本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靈仙新苷在制備治療或預(yù)防炎性腸病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

炎性腸病簡(jiǎn)稱IBD，是一種特殊的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)。臨床上，炎性腸病患者表現(xiàn)為反復(fù)的腹痛、腹瀉、粘液血便，甚至出現(xiàn)各種全身并發(fā)癥如視物模糊、關(guān)節(jié)疼痛、皮疹等。本病經(jīng)治療可好轉(zhuǎn)，也可自行緩解。但多數(shù)患者反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，其中相當(dāng)部分患者因出現(xiàn)并發(fā)癥而需要手術(shù)治療。

靈仙新苷是一種集抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用于一體的安全、高效、穩(wěn)定的新型天然藥物，具有成藥性好和產(chǎn)業(yè)化前景廣闊的特點(diǎn)；并且靈仙新苷還具有顯著的調(diào)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗心肌缺血作用，抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用。但是其口服生物利用度低，而且口服后在腸道黏膜分布較多，目前其抗炎性腸病的作用還未開(kāi)發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供靈仙新苷在制備治療或預(yù)防炎性腸病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的：

以靈仙新苷為藥物活性成分在制備治療或預(yù)防炎性腸病的藥物中的應(yīng)用。

靈仙新苷添加藥學(xué)上可接受的輔料制備成適合臨床使用的劑型。所述的劑型為口服制劑或注射劑，優(yōu)選所述的輔料為崩解劑、稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)滑劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、填充劑、潤(rùn)濕劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗黏合劑、整合劑、滲透促進(jìn)劑、等滲調(diào)節(jié)劑、pH值調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增塑劑、表面活性劑、發(fā)泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保濕劑、吸收劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑、阻滯劑、抗氧劑、抑菌劑。

在制備治療或預(yù)防炎性腸病的藥物時(shí)，靈仙新苷可以作為唯一活性成分或者與其他有效成分組合使用。

本發(fā)明所述的靈仙新苷可以通過(guò)市售獲得或通過(guò)以下方法制備得到：

取威靈仙藥材(東北鐵線蓮)，用藥材10倍重量水加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并水提液，將水提液室溫冷卻、過(guò)濾后上預(yù)先處理好的大孔樹(shù)脂D101(流速2BV/h)，依次用水和20％乙醇洗脫至流出液澄清后，再用50％乙醇洗脫至流出液無(wú)色，收集50％乙醇洗脫液，濃縮，微波干燥，得威靈仙總皂苷干粉，將該總皂苷干粉加入其50倍重量無(wú)水乙醇加熱回流2小時(shí)后趁熱過(guò)濾，濾液室溫放置過(guò)夜，濾取沉淀，干燥后得粗品，粗品用20％乙醇溶解后上預(yù)先處理好的ODS柱(流速1BV/h)，依次用30％，40％，90％乙醇分別洗脫至無(wú)色，收集40％乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥后，即得淡黃色靈仙新苷，含量：＞90％。

本發(fā)明通過(guò)靈仙新苷對(duì)炎癥性腸炎大鼠克羅恩病(Crohn’s disease，CD)的防治實(shí)驗(yàn)，采用SD大鼠TNBS/乙醇法構(gòu)建模型，評(píng)價(jià)了靈仙新苷32、16、8mg/kg抗大鼠炎癥性結(jié)腸炎的作用。結(jié)果表明，靈仙新苷具有顯著抗大鼠炎癥性腸炎克羅恩病的作用，可利用此開(kāi)發(fā)出一種抗炎性腸病(包括免疫炎性腸病和其他原因引起的炎性腸病)的療效好而安全性高的一類中藥新藥。

附圖說(shuō)明

圖1為大鼠炎癥性腸病克羅恩模型組織病理學(xué)圖。

圖中，C空白對(duì)照組，M模型對(duì)照組，AC美沙拉嗪組，AR-H靈仙新苷高劑量組，AR-M靈仙新苷中劑量組，AR-L靈仙新苷低劑量組，×400

圖2為大鼠炎癥性腸病克羅恩模型腸組織TNF-α表達(dá)(免疫組化)圖。

圖中，C空白對(duì)照組，M模型對(duì)照組，AC美沙拉嗪組，AR-H靈仙新苷高劑量組，AR-M靈仙新苷中劑量組，AR-L靈仙新苷低劑量組，×400

圖3為大鼠炎癥性腸病克羅恩模型腸組織TLR4表達(dá)(免疫組化)圖。

圖中，C空白對(duì)照組，M模型對(duì)照組，AC美沙拉嗪組，AR-H靈仙新苷高劑量組，AR-M靈仙新苷中劑量組，AR-L靈仙新苷低劑量組，×400

圖4為大鼠炎癥性腸病克羅恩模型腸組織NF-κBp65表達(dá)(免疫組化)圖。

圖中，C空白對(duì)照組，M模型對(duì)照組，AC美沙拉嗪組，AR-H靈仙新苷高劑量組，AR-M靈仙新苷中劑量組，AR-L靈仙新苷低劑量組，×400

圖5為大鼠炎癥性腸病克羅恩模型腸組織TLR4、NF-κBp65表達(dá)(Western blot)圖。

圖中，C空白對(duì)照組，M模型對(duì)照組，AC美沙拉嗪組，AR-H靈仙新苷高劑量組，AR-M靈仙新苷中劑量組，AR-L靈仙新苷低劑量組。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不限于實(shí)施例所述的范圍。

實(shí)施例1

通過(guò)藥效試驗(yàn)證明靈仙新苷對(duì)大鼠炎癥性腸病克羅恩模型的防治作用：

1.1試驗(yàn)方法：

(1)動(dòng)物分組：SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，按體重隨機(jī)均分為6組，分別設(shè)為正常對(duì)照組(Normal control group，NC組)、克羅恩病模型組(Model group，MC組)、靈仙新苷低劑量組(Low dose AR group，AR-L組，16mg·kg^-1)、靈仙新苷中劑量組(Moddel dose AR group，AR-M組，32mg·kg^-1)、靈仙新苷高劑量組(High dose AR group，AR-H組，64mg·kg^-1)和陽(yáng)性藥組(美沙拉嗪，5-Aminosalicylic acid group，AC組，500mg·kg^-1)。

(2)模型建立：參照國(guó)際公認(rèn)的Morris方法，采用TNBS/乙醇法構(gòu)建模型，大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模前禁食不禁水24小時(shí)，稱重，腹腔注射10％水合氯醛1ml/kg，麻醉后，倒懸位，將大鼠灌胃針自肛門緩慢插入直腸約8cm，正常對(duì)照組灌入同體積生理鹽水，其他5組大鼠灌入5％TNBS0.4ml+50％乙醇0.2ml(2：1＝v：v)混合溶液用lml注射器緩慢把藥液推入腸內(nèi)[2]，倒懸位持續(xù)30s后，取頭低尾高位20-30度，放置觀察籠中，清醒后放回飼養(yǎng)籠。

(3)給藥方法：造模后24h開(kāi)始灌胃，正常組與模型組給予0.9％的氯化鈉溶液2mL/只灌胃；AC組按100mg/kg灌胃；AR-H組、AR-M組、AR-L組分別給予32mg、16mg和8mg/kg.，給藥容積為0.5ml/100g，每天灌胃一次，連續(xù)給藥28d。除空白組外，其余5組每隔6d重復(fù)造模一次，共造模4次。

實(shí)驗(yàn)中采用的靈仙新苷(Clematichinenoside，AR)為淡黃色粉末，含量＞90％。

臨用前用蒸餾水溶解配制成所需濃度的澄清溶液。

美沙拉嗪腸溶包衣片為葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：0.25g/片，臨用前用0.5％CMC-Na研磨配制成濃度為50mg/ml的均勻混懸液。

(4)指標(biāo)測(cè)定與評(píng)價(jià)：

A.標(biāo)本采集及結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分

頸總動(dòng)脈取血處死大鼠，游離結(jié)腸組織，沿腸系膜縱軸剖開(kāi)，冰生理鹽水清洗，肉眼觀察黏膜損傷情況，并行結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon marcroscopic damage index，CMDI)標(biāo)準(zhǔn)如下：

0分：結(jié)腸黏膜無(wú)損傷

1分：局部結(jié)腸黏膜充血水腫但無(wú)糜爛、潰瘍形成

2分：有潰瘍形成但無(wú)顯著炎癥發(fā)生

3分：在一個(gè)部位上有線性潰瘍形成并且有炎癥

4分：在兩個(gè)或以上的部位有潰瘍形成和/或炎癥

5分：沿結(jié)腸長(zhǎng)軸有兩個(gè)或以上部位有潰瘍形成和炎癥，長(zhǎng)度超過(guò)1cm

6～8分：潰瘍形成超過(guò)2cm

B.病理組織切片HE染色及觀察

固定標(biāo)本：選取大鼠結(jié)腸組織病變最明顯的位置約2cm，放在10％中性甲醛中固定，這里甲醛容量取為組織標(biāo)本的2-3倍即可。

切片：在10％中性甲醛中固定24h后取出大鼠組織，逐級(jí)用酒精脫水，然后用二甲苯透明、浸蠟，再石蠟包埋，做常規(guī)切片4μm，45℃水浴后撈片，在80℃烤箱烤片約40min。

染色：把切片放入二甲苯中浸泡，時(shí)間為5-10min/次，共泡3次；然后用無(wú)水乙醇浸泡，1min/次共2次，接著用95％乙醇浸泡，1-2min/次，2次，再用80％乙醇浸泡約1min，最后自來(lái)水漂洗4-5次；使用蘇木素染色(染細(xì)胞核)5-6min，然后自來(lái)水漂洗4-5次；再浸于1％鹽酸，染色5sec，用自來(lái)水沖洗返藍(lán)；用1％的伊紅染色(染細(xì)胞漿)30sec；用95％的乙醇脫水2次，1-2min/次；用無(wú)水乙醇脫水，2次，1-2min；用二甲苯脫水透明3次，2min/次；最終用中性樹(shù)膠封片、鏡檢。

C.組織學(xué)損傷指數(shù)(tissues damage index，TDI)

組織切片HE染色后，在顯微鏡下觀察潰瘍、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等變化。并采用組織學(xué)損傷指數(shù)(tissues damage index，TDI)^[3]進(jìn)行評(píng)分。標(biāo)準(zhǔn)如下：

0分：沒(méi)有損傷

1分：黏膜和/或黏膜下輕度炎癥浸潤(rùn)和充血水腫，黏膜輕度糜爛，伴隨有毛細(xì)血管增生，而黏膜肌層保持完整

2分：在1分的基礎(chǔ)上，范圍達(dá)標(biāo)本的50％以上

3分：顯著地炎癥浸潤(rùn)和充血水腫，有潰瘍形成并延伸到黏膜固有層，較少的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜固有層，肌層無(wú)壞死

4分：在3分的基礎(chǔ)上，范圍達(dá)標(biāo)本的50％及以上

5分：潰瘍廣泛形成，伴有黏膜糜爛，有數(shù)量眾多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞壞死及潰瘍面可達(dá)到黏膜固有肌層

6分：在5分的基礎(chǔ)上，范圍達(dá)標(biāo)本的50％及以上

D.脾臟指數(shù)測(cè)定：

大鼠處死后取出脾臟，使用電子天平稱重，以脾臟的重量(g)與大鼠每100g體重之比作為脾臟指數(shù)。

E.ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織中的IL-10和TNF-α含量

在酶標(biāo)板上包裹抗大鼠細(xì)胞因子(TNF-α和IL-10)的單抗；樣品和標(biāo)準(zhǔn)品里的大鼠細(xì)胞因子與單抗結(jié)合后，再加上生物素化過(guò)的抗大鼠細(xì)胞因子抗體，這樣就形成了免疫復(fù)合物連接在板上面；用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素會(huì)與生物素特異性結(jié)合，加入顯色劑則出現(xiàn)藍(lán)色，再加入終止液，顏色變黃，在450nm處測(cè)量吸光度值。因?yàn)榧?xì)胞因子濃度與吸光度值成正比關(guān)系，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終可以求出標(biāo)本中的大鼠結(jié)腸組織中的細(xì)胞因子的濃度。

F.免疫組化法檢測(cè)腸組織TLR4、TNF-α、NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TNF-α、NF-kBp65的表達(dá)。主要染色過(guò)程如下：

①.石蠟切片脫蠟水化，微波中檔抗原修復(fù)10min。自然冷卻，用PBS液(0.01mol/L

PH7.4)沖洗3次×2min。

②正常山羊血清封閉，室溫孵育10min。傾去血清，勿洗，滴加即用型一抗，37℃孵育1小時(shí)。

②PBS沖洗，2min×3次。

③滴加即用型快速免疫組化MaxVision^TM二抗，37℃或室溫孵育10-15min。

④PBS沖洗，2min×3次。

⑤滴加新鮮配制的顯色劑(DAB)3-5min，顯微鏡下觀察。

⑦自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。

⑧梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

G.Western blot法檢測(cè)腸組織TLR4、NF-kBp65蛋白表達(dá)

稱取100mg腸組織置于冰板上表面皿中剪成碎片，在破碎的組織中加入1ml預(yù)冷蛋白裂解液(RIPA：PMSF＝9：1)，用4℃玻璃勻漿器勻漿至95％細(xì)胞被破碎并靜置于冰浴下30min，將組織勻漿4℃18000rpm離心15min，取上清腸組織蛋白轉(zhuǎn)移至新的離心管中。各樣品取5μl進(jìn)行蛋白定量，其余樣本加入總體積1/5的loading buffer(5×)，100℃煮沸5min后放于-20℃冰箱中保存。

使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA protein Assay Kit)，按照50：1的比例將50體積BCA試劑A和BCA試劑B充分混合配制工作液；蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/孔加入200μl BCA工作液后再562nm下比色，記錄吸光值，測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測(cè)樣品稀釋至20μl，測(cè)定吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品實(shí)際濃度(單位：μg/μl)。

配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)，將配好的分離膠用移液槍加入電泳槽4.5ml并加水封液面。分離膠凝固后用濾紙將水吸干。加入配制的濃縮膠1.5ml。從左至右分別在電泳槽中加入Marker、NC組、MC組、AC組、AR-H組、AR-M組、AR-L組蛋白，兩側(cè)各加loading buffer壓邊。Marker上樣量2μl，其余各組按照測(cè)定的樣品蛋白含量保持上樣量一致。電泳分離時(shí)濃縮膠保持60V電壓20min左右，分離膠保持100V電壓60min左右至Marker跑開(kāi)即可終止。按照海綿、3張濾紙、PAGE膠、NC膜、3張濾紙、海綿制成膜/濾紙三明治將膠上蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)上，保持100mA電流電轉(zhuǎn)2h左右。轉(zhuǎn)膜結(jié)束配制脫脂奶粉封閉液(1g奶粉+20ml TBST)對(duì)膜進(jìn)行封閉，室溫下?lián)u床封閉1h。TBST洗滌干凈封閉液封，將膜加一抗并塑封于搖床上孵育室溫過(guò)夜。取出膜TBST緩沖液洗滌三次，每次10min，搖床震蕩。二抗孵育2h，同樣TBST緩沖液洗滌三次，每次10min，搖床震蕩。加入顯色劑放入凝膠圖像分析系統(tǒng)顯影^[5]。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2試驗(yàn)結(jié)果：

(1)結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分(CMDI)

結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分表明：與正常對(duì)照組比較，模型組腸壁增厚，腸管增粗，與外周組織粘連，部分大鼠可見(jiàn)腸梗阻表現(xiàn)，糜爛及潰瘍形成，具有顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組和AR各劑量組均有不同程度的改善，顯著性恢復(fù)腸管增粗與腸壁增厚，與外周組織粘連少，黏膜充血水腫減輕，糜爛及潰瘍形成不明顯(P<0.01，P<0.05)。

(2)病理組織檢查和組織學(xué)損傷指數(shù)評(píng)分(TDI)

光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰，其隱窩結(jié)構(gòu)完整，腺體未見(jiàn)破壞。模型組大鼠結(jié)腸組織中局部潰瘍形成，結(jié)腸黏膜上皮壞死脫落，并見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜及黏膜下層出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫，并伴有大量炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫，杯狀細(xì)胞被破壞且結(jié)構(gòu)紊亂，其中1只表現(xiàn)為多量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到黏膜固有層，局部見(jiàn)粘膜糜爛。與空白組比較，模型組大鼠組織學(xué)損傷指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；陽(yáng)性藥組、AR高劑量組大鼠局部見(jiàn)淺潰瘍形成，少量散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)固有腺周圍，固有腺結(jié)構(gòu)改善，充血水腫減輕，有增生的邊緣上皮細(xì)胞覆蓋潰瘍面，與模型組比較，陽(yáng)性藥組、AR高劑量組組織學(xué)損傷指數(shù)極顯著降低(P<0.01)；AR中劑量組大鼠腸組織中多量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到隱窩和黏膜固有層，肉芽組織纖維化改善，黏膜及黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，與模型組比較，AR中劑量組組織學(xué)損傷指數(shù)顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1：

表1靈仙新苷對(duì)大鼠炎癥性腸病克羅恩模型組織學(xué)損傷指數(shù)評(píng)分(TDI)與結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分(CMDI)(n＝8)

^**P<0.01，與空白對(duì)照組比較，^*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；^##P<0.01，與模型對(duì)照組比較，^#P<0.05，與模型對(duì)照組比較；^ΔΔP<0.01，與美沙拉嗪組比較，^ΔP<0.05，與美沙拉嗪組比較

(3)免疫組化法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織TLR4、TNF-α和NF-kBp65的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)

TNF-α蛋白表達(dá)定位于腸上皮細(xì)胞漿內(nèi)，空白對(duì)照組可見(jiàn)少量棕黃色染色，模型組胞漿內(nèi)大量棕黃色細(xì)胞染色，與空白組比較，模型組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)極顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、AR高、中劑量組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，并且AR高、中、低劑量組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)一定劑量依賴性；與陽(yáng)性藥比較，AR高劑量組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯差異。

TLR4蛋白表達(dá)定位在腸上皮細(xì)胞胞漿及少部分胞膜上，空白對(duì)照組可見(jiàn)顏色較淺的棕黃色染色，模型組胞漿內(nèi)可觀察到明顯且大量棕黃色染色，與空白組比較，陽(yáng)性藥組、AR高、中劑量組TLR4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，AR低劑量組TLR4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著降低(P<0.01)，并且AR高、中、低劑量組TLR4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)一定劑量依賴性；與陽(yáng)性藥比較，AR高劑量組TLR4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯差異。

NF-kBp65蛋白表達(dá)定位在腸上皮細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)，空白對(duì)照組可見(jiàn)少量棕黃色染色，模型組可見(jiàn)大量棕黃色細(xì)胞染色，與空白組比較，模型組NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)極顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、AR高、中劑量組NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，并且AR高、中、低劑量組NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)一定劑量依賴性；與陽(yáng)性藥比較，AR高劑量組NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)表2：

表2靈仙新苷對(duì)大鼠炎癥性腸病克羅恩模型腸組織TNF-α，TLR4及NF-κBp65表達(dá)(免疫組化)的影響(n＝8)

^**P<0.01，與空白對(duì)照組比較，^*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；^##P<0.01，與模型對(duì)照組比較，^#P<0.05，與模型對(duì)照組比較；^ΔΔP<0.01，與美沙拉嗪組比較，^ΔP<0.05，與美沙拉嗪組比較

(4)靈仙新苷對(duì)大鼠脾臟指數(shù)的影響：

與空白組大鼠比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)極顯著升高(p<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、AR高劑量組極顯著降低大鼠脾臟指(p<0.01)；與模型組比較，AR中、低劑量組顯著降低大鼠脾臟指數(shù)(p<0.05)；與陽(yáng)性藥比較，AR高、中劑量組無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表3：

表3靈仙新苷對(duì)大鼠炎癥性腸病克羅恩模型脾臟指數(shù)的影響(n＝8)

^**P<0.01，與空白對(duì)照組比較，^*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；^##P<0.01，與模型對(duì)照組比較，^#P<0.05，與模型對(duì)照組比較；^ΔΔP<0.01，與美沙拉嗪組比較，^ΔP<0.05，與美沙拉嗪組比較

(5)大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子表達(dá)

與正常對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠結(jié)腸組織TNF-a的含量顯著增高，差異有顯著性；與模型組大鼠進(jìn)行比較，5-ASA組大鼠結(jié)腸組織TNF-a的含量明顯降低；與模型組大鼠進(jìn)行比較，AR高、中劑量組大鼠結(jié)腸組織TNF-a的含量明顯降低；5-ASA組與AR高劑量組大鼠結(jié)腸組織TNF-a的含量進(jìn)行比較，無(wú)顯著性差異。與正常對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-10的含量顯著降低，差異有顯著性；與模型組大鼠進(jìn)行比較，5-ASA組大鼠結(jié)腸組織IL-10的含量明顯升高；與模型組大鼠進(jìn)行比較，AR高、中劑量組大鼠結(jié)腸組織IL-10的含量明顯升高；5-ASA組與AR高劑量組大鼠結(jié)腸組織IL-10的含量進(jìn)行比較，無(wú)顯著性差異。AR高劑量組大鼠結(jié)腸組織IL-10的含量顯著高于AR低劑量組大鼠結(jié)腸組織IL-10含量。結(jié)果見(jiàn)表4：

表4靈仙新苷對(duì)大鼠炎癥性腸病克羅恩模型腸組織IL-10及TNF-α含量的影響(n＝8)

^**P<0.01，與空白對(duì)照組比較，^*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；^##P<0.01，與模型對(duì)照組比較，^#P<0.05，與模型對(duì)照組比較；^ΔΔP<0.01，與美沙拉嗪組比較，^ΔP<0.05，與美沙拉嗪組比較

(6)Western blot檢測(cè)腸組織TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組極顯著增加細(xì)胞核中NF-κBp65亞基蛋白的表達(dá)(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、AR高劑量組極顯著抑制細(xì)胞核中NF-κBp65亞基蛋白表達(dá)(P<0.01)，與模型組比較，AR中劑量組顯著抑制細(xì)胞核中NF-κBp65亞基蛋白表達(dá)(P<0.05)，AR各劑量組均可不同程度地抑制細(xì)胞核中NF-κBp65亞基蛋白表達(dá)并呈現(xiàn)一定劑量相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表5：

表5靈仙新苷對(duì)大鼠炎癥性腸病克羅恩模型腸組織TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)(Western blot)的影響(n＝8)

^**P<0.01，與空白對(duì)照組比較，^*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；^##P<0.01，與模型對(duì)照組比較，^#P<0.05，與模型對(duì)照組比較；^ΔΔP<0.01，與美沙拉嗪組比較，^ΔP<0.05，與美沙拉嗪組比較

上述研究結(jié)果表明，靈仙新苷具有顯著抗大鼠炎癥性腸炎克羅恩病的作用。

上述靈仙新苷是通過(guò)以下方法制備得到：取威靈仙藥材(東北鐵線蓮)，用藥材10倍重量水加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并水提液，將水提液室溫冷卻、過(guò)濾后上預(yù)先處理好的大孔樹(shù)脂D101(流速2BV/h)，依次用水和20％乙醇洗脫至流出液澄清后，再用50％乙醇洗脫至流出液無(wú)色，收集50％乙醇洗脫液，濃縮，微波干燥，得威靈仙總皂苷干粉，將該總皂苷干粉加入其50倍重量無(wú)水乙醇加熱回流2小時(shí)后趁熱過(guò)濾，濾液室溫放置過(guò)夜，濾取沉淀，干燥后得粗品，粗品用20％乙醇溶解后上預(yù)先處理好的ODS柱(流速1BV/h)，依次用30％，40％，90％乙醇分別洗脫至無(wú)色，收集40％乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥后，得淡黃色靈仙新苷，含量：＞90％。