng)度分別是a組的3.6和3.8倍，而e組與a組熒光強(qiáng)度并無顯著性差異，這與圖9中細(xì)胞攝取的共聚焦定性結(jié)果一致，再次證明相比np-d，angiopep-2修飾后的anp-d和anp-d/p顯著增強(qiáng)了對(duì)u87mg細(xì)胞的靶向性。其中，圖11中***代表配對(duì)t檢驗(yàn)p＜0.001，****代表配對(duì)t檢驗(yàn)p＜0.0001，表明兩組具有顯著性差異。

實(shí)施例12

納米粒anp-d/p跨血腦屏障bbb轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)：

將bcec細(xì)胞以5×10⁴cell/cm²的密度接種于孔徑為3μm的transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)，在相應(yīng)的24孔板中每孔加入1ml完全培養(yǎng)基(dmem+10％fbs+1％s/p)，于37℃、5％co²、飽和濕度下培養(yǎng)細(xì)胞并隔天換液，用millicellers電阻儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞融合情況，當(dāng)電阻值teer超過200ω時(shí)bcec構(gòu)建的bbb單層細(xì)胞模型可用于下一步實(shí)驗(yàn)。向transwell每個(gè)小室中加入400μl濃度為2mg/ml的載did的np-d/p或anp-d/p藥物，于1、2、3、4、6小時(shí)分別從每個(gè)小室下方對(duì)應(yīng)的孔板中取出100μl樣品并補(bǔ)充等體積新鮮完全培養(yǎng)基，取出樣品中的納米的粒濃度通過酶標(biāo)儀進(jìn)行定量。其中did的激發(fā)波長/發(fā)射波長分別為644/663。最后計(jì)算兩種藥物的透bbb的轉(zhuǎn)運(yùn)量和滲透速率，其中滲透速率根據(jù)以下公式算得：如圖12、13所示，c和d分別代表np-d/p和anp-d/p組。由圖12可以看出，d組藥物透過bbb的量顯著高于c組且藥物轉(zhuǎn)運(yùn)量與時(shí)間成正比，表明angiopep-2修飾后的anp-d/p相比np-d/p具有顯著增強(qiáng)的bbb靶向性，故透過bbb的藥物量顯著提高。由圖13可以看出，d組藥物bbb的滲透速率量顯著高于c組，也說明angiopep-2修飾后的anp-d/p相比np-d/p具有顯著更強(qiáng)的bbb穿透能力。其中，圖13中****代表配對(duì)t檢驗(yàn)p＜0.0001，表明兩組具有顯著性差異。綜合圖12、13可以證明angiopep-2的修飾可以顯著提高納米粒anp-d/p對(duì)bbb的體外靶向能力。

實(shí)施例13

納米粒anp-d/p的體內(nèi)靶向性---荷瘤小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)：

u87mg原位腦膠質(zhì)瘤荷瘤鼠，接種20天后，隨機(jī)分成3組，每組3只，分別尾靜脈注射200μl載dir的藥物np-d、anp-d或anp-d/p(dir為2μg)。分別于6h、12h、24h、48h由小動(dòng)物活體成像儀測(cè)定小鼠體內(nèi)的dir熒光信號(hào)。48h后將每組小鼠pbs心臟灌流，取出腦組織用于腦部離體熒光成像，之后勻漿處理并用酶標(biāo)儀測(cè)定其dir含量。如圖14、15、16所示，a、b、d分別代表np-d、anp-d和anp-d/p組。由圖14中6h、12h、24h、48h可以看出四個(gè)時(shí)間段b、d組小鼠腦部熒光信號(hào)均高于a組；圖15為圖14各組48h時(shí)的離體腦組織，由圖15可以看出b、d組腦膠質(zhì)瘤部位的熒光強(qiáng)度明顯高于a組；圖16為圖15中腦組織的熒光定量結(jié)果，定量結(jié)果顯示b、d組的熒光強(qiáng)度分別是a組的9.1和13.4倍。其中，圖16中***代表配對(duì)t檢驗(yàn)p＜0.001，表明兩組具有顯著性差異。綜合圖14、15、16可以看出相比a組，b、d組藥物具有良好的體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤靶向性，即angiopep-2的修飾顯著提高了anp-d和anp-d/p的體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤靶向性。

實(shí)施例14

納米粒anp-d/p的體內(nèi)藥效學(xué)---平均生存期監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)：

u87mg原位腦膠質(zhì)瘤荷瘤鼠，隨機(jī)分成6組(saline、lip-d、np-d、anp-d、anp-d/p、anp-d/ph+)，每組6只，分別于細(xì)胞接種后的第2、5、8、11天，分別尾靜脈注射100μl的saline、lip-d、np-d、anp-d、anp-d/p或anp-d/p(dox藥物劑量：每公斤動(dòng)物體重給予2mg的dox)。最后一次給藥24h后對(duì)anp-d/ph+組荷瘤鼠給予10.5w、60s(間隔3s)的hifu輻照治療。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物死亡情況并繪制kaplan-meier生存曲線。如圖17所示，u、l、a、b、d、h分別代表saline對(duì)照組以及l(fā)ip-d、np-d、anp-d、anp-d/p、anp-d/ph+治療組。由圖17可知，u、l、a、b、d、h各組平均生存時(shí)間為17、21.5、23、35、37.5、56天；可以看出，相比l、a治療組，b、d兩治療組明顯延長了荷瘤鼠的生存期，表明angiopep-2的修飾顯著提高了藥物對(duì)腦膠質(zhì)瘤的靶向性，進(jìn)而提高了腦膠質(zhì)瘤的治療效果；而h組在b、d兩組基礎(chǔ)上又進(jìn)一步地顯著延長了荷瘤鼠的生存期，表明h組在提高藥物靶向性的基礎(chǔ)上，通過hifu誘導(dǎo)藥物的加速釋放使得腦膠質(zhì)瘤的治療效果有了進(jìn)一步地顯著提高。

實(shí)施例15

納米粒anp-d/p的體內(nèi)藥效學(xué)---腦膠質(zhì)瘤病理切片實(shí)驗(yàn)：

u87mg原位腦膠質(zhì)瘤荷瘤鼠，隨機(jī)分成6組(saline、lip-d、np-d、anp-d、anp-d/p、anp-d/ph+)，每組6只，分別于細(xì)胞接種后第2、5、8、11天，尾靜脈給藥100μl(dox藥物劑量：每公斤動(dòng)物體重給予2mg的dox)。最后一次給藥24h后對(duì)anp-d/ph+組荷瘤鼠給予10.5w、60s(間隔3s)的hifu輻照治療。

細(xì)胞接種后第15天，對(duì)荷瘤鼠進(jìn)行pbs心臟灌流，取出腦組織并用4％多聚甲醛固定48h，每組中3只為一組，分別做石蠟、冰凍切片，分別用于h&e、tunel染色分析。如圖18為各組腦膠質(zhì)瘤石蠟切片的h&e染色結(jié)果，圖19為腦膠質(zhì)瘤冰凍切片的tunel染色結(jié)果，圖18、19中的u、l、a、b、d、h分別代表saline對(duì)照組以及l(fā)ip-d、np-d、anp-d、anp-d/p、anp-d/ph+治療組。圖19中的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為細(xì)胞核破碎，而圖19中虛線及箭頭指向區(qū)域?yàn)槟X膠質(zhì)瘤組織，熒光點(diǎn)為凋亡細(xì)胞陽性信號(hào)。由圖18、19可以看出，對(duì)照組中腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞未出現(xiàn)凋亡，而l、a、b、d治療組中均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡。其中，b、d治療組中腫瘤細(xì)胞凋亡比例顯著高于l、a治療組，表明angiopep-2的修飾提高了anp-d及anp-d/p的體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤靶向性，進(jìn)而提高了對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制效果。而h組中的契型空白原為腦膠質(zhì)瘤組織，在藥物anp-d/p治療的基礎(chǔ)上給予hifu輻照，誘導(dǎo)anp-d/p中藥物dox瞬時(shí)充分釋放，加之hifu輻照本身具有的空穴效應(yīng)及熱效應(yīng)，使得原有的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞基本全部凋亡或被消融，呈現(xiàn)出其余治療組所無法達(dá)到的極佳的治療效果。綜合圖18、19可得出相較np-d、lip-d，anp-d和anp-d/p能更有效地誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，而在此基礎(chǔ)上的hifu輻照治療能進(jìn)一步極大地提高腦膠質(zhì)瘤的治療效果。