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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)nk細胞活性以用于治療血液惡性疾病。

發(fā)明背景

自然殺傷(nk)細胞為充當(dāng)細胞毒性免疫細胞的大顆粒淋巴細胞的亞群。由天然針對靶細胞(例如，癌細胞、病毒感染細胞)的nk細胞介導(dǎo)的細胞毒性活性一般表現(xiàn)為分別由活化細胞表面受體和抑制性細胞表面受體傳遞的正信號與負信號“平衡”的結(jié)果。

nk細胞可由多種已知細胞表面標(biāo)記鑒別，該細胞表面標(biāo)記在物種之間有所不同(例如，在人中常用cd56、cd16、nkp44、nkp46和nkp30；在小鼠常用nk1.1、ly49a-w、cd49b)。在活性狀態(tài)下，nk細胞能夠殺死某些自體、異體和甚至異種腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些細菌(例如，傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi))以及其他靶細胞。nk細胞似乎優(yōu)先殺死在其表面上幾乎不或不表現(xiàn)i類主要組織相容性(“mhci”或“mhc-i”)分子的靶細胞。nk細胞還殺死已連接抗體分子的靶細胞，這是一種稱為抗體依賴性細胞毒性(adcc)的機制。在針對靶細胞的作用中，nk細胞可釋放稱作穿孔素的成孔蛋白、稱作顆粒酶的蛋白水解酶，和細胞因子/趨化因子(例如，tnfα、ifnγ等)，其直接導(dǎo)致靶細胞凋亡或溶解，或調(diào)節(jié)其他免疫反應(yīng)。nk細胞活化后還可以表達fas配體(fasl)，使得這些細胞能夠誘導(dǎo)表達fas的細胞凋亡。

足夠的nk細胞活性和nk細胞計數(shù)通常皆為發(fā)動足夠的nk細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所必需。nk細胞可以正常數(shù)目存在于個體體內(nèi)，但這些細胞若未經(jīng)活化，將不能發(fā)揮重要的免疫系統(tǒng)功能，諸如消除異常細胞。nk細胞活性降低與多種疾病產(chǎn)生和進展有關(guān)。例如，研究表明nk細胞活性低會導(dǎo)致較易感染疾病，諸如慢性疲勞綜合征(cfs)、病毒感染，以及產(chǎn)生癌癥。

nk細胞活性由nk細胞活性調(diào)節(jié)受體(“nkcamr”或簡稱為“amr”)調(diào)節(jié)，這種受體可能對諸如mhc-i分子、mhc-i同源物或靶細胞上表達的其他生物分子的各種配體具有特異性。nk細胞在個體體內(nèi)通常呈現(xiàn)為多種活化受體和抑制性受體。nk細胞的活性由經(jīng)由這些活化受體和抑制性受體所轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號平衡來調(diào)節(jié)。接著在下文中簡要論述各種類型的nkcamr。大多數(shù)nkcamr似乎屬于兩類蛋白質(zhì)中的一類：免疫球蛋白(ig)樣受體超家族(igsf)或c型凝集素樣受體(ctlr)超家族(參見例如，radaev和sun，annu.rev.biomol.struct.200332:93-114)。然而，已知其他形式的nkcamr。

針對nkcamr(例如殺傷免疫球蛋白樣受體(kir))的抗體先前已經(jīng)描述，并且也存在至少一些提議將抗nk受體抗體(例如抗kir抗體)與現(xiàn)有技術(shù)的其他抗癌劑組合。例如，wo2004056392描述將抗nkp30抗體和/或抗nkp46抗體與白介素-2(il-2)混合使用。wo2005009465描述治療性抗體(例如，美羅華(rituxan))與阻斷nk細胞的抑制性受體或刺激nk細胞的活化受體的化合物(例如，抗kirmab，例如mabdf200或抗nkp30mab)組合以增強用治療性抗體治療人受試者的功效(還可參見us20050037002)。wo2008/084106描述抗kir配方、劑量和給藥方案。wo2005079766也描述用于癌癥療法中的包括抗kir抗體的抗體(例如，抗組織因子抗體)的組合。wo2005003168和wo2005003172描述多種抗kir抗體與多種藥劑(包括il-2和il-21)的組合。wo2005037306類似地描述il-21、il-21衍生物和il-21類似物與抗kir抗體的組合。

雖然nk細胞在科學(xué)文獻中在其潛在地促成由結(jié)合腫瘤抗原的抗體所介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)方面已受到廣泛關(guān)注，但幾乎沒有研究旨在研究體內(nèi)功效或直接由調(diào)節(jié)nk細胞受體來增強nk細胞的細胞毒性。用nk細胞調(diào)節(jié)化合物進行治療迄今為止已一般設(shè)想為可潛在地恢復(fù)nk細胞殺死靶細胞的能力?？赡芸紤]到nk細胞免疫監(jiān)視作用在重大疾病(例如，腫瘤負荷)情況下受損的跡象，此類治療不用于無晚期疾病的患者。例如，對于骨髓瘤，侵襲性多發(fā)性骨髓瘤(mm)伴有nk細胞量減少以及功能衰竭。在患有晚期mm的患者中，nk細胞計數(shù)也減少并且nk細胞對刺激具低反應(yīng)性。

因此，在本領(lǐng)域中需要使用nk細胞調(diào)節(jié)來向患者提供改善的益處的方法。調(diào)節(jié)nk細胞活性的化合物(例如，抗+nkcir抗體及其片段)可尤其適用于治療癌癥。

發(fā)明概要

本發(fā)明提供用于治療患有或先前已患有血液惡性疾病或惡性疾病前兆的個體的方法。該方法包括對該個體施用治療活性量的抑制nk細胞抑制性受體(nkcir)的化合物。優(yōu)選地在個體的疾病程度最小或不可檢測時對個體施用化合物。另外，本發(fā)明涵蓋抑制nkcir(自然殺傷細胞抑制性受體)的化合物的用途，其是用于制備一種藥物組合物，該藥物組合物用于治療患有或先前已患有血液惡性疾病前兆或血液惡性疾病的個體，用于在個體的疾病程度最小或不可檢測時施用至個體，所述組合物包含治療活性量的抑制nkcir(自然殺傷細胞抑制性受體)的化合物。

在本發(fā)明的一個實施方案中，個體患有血液惡性疾病前兆。在具體實施方案中，個體患有smm(郁積型骨髓瘤(smolderingmyeloma))、mgus(意義未明的單克隆丙種球蛋白病)或mds(骨髓增生異常綜合征)。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，個體患有或先前已患有血液惡性疾病或具有與血液惡性疾病發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)的基因突變。在具體實施方案中，個體患有或先前已患有白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或淋巴惡性疾病。在一個優(yōu)選的實施方案中，個體患有或先前已患有aml(急性骨髓白血病)、mm(多發(fā)性骨髓瘤)、smm(郁積型骨髓瘤)、cml(慢性骨髓性白血病)或cll(慢性淋巴細胞性白血病)。

在一個實施方案中，個體在施用化合物之前已用針對血液惡性疾病或血液惡性疾病前兆的第一治療進行治療。該第一治療可以選自用化學(xué)治療劑、免疫調(diào)節(jié)劑、放射療法、手術(shù)、抗激素劑或抗血管生成劑，或任何上述的組合進行治療。優(yōu)選地，個體對用第一治療進行的治療有部分反應(yīng)或完全反應(yīng)。個體可因第一治療而有所緩解，疾病不可檢測，無癥狀和/或異常細胞數(shù)目低。

在一個實施方案中，血液惡性疾病為白血病，即急性骨髓白血病(aml)。優(yōu)選地，個體任選地在用第一治療進行治療后有所緩解，無癥狀，疾病不可檢測和/或異常細胞數(shù)目低。在具體實施方案中，個體全身白血病負荷低于約10⁹個細胞和/或骨髓中母細胞(blast)小于5％和/或無白血病的體征或癥狀。

在一個實施方案中，血液惡性疾病為骨髓瘤，即多發(fā)性骨髓瘤(mm)。優(yōu)選地，個體任選地在用第一治療進行治療后有部分反應(yīng)或完全反應(yīng)、有所緩解、無癥狀、疾病不可檢測和/或異常細胞數(shù)目低。在具體實施方案中，個體的血清蛋白m水平降低大于25％。優(yōu)選地，個體的血清蛋白m水平降低大于50％。

在一個實施方案中，血液惡性疾病為郁積型多發(fā)性骨髓瘤(smm)。優(yōu)選地，個體任選地在用第一治療進行治療后有部分反應(yīng)或完全反應(yīng)、有所緩解、無癥狀、疾病不可檢測和/或異常細胞數(shù)目低。在本發(fā)明的具體方面，個體骨髓中有10％或10％以上的漿細胞，但不符合多發(fā)性骨髓瘤(mm)的標(biāo)準(zhǔn)。在本發(fā)明的另一方面，個體的血清m蛋白≥3g/dl。在本發(fā)明的另一方面，個體骨髓中有10％或10％以上的漿細胞，而無終末器官損傷(crab)跡象。在另一個實施方案中，個體的血清m蛋白≥3g/dl，并且該個體骨髓中也有10％或10％以上的漿細胞，其任選地進一步無終末器官損傷跡象。

在一個實施方案中，血液惡性疾病為意義未明的無癥狀單克隆丙種球蛋白病(mgus)。在該實施方案中，個體骨髓中優(yōu)選地有小于10％的漿細胞。

本發(fā)明還涵蓋方法，其包括：

(a)確定患有或已患有血液惡性疾病的個體的疾病是否程度最小或不可檢測；以及

(b)如果該個體的疾病程度最小或不可檢測，則用治療活性量的抑制nkcir的化合物治療該個體。

此外，本發(fā)明包括方法，其包括：

(a)確定個體是否患有郁積型多發(fā)性骨髓瘤(smm)、意義未明的無癥狀單克隆丙種球蛋白病(mgus)或骨髓增生異常綜合征(mds)；

(b)如果該個體患有smm、mgus或mds，則用治療活性量的抑制nkcir的化合物治療該個體。

此外，本發(fā)明包括方法，其包括：

(a)用第一治療(例如，一種或多種誘導(dǎo)療法以及任選的一種或多種鞏固療法)治療患有血液惡性疾病的個體，任選地其中該第一治療為化學(xué)治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑(例如，imid)，以使個體的疾病程度最小或不可檢測(例如，疾病有所緩解和/或個體對第一治療有反應(yīng))；

(b)用治療活性量的抑制nkcir的化合物治療疾病程度最小或不可檢測的個體。任選地，步驟(a)還包括確定患有或已患有血液惡性疾病的個體的疾病是否程度最小或不可檢測。

另外，本發(fā)明涵蓋化合物的用途，其是用于制備一種組合物，該組合物包含檢測患有或先前已患有血液惡性疾病的個體的疾病是否程度最小或不可檢測的部分，并且如果該個體的疾病程度最小或不可檢測，則用治療活性量的抑制nkcir的化合物治療該個體。

本發(fā)明還涵蓋化合物的用途，其是用于制備一種組合物，該組合物包含檢測個體是否患有郁積型多發(fā)性骨髓瘤(smm)、意義未明的無癥狀單克隆丙種球蛋白病(mgus)或骨髓增生異常綜合征(mds)的部分，并且如果該個體患有smm、mgus或mds，則用治療活性量的抑制nkcir的化合物治療該個體。

此外，本發(fā)明包括化合物的用途，其是用于制備一種用于治療患有血液惡性疾病的個體的組合物，以第一治療治療個體，以使個體的疾病程度最小或不可檢測，并且用治療活性量的抑制nkcir的化合物治療疾病程度最小或不可檢測的個體。

在一個實施方案中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)準(zhǔn)則來確定患有或已患有血液惡性疾病的個體的疾病是否程度最小或不可檢測，其是否有所緩解，有部分或完全反應(yīng)和/或具有特定病變(例如，smm、mgus、aml、cml、mds、mm等)。

在一個實施方案中，確定患有或已患有血液惡性疾病的個體的疾病是否程度最小或不可檢測、其是否有所緩解或有部分或完全反應(yīng)包括鑒別異常細胞群或細胞異常數(shù)目(例如，骨髓中漿細胞的百分比)。任選地，所述鑒別由流式細胞術(shù)來實現(xiàn)。任選地，該方法還包括分選或分離異常細胞群。

在一個實施方案中，確定患有或已患有血液惡性疾病的個體的疾病是否程度最小或不可檢測，其是否有所緩解和/或有完全反應(yīng)包括檢測細胞遺傳學(xué)異常(例如，評估核型)。

在一個實施方案中，檢測最小程度疾病包括分選異常細胞群；以及使從所分選細胞分離的核酸與一種或多種靶向與血液惡性疾病發(fā)病可能性增加相關(guān)的基因重排的核酸接觸，其中該接觸確定細胞遺傳學(xué)異常的存在；從而檢測最小程度疾病的存在。在一個實施方案中，遺傳標(biāo)記為flt3或npm1中與患有aml的個體存活的不良預(yù)后相關(guān)的突變。在另一實施方案中，遺傳標(biāo)記為免疫球蛋白(ig)和/或t細胞受體基因中的重排。

在一個實施方案中，確定患有或已患有血液惡性疾病的個體的疾病是否程度最小或不可檢測，其是否有所緩解和/或有部分或完全反應(yīng)(例如，在mm中)包括評估個體中的血清單克隆蛋白(m蛋白)的水平。

在一個實施方案中，確定個體是否患有smm或mgus包括評估個體中的血清單克隆蛋白(m蛋白)的水平；任選地其中如果m蛋白水平為至少3g/dl，則確定該患者患有smm。在一個實施方案中，確定個體是否患有smm或mgus包括評估個體中的骨髓漿細胞；任選地其中如果個體具有至少10％骨髓漿細胞，則確定該患者患有smm。

如上文所述，基于一種或多種預(yù)測因素，患者具有不良疾病預(yù)后，例如，處于較高的進展風(fēng)險。在一個實施方案中，患者患有smm并且根據(jù)表2中的分類處于第1組內(nèi)。在一個實施方案中，患者有基于基因突變的不良預(yù)后，例如，患者患有aml并且有flt3或npm1中與不良預(yù)后有關(guān)的突變。

在一個實施方案中，使用抑制nkcir的化合物作為單個藥劑。在另一實施方案中，抑制nkcir的化合物與至少一種其他治療劑組合施用。

抑制nkcir的化合物因抑制所述nkcir而可以調(diào)節(jié)nk細胞的細胞毒性。優(yōu)選地，抑制nkcir的化合物為具有阻斷或中和nkcir介導(dǎo)的nk抑制作用且從而增強針對以其他方式阻斷的靶細胞的nk細胞活性的能力的抗nkcir抗體或抗體片段。在一個實施方案中，抗體或抗體片段為針對殺傷免疫球蛋白樣受體(kir)的抗體或其片段。在另一個實施方案中，抗體或抗體片段為嵌合、人或人源化抗體或抗體片段。在另一個實施方案中，抗體或抗體片段包括igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm。優(yōu)選地，抗體或抗體片段包括igg1或igg4。在一個實施方案中，抗體或抗體片段包括fc域，該fc域包含至少一個影響效應(yīng)子功能、半衰期、蛋白質(zhì)水解、fcr結(jié)合或糖基化中的一者或多者的突變。

在具體實施方案中，抗體或抗體片段為結(jié)合kir2dl1和kir2dl2/3的抗kir抗體或抗體片段。優(yōu)選地，抗kir抗體或抗體片段與1-7f9競爭。更優(yōu)選地，抗kir抗體或抗體片段為1-7f9或其片段。還預(yù)期抗kir抗體片段為1-7f9中與1-7f9具有相同結(jié)合特性的片段。在一個方面，抗kir抗體或抗體片段包含與i-7f9的vl域和vh域具有至少90％同一性的vl域和vh域。在另一方面，抗kir抗體或抗體片段包含1-7f9的vl域和vh域。在另一方面，抗kir抗體或抗體片段的vl包含1-7f9的vlcdr。在另一方面，抗kir抗體或抗體片段的vh包含1-7f9的vhcdr。

在一個實施方案中，抗kir抗體或抗體片段包含氨基酸序列與1-7f9具有至少80％序列同一性，與1-7f9具有至少90％序列同一性，與1-7f9具有至少95％序列同一性，或與1-7f9具有至少98％序列同一性的多肽。在另一個實施方案中，抗kir抗體或抗體片段與1-7f9特異性結(jié)合至完整kir2dl1或kir2dl2/3上相同的線性或構(gòu)象表位，和/或與1-7f9競爭結(jié)合至完整kir2dl1或kir2dl2/3上相同的線性或構(gòu)象表位。

在另一個實施方案中，抗體或抗體片段為針對選自cd94、nkg2(例如，nkg2a和nkg2e)和lir(例如lilrb1至b5)的nkcir的抗體或其片段。

在本發(fā)明的一個實施方案中，抗nkcir抗體作為包含治療有效量的抗nkcir抗體的藥學(xué)上可接受的組合物施用。在一個方面，nkcir抗體以引起nk細胞上的nkcir基本完全飽和持續(xù)至少約1周、至少約2周或至少約一個月的時期的該抗體的量施用。

在一個方面，以引起nk細胞上的nkcir基本完全飽和持續(xù)至少約1周、至少約2周或至少約1個月的時期而在治療期內(nèi)無顯著“去飽和”的量和頻率進行抗體給藥。在一個實施方案中，一種或多種nkcir抗體的治療活性量為在施用抗體后引起nk細胞上的nkcir基本完全飽和持續(xù)至少約1周、約2周或約1個月的時期的該抗體的量，其中以約每2周一次、約每月一次或約每2個月一次或更長時間一次的給藥頻率多次施用抗體并且后續(xù)給藥相隔約2周或約1個月。

在一個方面，以引起nk細胞上的nkcir基本完全飽和持續(xù)至少約1周、至少約2周或至少約1個月的時期并且允許在治療期內(nèi)出現(xiàn)顯著“去飽和”的量和頻率進行抗體給藥。在一個實施方案中，一種或多種nkcir抗體的治療活性量為在施用抗體后引起nk細胞上的nkcir基本完全飽和持續(xù)至少約1周、約2周或約1個月的時期的該抗體的量，其中以約每2周一次、約每月一次或約每2個月一次的給藥頻率多次施用抗體并且后續(xù)給藥相隔約2周或約1個月。

在另一個實施方案中，抗nkcir抗體或抗體片段以以下劑量范圍施用：約0.1mg/kg至約3.0mg/kg、約0.3mg/kg至約3.0mg/kg、約0.1mg/kg至約1.0mg/kg或約1.0mg/kg至約3.0mg/kg。優(yōu)選地，抗nkcir抗體或抗體片段約每2個月一次施用。

在另一方面，上述各種方法中的任一者任選地通過以一種或多種其他抗癌劑(例如，化學(xué)治療劑)施用化學(xué)療法治療而進一步修改。

在另一個實施方案中，提供了用于人療法的藥物組合物，其含有根據(jù)本發(fā)明的抗nkcir抗體或抗體片段以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其在施用至普通人個體(體重為約45至90kg)后產(chǎn)生以下劑量范圍：約0.1mg/kg至約3.0mg/kg、約0.3mg/kg至約3.0mg/kg、約0.1mg/kg至約1.0mg/kg或約1.0mg/kg至約3.0mg/kg。在具體實施方案中，組合物在施用至普通人受試者后產(chǎn)生約0.1mg/kg至0.3mg/kg，并且更具體地講0.2mg/kg或約0.3mg/kg的劑量范圍。

本發(fā)明還涵蓋用于治療患有疾病的個體和/或用于增強有需要的個體的nk細胞活性的方法。該方法包括對該個體施用在人患者中提供約0.1mg/kg至約0.3mg/kg的劑量的量的抗nkcir抗體或抗體片段以及藥學(xué)上可接受的載體，其中至多每月一次施用抗nkcir抗體或抗體片段。另外，本發(fā)明涵蓋在人患者中提供約0.1mg/kg至約0.3mg/kg的劑量的量的抗nkcir抗體或抗體片段以及藥學(xué)上可接受的載體的用途，其是用于制備用于人療法的藥物組合物。在一個實施方案中，至多每兩個月一次施用抗nkcir抗體或抗體片段。在另一實施方案中，每月一次和每兩個月一次施用抗nkcir抗體或抗體片段。在另一個實施方案中，在人患者中提供約0.1mg/kg至約0.2mg/kg的劑量的抗nkcir抗體或抗體。

這些方面更充分描述于本文提供的本發(fā)明的說明中，并且本發(fā)明的其他方面、特征以及優(yōu)勢將通過本文提供的本發(fā)明的說明顯而易見。

附圖簡述

圖1示出了用于大部分aml患者的治療策略，其分成兩個一般階段：誘導(dǎo)療法和緩解后療法。

圖2(wo2006/003179的圖12)提供了抗體df200與抗體pan2d(nkvsf1)的輕鏈可變區(qū)和輕鏈cdr的氨基酸序列的比較性比對。(a)df200的抗kir輕鏈可變區(qū)(vl)(seqidno:1)與pan-2d的抗kir輕鏈可變區(qū)(vl)(seqidno:2)的比對。氨基酸序列上的數(shù)字指示未成熟(未分泌)免疫球蛋白翻譯起始met(+1)的各自位置。(b)cdr-l1序列的比對。之前的殘基：通常為cys。之后的殘基：trp。通常為trp-tyr-leu。長度：10-17aa。(c)cdr-l2序列的比對。之前的殘基：通常為ile-tyr。長度：7aa。開始：在cdr-l1末端之后大約16aa。開始：自分泌的蛋白質(zhì)的開始端起大約24aa。(d)cdr-l3序列的比對。之前的殘基：cys。之后的殘基：phe-gly-xxx-gly。長度：7-11aa。開始：在cdr-l2末端之后大約33aa。

圖3(wo2006/003179的圖13)提供了抗體df200的重鏈可變區(qū)以及重鏈cdr。(a)df-200vh區(qū)，未成熟蛋白質(zhì)。分泌的成熟vh在位置20(殘基q)處開始。vh區(qū)結(jié)束于殘基s并且之后延續(xù)恒定區(qū)(未示出)。(b)cdr-h1。之前的殘基：cys-xxx-xxx-xxx。之后的殘基：trp。通常為trp-val或trp-ile。長度：10-14aa。開始：自分泌的蛋白質(zhì)的開始端起大約22-26aa。(c)cdr-h2。之前的殘基：leu-giu-trp-he-giy，但可能存在其他變型。之后的殘基：lys或arg/leu或he或vai或phe或thr或ala/thr或ser或lie或ala。長度：16-20aa。開始：在cdr-h1末端之后大約15aa。(d)cdr-h3。之前的殘基：cys-xxx-xxx(通常為cys-ala-arg)。之后的殘基：trp-giy-xxxvgiy。長度：3-25aa。開始：在cdr-h2末端之后大約33。

圖4(wo2006/003179的圖14)描繪了人抗體1-7f9的vh和vl序列的核苷酸和氨基酸序列。(a)hukir1-7f9成熟可變輕鏈的翻譯。(b)編碼hukir1-7f9成熟可變輕鏈的核苷酸序列。(c)hukir1-7f9成熟可變重鏈的翻譯。(d)編碼hukir1-7f9成熟重鏈的核苷酸序列。

圖5(wo2006/003179的圖15)示出了單克隆抗體1-7f9、df200(vh序列：seqidno:19；vl序列：seqidno:21)以及pan2d(nkvsf1；vh序列：seqidno:20；vl序列：seqidno:22)的vh和vl序列的氨基酸序列。cdr加有方框。

圖6(wo2006/003179的圖20)示出了kir2dl1上1-7f9的結(jié)合表位，如kir2dl1序列中所示。與1-7f9相距4.0a距離范圍內(nèi)的氨基酸以灰黑色背景突出顯示。由黑色背景突出顯示的氨基酸參與氫鍵結(jié)合至1-7f9。圖2-6中所列的序列idno對應(yīng)于wo2006/003179中所提交的序列表中的seqidno，所述序列表包含在該申請的權(quán)利要求之前的幾頁中。

具體實施方式

本發(fā)明提供用于治療患有或先前已患有血液惡性疾病或惡性疾病前兆的個體的方法。該方法包括對該個體施用治療活性量的抑制nk細胞抑制性受體(nkcir)的化合物。在個體的疾病程度最小或不可檢測時對個體施用化合物。

本文所述的人臨床試驗顯示用阻斷參與nk細胞的細胞毒性的nk細胞抑制受體的化合物(例如，抗nkcir抗體)進行治療極大地延長了罹患血液惡性疾病但在用化合物治療時有所緩解和/或疾病程度最小或不可檢測的患者的無病存活期。

抗體

除非另外說明或與上下文明顯相矛盾，否則術(shù)語抗體在本發(fā)明的上下文中是指免疫球蛋白(ig)分子、ig分子的片段或其任一者的衍生物，其具有(a)在典型生理條件下特異性結(jié)合到至少一種靶抗原持續(xù)較長時段，和/或(b)調(diào)節(jié)與其靶nkcir有關(guān)的生理反應(yīng)，例如調(diào)節(jié)kir調(diào)節(jié)的nk細胞活性的能力。較長時段就此而言意指任何適于在標(biāo)準(zhǔn)免疫測定(例如酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa))中檢測抗體-抗原復(fù)合物的時期。通常，較長時段為至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時、至少約2小時、至少約4小時、至少約8小時、至少約12小時、約24小時或24小時以上、約48小時或48小時以上等的時期。

免疫球蛋白是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)，其包含重鏈(例如，α鏈、δ鏈、ε鍵、γ鏈和μ鏈)和輕鏈(例如，κ鏈和λ鏈)。在人中，免疫球蛋白可根據(jù)ig分子中所含的重鏈而分為五個主要類別(iga、igd、ige、igg和igm)。

免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)經(jīng)充分表征。參見例如，fundamentalimmunology(paul,w.，編著，第2版，ravenpress,n.y.(1989))。igg分子是最常見類型的免疫球蛋白，包含兩對多肽鏈，一對輕(l)(低分子量)鏈和一對重(h)鏈，所有四條鏈由二硫鍵相互連接。簡而言之，各重鏈通常由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為hcvr或vh)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)通常由三個域ch1、ch2和ch3構(gòu)成。各輕鏈通常由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為lcvr或vl)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)通常由一個域cl構(gòu)成。vh區(qū)和vl區(qū)可進一步細分為具有高變性的區(qū)域(或高變區(qū)，其在結(jié)構(gòu)確定的環(huán)的序列和/或形式方面具有高變性)，其也稱為互補決定區(qū)(cdr)，與稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的較保守區(qū)域交替。在天然產(chǎn)生的全長抗體中，各vh和vl通常由3個cdr和4個fr構(gòu)成，其自氨基端至羧基端按以下順序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4(就高變環(huán)區(qū)而言，其在輕鏈可變域中也可稱為frl1、cdrl1等或環(huán)l1、l2、l3，并且在重鏈域中稱為環(huán)h1、h2和h3(參見例如chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))。通常，通過kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)中所述的方法對此區(qū)中的氨基酸殘基進行編號(本文中諸如“如kabat中的可變域殘基編號”和“根據(jù)kabat”的短語是指該用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統(tǒng))。使用該編號系統(tǒng)，肽的實際線性氨基酸序列可含有對應(yīng)于縮短可變域的fr或cdr或插入可變域的fr或cdr中的較少或額外氨基酸。例如，重鏈可變域可以包括在cdrh2的殘基52后單個氨基酸插入(根據(jù)kabat的殘基52a)以及在重鏈fr殘基82后插入的殘基(例如，根據(jù)kabat的殘基82a、82b和82c等)?？梢酝ㄟ^在抗體的序列的同源性區(qū)域中與“標(biāo)準(zhǔn)”kabat編號序列比對來確定給定抗體的殘基的kabat編號。

如上所述，抗nkcir抗體可呈(或包含)保持特異性結(jié)合至nkcir的能力的抗體“片段”形式。此類抗體片段的特征在于在適當(dāng)程度上具有在本文別處所述的與全長抗體相關(guān)的上述特征中的任一者或組合(例如，許多抗體片段缺少fc域并且因此不誘導(dǎo)或促進抗體相關(guān)補體功能)?？贵w的抗原結(jié)合功能可由其任意數(shù)量的合適片段發(fā)揮。抗體片段的實例包括(i)fab片段，其為基本上由vl、vh、cl和chi域組成的單價片段；(ii)f(ab)2和f(ab')2片段，其為包含由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)基本上由vh和ch1域組成的fd片段；(iv)基本上由抗體單臂的vl和vh域組成的fv片段；(v)dab片段(ward等，(1989)nature341:544-546)，其基本上由vh域組成；以及(vi)分離的互補決定區(qū)(cdr)。此外，雖然fv片段的兩個域(即vl和vh)是由各自的基因編碼，但可使用重組方法通過能夠使其成為單一蛋白質(zhì)鏈的合成連接子將其接合，其中vl和vh區(qū)配對形成單價分子(稱作單鏈抗體或單鏈fv(scfv)；參見例如，bird等，(1988)science242:423-426；和huston等，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883)。除非另外說明或上下文明確指示，否則此類單鏈抗體也涵蓋于諸如抗體片段和抗體樣肽/分子的術(shù)語中。其他形式的單鏈抗體，例如雙功能抗體(diabody)也旨在由這些術(shù)語所涵蓋。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中vh和vl域表達于單一多肽鏈上，但所使用的連接子通常過短而不允許兩個域在同一鏈上配對，從而迫使所述域與另一條鏈的互補域配對并形成兩個抗原結(jié)合位點(參見例如，holliger,p.等，(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448；poljak,r.j.等，(1994)structure2:1121-1123；和cao等，(1998),bioconjugatechem.9,635-644)。盡管與全長抗體具有相似的結(jié)合特性，但此類抗體片段共同并且各自獨立地為本發(fā)明的獨特特征，顯示出與抗體不同的生物學(xué)和/或物理化學(xué)特性和效用。由本發(fā)明提供的這些和其他有用的抗體片段和抗體樣分子在本文中得以進一步論述。通常應(yīng)當(dāng)理解，除非另外說明或與上下文明顯相矛盾，否則任何合適的抗體片段均可用作本文所述的本發(fā)明組合物和方法中的抗體的替代物，并且反之亦然。

在一般意義上，術(shù)語抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體(mab)。術(shù)語“單克隆抗體”是指包含具有均一結(jié)構(gòu)和特異性的同源性抗體群體的組合物。多克隆抗體通常衍生自經(jīng)免疫原性激發(fā)的動物的血清，但其也可通過重組技術(shù)獲得?？筴ir抗體可視作單克隆抗體，與其產(chǎn)生方式無關(guān)。

所產(chǎn)生之抗體可具有任何同種型，并且之后可使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)使抗體進行同種型轉(zhuǎn)變。此類技術(shù)包括使用直接重組技術(shù)(參見例如，美國專利4,816,397)、細胞-細胞融合技術(shù)(參見例如，美國專利5,916,771)以及本領(lǐng)域已知的其他合適技術(shù)。因此，例如，由本發(fā)明提供的多特異性多價抗體的效應(yīng)子功能可以通過同種型轉(zhuǎn)變成例如igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm抗體而相對于一個或兩個親本抗體的同種型有所“改變”以用于各種治療用途。

nk細胞活性調(diào)節(jié)受體(nkcamr)

nk細胞活性由nk細胞活性調(diào)節(jié)受體(“nkcamr”或簡稱為“amr”)調(diào)節(jié)，這種受體可能對諸如mhc-i分子、mhc-i同源物或靶細胞上表達的其他生物分子的各種配體具有特異性。nk細胞在個體體內(nèi)通常呈現(xiàn)為多種活化受體和抑制性受體。nk細胞的活性由經(jīng)由這些活化受體和抑制性受體所轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號平衡來調(diào)節(jié)。接著在下文中簡要論述各種類型的nkcamr。

當(dāng)體細胞處于應(yīng)激下(例如處于癌癥進展或感染中)時，諸如mica和micb的各種分子通常呈現(xiàn)于受應(yīng)激的細胞表面上并且所呈現(xiàn)的mhc-i分子通常自細胞表面“喪失”(數(shù)目減少和/或糖基化以使其不被免疫系統(tǒng)“視作”“外來物”)。nkcamr對潛在nk靶細胞中與細胞應(yīng)激、疾病和病癥相關(guān)的這些和其他變化敏感。

大多數(shù)nkcamr似乎屬于兩類蛋白質(zhì)中的一類：免疫球蛋白(ig)樣受體超家族(igsf)或c型凝集素樣受體(ctlr)超家族(參見例如，radaev和sun，annu.rev.biomol.struct.200332:93-114)。然而，已知其他形式的nkcamr。多種nkcamr的結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明(同前)。為更好地說明本發(fā)明，本文結(jié)合特定實例描述已充分了解的各類型nkcamr。然而，除本文明確描述的那些受體之外，還已知若干其他nkcamr(參見例如，farag等，expertopin.biol.ther.3(2):237-250)，并且本文所述的本發(fā)明組合物和方法通常也適用于這些和其他nkcamr。

nk細胞活化受體(nkcar)

許多nk細胞活化受體(nkcar)屬于ig超家族(igsf)(此類受體在本文中也可稱為ig樣受體或“ilr”)?；罨痠lrnk受體(ailr)包括例如，cd2、cd16、cd69、dnax輔助分子-1(dnam-1)、2b4、nk1.1；殺傷免疫球蛋白(ig)樣活化受體(kar)；ilt/lir；以及自然細胞毒性受體(ncr)，例如nkp44、nkp46和nkp30。若干其他nkcar屬于cltr超家族(例如，nkrp-1、cd69；cd94/nkg2c和cd94/nkg2e異二聚體、nkg2d均二聚體，并且在小鼠中，為ly49的活化同種型(例如ly49a-d))。其他nkcar(例如，lfa-1和vla-4)屬于整聯(lián)蛋白超家族并且其他活化受體可能具有其他可區(qū)別結(jié)構(gòu)。許多nkcar具有結(jié)合至mhc-i分子的細胞外域，以及相對較短并且缺乏抑制性nk受體所特有的抑制性(itim)信號傳導(dǎo)基序的細胞質(zhì)域。這些受體的跨膜域通常包括有助于其與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子(例如cd3ζ、fcεriγ、dap12和dap10)締合的帶電荷氨基酸殘基(2b4，例如似乎為該普遍規(guī)律的一個例外)，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子含有稱作“基于免疫受體酪氨酸的活化基序”(itam)并且傳播nk細胞活化信號的短氨基酸序列。受體2b4在其細胞質(zhì)尾區(qū)含有4個所謂的基于免疫受體酪氨酸的轉(zhuǎn)換基序(itsm)；itsm基序也可見于nkcarcs1/cracc和ntb-a中。2b4和slam的細胞質(zhì)域含有兩個或兩個以上獨特的基于酪氨酸的基序，其類似于活化受體和抑制性受體中所存在的基序并且可募集含有sh2域的蛋白質(zhì)shp-2和sap(slam相關(guān)蛋白)。

應(yīng)激誘導(dǎo)性分子(例如人的mic-a、mic-b和ulbp以及小鼠的rae-1和h-60)可用作nkcar(例如nkg2d均二聚體)的配體。細胞碳水化合物、病原性抗原和抗體也可為nkcar配體。例如，nkr-p1可以結(jié)合至碳水化合物配體并觸發(fā)尤其針對顯示異常糖基化模式的腫瘤細胞的nk細胞活化。病毒血凝素可用作自然細胞毒性受體(ncr)(例如ilrnkcarnkp30、nkp44、nkp46和nkp80)的配體。

nkcar可直接轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號或可結(jié)合銜接子分子或其他受體一起發(fā)揮作用(在有時單獨有效的受體之間的協(xié)同反應(yīng)的情況下或在共受體-受體配對的情況下)。例如，nkcarncr通常缺乏itam并且因此經(jīng)由其跨膜域中的帶電荷殘基結(jié)合至銜接子分子(例如，nkp30與cd3ζ鏈締合；nkp44與dap12和/或karap締合；nkp46耦合到cd3ζ鏈和fcriγ鏈)，其隨后能夠募集蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(ptk)以傳播nk細胞活化信號。cd16為對nk細胞介導(dǎo)的adcc和細胞因子產(chǎn)生而言重要的nkcar，其與由cd3ζ鏈和/或γ鏈形成的均二聚體或異二聚體締合。nkg2d似乎與ncr和nkcar在nk細胞活化中起互補和/或協(xié)同作用?；罨槍μ囟ò袠?biāo)的nk細胞可能需要多個nkcar或ncr的協(xié)同活化，或僅單個受體的作用。包括2b4和nkp80的其他觸發(fā)表面分子似乎充當(dāng)nk細胞活化的共受體。

人kir的活化同種型(例如kir2ds和kir3ds)和鼠ly-49蛋白的活化同種型(例如ly-49d和ly-49h)由一些nk細胞表達。這些分子與其抑制性對應(yīng)物(論述于下文中)不同之處在于在其相對較短的細胞質(zhì)域中缺乏抑制性基序(itim)，以及具有與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽(例如二硫鍵連接的dap12二聚體)締合的帶電荷跨膜區(qū)。

nkcirnk細胞抑制性受體

ilr(igsf)nk細胞抑制性受體(nkcir)(i)包括多種不同的人kir，其對hla-a、-b或-c同種異型具有特異性。kir可以識別特定同種異型內(nèi)的多種等位基因，例如，kir2dl1識別hla-cw2、hla-cw4和hla-cw6同種異型。ctlr超家族抑制性受體包括cd94/nkg2蛋白質(zhì)家族的成員，其包含由凝集素樣cd94與nkg2家族的各種成員(例如nkg2a)形成的受體，并且分別識別人和小鼠的非典型i類分子hla-e和qa-1；以及識別小鼠的典型i類mhc分子的鼠ly49分子。進一步相比而言，nkrp1a、nkrp1f和nkrp1d為抑制性受體，其配體與mhc無關(guān)但為于各種細胞類型(例如樹突狀細胞、巨噬細胞和淋巴細胞)上表達的ctlr家族成員。

i類mhc特異性nkcir包括ctlrly-49受體(小鼠)；igsf受體白細胞免疫球蛋白樣受體(lir)(人)、kir(例如p58和p70殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，人)以及ctlrcd94/nkg2受體(小鼠和人)。所有mhc-i特異性nkcir似乎利用共同抑制性機制，該機制顯然涉及在mhc-i結(jié)合以及募集酪氨酸磷酸酶(例如，shp-1和shp-2)期間其細胞質(zhì)域中的itim磷酸化成磷酸化的itim，從而引起抑制涉及經(jīng)由nkcar活化nk的近端蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(ptk)。

由ctlr糖蛋白形成的抑制性cd94/nkg2異二聚體包含帶有itim的nkg2分子(例如，nkg2a)并且結(jié)合至非典型mhc-i分子(例如，人的hla-e和小鼠的qa-1)。

白細胞免疫球蛋白樣受體包括若干成員，其含有兩個或四個ig域并且在結(jié)構(gòu)上與kir多肽相關(guān)。參見例如fanger等，1999j.leukocytebiol.66:231-236。lir包括子族a和b，并且包括例如，lir-1至lir-8(其中的若干者也稱為ilt多肽，包括ilt-1、ilt-2、ilt-3、ilt-4、ilt-5和ilt-6)。多肽lir-1、lir-2、lir-3、lir-5和lir-8皆含有兩個或兩個以上itim抑制性信號傳導(dǎo)域。

抑制性ly-49受體為鼠ii型膜二硫鍵連接的均二聚體ctlr糖蛋白，其結(jié)合至各種mhc-i分子并且通常向nk細胞傳遞主要抑制性(負)信號。ly-49a例如結(jié)合至mhc-i分子h-2dd的α1/α2域，而ly-49c結(jié)合至h-2kb。人nk細胞似乎缺乏鼠ly-49受體的同源物。實際上，人nk細胞表達kir，其未見于小鼠nk細胞中。雖然人kir與小鼠ly-49受體缺乏結(jié)構(gòu)同源性，但其在功能上直系同源：兩種類型的受體結(jié)合至靶細胞上的i類hla，引起抑制nk介導(dǎo)的細胞毒性。

殺傷細胞免疫球蛋白樣受體kir

一種重要類型的nkcir為kir。一般來講，kir為細胞表面糖蛋白，包含一至三個細胞外免疫球蛋白樣域，其由某些t細胞以及大部分人nk細胞表達。多種kir經(jīng)充分表征(參見例如，carrington和norman，thekirgenecluster，2003年5月28日，可經(jīng)由美國國家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi))網(wǎng)站在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bookres.fcgi/mono_003/ch1d1.pdf處獲得)。人kir包括kir2dl和kir3dl。kir也可稱為各種其他名稱，例如cd158e1、cd158k、cd158z、p58kircd158e1(p70)、cd244等。(參見例如，美國專利申請20040038894，radaev等，annu.rev.biophys.biomol.struct.,32:93-114(2003)，cerweknka等，nat.rev.immunol.1:41-49(2001)；farag等，expertopin.biol.ther.,3(2):237-250(2003)；biassoni等，j.cell.mol.med.,7(4):376-387(2003)；以及warren等，britishj.haematology,121:793-804(2003)，其各自在此以引用的方式全文并入本申請中)。多種kir的結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明并且揭示這些蛋白質(zhì)之間具有顯著結(jié)構(gòu)相似性。參見例如，radaev等(同上)。

kir可在結(jié)構(gòu)上以及功能上進行分類。例如，大多數(shù)kir具有兩個ig域(58kdakir2dkir)，而其他kir具有三個ig域(70kdakir3dkir)，其有時可分別稱為p58和p70分子。kir的細胞質(zhì)尾區(qū)長度也不同。通常，具有相對較長細胞質(zhì)尾區(qū)(l)的kir傳遞抑制信號，而具有較短細胞質(zhì)尾區(qū)(s)的kir可活化nk或t細胞反應(yīng)。因此，對kir的命名可基于細胞外域的數(shù)目(kir2d或kir3d)和細胞質(zhì)尾區(qū)長(kir2dl或kir3dl)或短(kir2ds或kir3ds)。關(guān)于kir的其他命名信息提供于以下本發(fā)明的具體實施方式中?！発ir家族”的一些成員為nkcar，或更具體地講為“kar”(例如，kir2ds2和kir2ds4)；它們通常包含一個或多個與具有免疫刺激基序(itam)的銜接子(例如，dap12)締合的帶電荷跨膜殘基(例如，lys)。抑制性kir的細胞質(zhì)內(nèi)部分通常包含一個或多個募集磷酸酶的itim。抑制性kir結(jié)合至hla分子的α1/α2域。抑制性kir似乎并非通常需要與銜接子分子締合以具有活性。除非另外說明，否則諸如“kir”等的術(shù)語是指“kir家族”的nkcir成員，并且諸如“kar”等的術(shù)語是指“kir家族”的nkcar成員。

kir可結(jié)合mhc-i分子(例如，某些i類hla同種異型)，通常引起對抗并且可能超過刺激活化信號的負信號傳遞至nk細胞，從而防止nk細胞殺死相關(guān)潛在靶細胞(顯然經(jīng)由itim磷酸化和酪氨酸磷酸酶(例如，含有sh2域的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，諸如shp-1和shp-2)募集，引起ptk(例如，syk、tcr和/或zap70)去磷酸化和/或lat/plc復(fù)合物形成抑制以及itam級聯(lián)的相關(guān)破壞)。由于病毒常抑制i類mhc在其所感染的細胞中表達，所以此類受病毒感染的細胞變得易被nk細胞殺死。由于癌細胞的i類mhc表達也常減少或消失，因此這些細胞也可變得易被nk細胞殺死。感染的細胞還可在糖基化方面改變結(jié)合于mhc中的蛋白質(zhì)。如果這種情況發(fā)生，則細胞表達的mhc-i:蛋白質(zhì)復(fù)合物將改變。如果nk相關(guān)kir不能結(jié)合至這些“外來”復(fù)合物，則不能產(chǎn)生抑制信號，并且將進行溶解。

取決于kir亞型，所有確定的抑制性kir似乎與hla/mhc抗原的不同亞組相互作用。在人中，具有兩個ig域的kir(kir2d)識別hla-c同種異型：kir2dl2(原先稱為p58.2)和密切相關(guān)基因產(chǎn)物kir2dl3均識別由第1組hla-c同種異型(cw1、cw3、cw7和cw8)所共享的表位，而kir2dl1(p58.1)識別相應(yīng)第2組hla-c同種異型(cw2、cw4、cw5和cw6)所共享的表位。kir2dl1的特異性似乎由第2組hla-c等位基因的位置80上lys殘基的存在所決定。kir2dl2和kir2dl3識別似乎由位置80上asn殘基的存在所決定。相當(dāng)大部分hla-c等位基因在位置80上具有asn或lys殘基。一種具有三個ig域的kir(kir3dl1(p70))識別由hla-bw4等位基因所共享的表位。最后，具有三個ig域的分子的均二聚體kir3dl2(p140)識別hla-a3和hla-a11。

任一類型(活化或抑制性)的單個mhc-i-特異性nk細胞受體通常不與所有i類mhc分子相互作用，而特異性結(jié)合至某些同種異型(由單個基因座的不同變體編碼的蛋白質(zhì))。另外，單個nk細胞可以表達彼此獨立地起作用的多種不同的抑制性受體和/或活化受體。例如，在人中，單個個體體內(nèi)nk細胞間在存在或不存在給定kir方面有所不同。在人中也存在相對高程度的kir多態(tài)性，其中某些kir分子存在于一些個體體內(nèi)，但并非存在于所有個體體內(nèi)。雖然kir和其他識別mhc的抑制性受體可由nk細胞共同表達，但在任何給定個體的nk譜系中，通常存在表達單個kir的細胞；因此，該后一類型的nk細胞的相應(yīng)nk細胞活性僅由表達特異性mhc-i等位基因群組的細胞抑制。實際上，新近對群體內(nèi)kir基因型多樣性程度的評估表明<0.24％的無關(guān)個體可預(yù)期具有相同基因型。最常見白種人單純型“a”單純型(約47％至59％的出現(xiàn)率)僅含有一個活化kir基因(kir2ds4)和6個抑制性kir基因座(kir3dl3、kir2dl3、kir2dl1、kir2dl4、kir3dl1和kir3dl2)。剩余的“b”單純型極為不同并且含有2至5個活化kir基因座(包括kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3和kir2ds5)。

應(yīng)該指出的是，kir可稱作若干別名，如本文在表1中所反映，該表1包括自hugo基因命名委員會(hugogenenomenclaturecommittee)網(wǎng)站(http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/kir.html)和andre等，natureimmunol.2(8):661(2001)獲得的信息。

nkcir相關(guān)nk細胞抑制作用的中和

抗nkcir抗體另外或作為選擇可基于其阻斷或中和nk抑制作用并從而增強針對以其他方式阻斷的靶細胞的nk細胞活性的能力來表征。如上所述，在本發(fā)明上下文中可使用結(jié)合至至少一種nkcir足夠長時間以中和nkcir介導(dǎo)的對nk細胞的nk細胞毒性的抑制作用的抗nkcir抗體。此類抗nkcir抗體可以原生形式(例如，未綴合至細胞毒性劑)直接用作治療劑。本發(fā)明的更尤其有利的特征是與兩種或兩種以上nkcir交叉反應(yīng)并且中和與此類相關(guān)nkcir中的一些或所有(通常優(yōu)選所有)nkcir有關(guān)的抑制性活性的抗nkcir抗體。

中和抗nkcir抗體可部分或完全中和nkcir介導(dǎo)的對nk細胞的細胞毒性的抑制作用。中和是指對以其他方式存在的抑制信號的任何實質(zhì)阻斷?？赏ㄟ^任何合適的方法測量中和作用。在一個方面，對抑制作用的中和反映在中和抗kir抗體使nk與nk靶細胞的特定混合物中的nk細胞介導(dǎo)的特異性溶解相較于通常在基本相同的情形但不存在抗nkcir抗體的情況下出現(xiàn)的特異性溶解的量增加至少約20％、優(yōu)選至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約75％或75％以上(例如，約25％至100％)。當(dāng)通過例如與由nk細胞與未阻斷其相關(guān)nkcir的nk細胞的混合物(100％)以及nk細胞與nk靶細胞的混合物(其中nk靶細胞呈現(xiàn)nkcir的配體)(0％)獲得的鉻釋放毒性測試測定的結(jié)果比較來考慮抗nkcir抗體或其他抗體時，可測定該方面中的增加百分比。就抗kir抗體而言，可與由nk靶細胞與未阻斷其相關(guān)kir的nk細胞的混合物(100％)以及nk細胞與nk靶細胞的混合物(其中nk靶細胞呈現(xiàn)nk細胞上的抑制性kir的同源i類mhc分子)(0％)獲得的鉻釋放毒性測試測定的結(jié)果進行比較。在一個有利的方面，本發(fā)明提供抗nkcir抗體，其誘導(dǎo)在不存在此類抗nkcir抗體的情況下不會有效溶解的細胞溶解。或者，nkcir抑制性活性的中和可由例如鉻測定的結(jié)果來指示，該鉻測定使用表達一種或若干種抑制性nkcir(例如，kir、nkg2、nkg2a和lir(例如，lilrb1、lilrb5))的nk細胞克隆或轉(zhuǎn)染物以及僅表達一種由nk細胞上的一種nkcir所識別的配體(例如，hla多肽或等位基因、hla-e等)的靶細胞，其中在抗體存在下獲得的細胞毒性水平為在針對nkcir的配體的已知阻斷性抗體存在下所觀測到的細胞毒性的至少約20％，例如至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％或70％以上(例如，約25％至100％)。例如，當(dāng)測試抗kir抗體時，在基本相同情形下施用抗i類mhc分子，例如當(dāng)前可得自例如researchdiagnostics,flanders,nj，usa以及描述于例如shields等，tissueantigens.1998年5月；51(5):567-70中的w6/32抗i類mhc抗體。

評估nk細胞的細胞溶解活性的鉻釋放測定和其他方法為本領(lǐng)域已知。適用于此類測定的條件也是熟知的。通過以下進行典型鉻釋放測定：用na2⁵¹cro4標(biāo)記靶細胞(例如，cw3和/或cw4陽性細胞系，微量滴定板中約例如每孔5000個細胞)(以使⁵¹cr被活靶細胞吸收且由保留)，洗滌以移除過量放射性，之后在抗nkcir抗體存在或不存在的情況下以合適的效應(yīng)子:靶標(biāo)比率(例如，約4:1)暴露于nk細胞約4小時的時期，以及測量后續(xù)⁵¹cr水平，從而反映靶細胞死亡和溶解。此類測定的實例描述于例如moretta等，1993,jexpmed178,597-604中。在相似的測定中，可用³h-胸苷標(biāo)記增殖的靶細胞，其可并入復(fù)制的dna中。在nk細胞發(fā)揮細胞溶解作用后，靶細胞的dna快速斷裂并且保留于濾液中，而未斷裂的大dna可收集于過濾器上，因此可測量這些片段的釋放量或³h-胸苷于細胞dna中的保留量。關(guān)于此類測定的其他實例和相關(guān)論述可見于例如pct申請?zhí)杦o2006/072625中。

在另一方面，本發(fā)明提供抗nkcir抗體，其特征在于具有與交叉反應(yīng)性和/或中和性抗nkcir抗體競爭結(jié)合至同源nkcir的能力和/或與此類已知抗體結(jié)合至相同的抗原決定區(qū)/表位。術(shù)語“與……競爭”在提及特定單克隆抗體(例如，1-7f9等)時意指在使用重組nkcir分子或表面表達的nkcir分子的結(jié)合測定中抗nkcir抗體與參考抗體或其他分子競爭。例如，如果抗kir抗體在結(jié)合測定中可檢測地減少1-7f9結(jié)合至通常由1-7f9結(jié)合的kir分子，則該抗kir抗體可稱為與1-7f9“競爭”。與1-7f9“競爭”的抗kir抗體可與1-7f9競爭結(jié)合至kir2dl1人受體、kir2dl2/3人受體，或kir2dl1和kir2dl2/3人受體兩者。

雖然通常相關(guān)，但在與參考結(jié)合蛋白競爭方面相較于蛋白質(zhì)與參考蛋白結(jié)合至相同或基本相似表位的能力描述蛋白質(zhì)在一些情況下暗示顯著不同的生物學(xué)和物理化學(xué)特性。結(jié)合蛋白之間的競爭暗示測試抗nkcir抗體結(jié)合至與抗nkcir抗體所結(jié)合的表位至少部分重疊或位于與該表位足夠近的位置上以使該抗kir抗體因位阻而與已知抗nkcir抗體競爭的表位?？筺kcir抗體可以在不結(jié)合至相同或相似表位的情況下因抗體尺寸較大而與參考抗nkcir抗體競爭。這種競爭性抗nkcir抗體即使結(jié)合不同的抗原決定簇也可適用于阻斷與抗原決定區(qū)相關(guān)的相互作用，所述抗原決定區(qū)和參考抗nkcir抗體的抗原決定區(qū)相同。

在另一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗nkcir抗體，其與抗nckir抗體(例如1-7f9、df200和/或nkvsf1(針對kir)，或抗體z199(針對nkg2a，可得自beckmancoulter,ca)等)結(jié)合至基本相同的抗原決定區(qū)。

競爭是指在結(jié)合于結(jié)合配偶體的另一分子存在下，特定分子結(jié)合特定結(jié)合配偶體的傾向的任何顯著降低。通常，競爭意指在競爭性分子(例如，抗kir抗體)存在下，例如抗kir抗體與至少一種kir之間的結(jié)合減少至少約15％，例如結(jié)合減少至少約20％(例如，結(jié)合減少約25％或25％以上、約30％或30％以上、約15％至35％等)。在某些情形下，例如在屬于競爭性抗體的表位緊密地位于抗原中的情況下，競爭可由以下來指示：受體(例如，kir)結(jié)合約40％以上相對抑制、至少約50％抑制、至少約55％抑制、至少約60％抑制、至少約75％抑制或更高程度的抑制，例如，約45％至95％的抑制程度。

評估競爭通常涉及使用第一量的第一分子(例如，抗kir抗體)；第二量的第二分子(例如，已知的抗kir抗體)；以及第三量的第三分子(例如，kir)評估相對抑制性結(jié)合，其中第一量、第二量以及第三量均足以使得比較得以進行以提供關(guān)于相關(guān)分子相對于提供的其他分子的選擇性和/或特異性的信息。通常，對于elisa競爭測定，使用約5-50μg(例如，約10-50μg、約20-50μg、約5-20μg、約10-20μg等)的抗kir抗體、已知的抗kir抗體以及至少一種kir評估是否存在競爭。條件也應(yīng)適于使競爭性分子結(jié)合至其假定/已知靶標(biāo)。生理條件或接近生理條件(例如，約20-40℃的溫度、約7-8的ph值等)可通常適用于抗kir抗體：kir。

可通過使用免疫測定來測定兩個或兩個以上分子之間的競爭(或相對結(jié)合抑制)，在所述免疫測定中，將對照nkcir結(jié)合分子(例如，1-7f9)與測試抗nkcir抗體混合(或預(yù)先吸附)并且施加于含有相關(guān)kir(例如kir2dl1和kir2dl2/3兩者)的樣本中，已知所述kir的每一個由df200結(jié)合。基于elisa、放射免疫測定、western印跡等的方案適用于此類競爭研究。通常在適用于分子結(jié)合的條件(例如，生理條件，尤其在抗體結(jié)合構(gòu)象/非線性表位的情況下)下進行競爭elisa。競爭也可通過例如流式細胞術(shù)測試、spr分析和其他技術(shù)來評估，此類技術(shù)見于例如harlow等，antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1988)，colligan等編著，currentprotocolsinimmunology,greenepublishingassoc.andwileyinterscience,n.y.,(1992,1993)，ausubel等編著，shortprotocolsinmolecularbiology(第5版)，johnwiley&sons(2002)，以及muller,meth.enzymol.92:589-601(1983)中。

可由多種已知技術(shù)鑒別抗原決定區(qū)或表位。例如，可通過“足跡”測定，例如通過化學(xué)修飾靶標(biāo)nkcir蛋白質(zhì)中暴露的胺/羧基快速鑒別抗原決定區(qū)。該足跡技術(shù)的一個具體實例為使用通過質(zhì)譜(hxms)檢測的氫-氘交換，其中受體與配體蛋白質(zhì)酰胺質(zhì)子進行氫/氘交換，結(jié)合并進行反向交換，其中參與蛋白質(zhì)結(jié)合的主鏈酰胺基受保護而免于反向交換并因此將保持氘化。此時可通過消化蛋白質(zhì)水解(pepticproteolysis)、快速微孔高效液相色譜分離和/或電噴霧電離質(zhì)譜鑒別相關(guān)區(qū)域。參見例如，ehringh,analyticalbiochemistry，第267(2)卷第252-259頁(1999)和/或engen,j.r.和smith,d.l.(2001)anal.chem.73,256a-265a。

合適的表位鑒別技術(shù)的另一個實例為核磁共振(nmr)表位定位，其中通常比較游離抗原和與抗原結(jié)合肽(例如抗體)復(fù)合的抗原的二維nmr譜中信號的位置。通常用¹⁵n選擇性同位素標(biāo)記抗原，以使在nmr譜中僅可見到對應(yīng)于抗原的信號而不可見來自抗原結(jié)合肽的信號。源自涉及與抗原結(jié)合肽相互作用的氨基酸的抗原信號在復(fù)合物的譜中通常相較于在游離抗原的譜移動位置，并且涉及結(jié)合的氨基酸可以所述方式鑒別。參見例如，ernstscheringresfoundworkshop.2004；(44):149-67；huang等，journalofmolecularbiology，第281(1)卷第61-67頁(1998)；以及saitoandpatterson,methods.1996年6月；9(3):516-24。

也可使用質(zhì)譜法進行表位定位/表征。參見例如，downward,jmassspectrom.2000年4月；35(4):493-503以及kiselar和downard，analchem.1999年5月1日；71(9):1792-801。

在表位定位和鑒別的情況下也可使用蛋白酶消化技術(shù)?？赏ㄟ^蛋白酶消化，例如通過在37℃和ph7-8下以約1:50的比率使用胰蛋白酶對nkcir進行隔夜消化，繼而進行質(zhì)譜(ms)分析以用于肽鑒別來確定抗原決定簇相關(guān)區(qū)域/序列。隨后可通過比較進行胰蛋白酶消化的樣本和與抗體一起孵育并接著由例如胰蛋白酶進行消化(從而揭露結(jié)合子的足跡)的樣本，來鑒別由抗nkcir結(jié)合子保護而免于胰蛋白酶裂解的肽。其他酶(如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等)也或作為選擇可用于類似表位表征方法中。此外，酶促消化可提供在未表面暴露并且因此在抗原性方面很可能不相關(guān)的抗nkcir多肽的情況下分析潛在抗原決定簇序列是否處于nkcir的區(qū)域內(nèi)的快速方法。關(guān)于對類似技術(shù)的論述，參見例如manca,annistsupersanita.1991；27(1):15-9。

各種噬菌體展示技術(shù)也可用于鑒別表位。參見例如wang和yu，currdrugtargets.2004年1月；5(1):1-15；burton,immunotechnology.1995年8月；1(2):87-94；cortese等，immunotechnology.1995年8月；1(2):87-94；以及irving等，curropinchembiol.2001年6月；5(3):314-24。共同表位也可通過改性噬菌體展示相關(guān)技術(shù)來鑒別(參見mumey等，j.comput.biol.10:555–567和mumey,proceedingsofthesixthannualinternationalconferenceoncomputationalmolecularbiology(recomb-02)，第233–240頁(acmpress,newyork))(關(guān)于論述，還可參見bailey等，proteinscience(2003),12:2453-2475；dromey等，jimmunol.2004年4月1日；172(7):4084-90；parker等，molbiotechnol.2002年1月；20(1):49-62；以及czompoly等，biochembiophysrescommun.2003年8月8日；307(4):791-6)。

通過兩種kir結(jié)合分子(其中一者經(jīng)生物素化(例如，已知抗kir抗體)或以其他方式經(jīng)類似標(biāo)記)競爭性結(jié)合至kir來進行表位定位為另一種鑒別相關(guān)抗原決定區(qū)的方法。

其他可能有助于定位表位的方法包括結(jié)晶學(xué)技術(shù)、x射線衍射技術(shù)(例如由poljak和其他人在二十世紀(jì)70年代至80年代研發(fā)的x射線衍射/序列研究技術(shù))，以及應(yīng)用多針肽合成技術(shù)。

基于計算機的方法(例如序列分析以及三維結(jié)構(gòu)分析和對接)也可用于鑒別抗原決定簇。例如，也可通過使用nkcir或其部分的結(jié)構(gòu)在對接個別mab的fab片段的結(jié)構(gòu)的情況下進行分子建模來確定表位。必要時，可通過使用程序(例如分子操作環(huán)境molecularoperatingenvironment(moe)，其可得自chemicalcomputinggroup(montreal,quebec,canada-www.chemcomp.com)以經(jīng)結(jié)構(gòu)表征的nkcir進行同源性建模來得到nkcir的模型。這些和其他定位方法論述于epitopemappingapracticalapproach(westwood和hay編著)2001oxforduniversitypress(還可參見cason,jvirolmethods.1994年9月；49(2):209-19)。

抗kir抗體的特征

有利的抗kir抗體可基于功能特征，尤其相對于其交叉反應(yīng)或交叉結(jié)合一種以上kir(例如一種以上類型的抑制性kir)的能力和/或有效中和nk抑制信號的能力進行分類。本發(fā)明涵蓋使用抗kir抗體或抗kir抗體的組合的治療。示例性抗kir抗體包括但不限于抗kir2dl1抗體和抗kir2dl2抗體，或抗kir2dl1抗體和抗kir2dl3抗體，或抗kir2dl1抗體和抗kir2dl2抗體和抗kir2dl3抗體，或結(jié)合至少兩種不同人抑制性kir受體基因產(chǎn)物并且能夠在表達兩種不同人抑制性kir受體中的至少一者的nk細胞中中和kir介導(dǎo)的對nk細胞毒性的抑制作用的抗kir抗體，或抗kir2d抗體和抗kir3d抗體。

有效結(jié)合至一種以上類型的kir的抗kir抗體為本發(fā)明的尤其有利的特征。在一個特定示例性方面，本發(fā)明提供結(jié)合至nk細胞表面上的至少兩種抑制性kir受體的抗kir抗體。在一個甚至更特定的示例性方面，本發(fā)明提供結(jié)合人kir2dl受體的共同抗原決定區(qū)的抗kir抗體。在另一個甚至更特定的方面，本發(fā)明提供結(jié)合至kir2dl1、kir2dl2和kir2dl3受體的抗kir抗體。

術(shù)語“kir2dl2/3”可用于指kir2dl2和kir2dl3受體中的任一者或兩者。這兩種受體具有極高同源性，為同一基因的等位基因形式，并且被本領(lǐng)域視作在許多方面可互換。因此，kir2dl2/3在某些方面可視作單個抑制性kir分子。雖然與kir2dl2/3交叉反應(yīng)的抗kir抗體在本發(fā)明范圍內(nèi)，但kir結(jié)合分布僅包括kir2dl2和kir2dl3的抗kir抗體不視作具有“交叉反應(yīng)性”。

由于kir2dl1或kid2dl2/3中的至少一者存在于至少約90％的人群體中，所以kir2dl1-kir2dl2/3交叉反應(yīng)性抗kir抗體可促進或增強nk針對大部分hla-c同種異型相關(guān)細胞(分別為第2組hla-c同種異型和第1組hla-c同種異型)的活性。在治療和/或診斷大部分人個體中可使用包含具有此類交叉反應(yīng)性的單個kir抗體的組合物，從而不需要對患者進行遺傳識別并且減少施用至患者以確保有效結(jié)果所需的不同抗體的量。

交叉反應(yīng)性抗kir抗體可具有任何適合的組成并且可通過多種合適的技術(shù)獲得。例如，交叉反應(yīng)性抗kir抗體可包含結(jié)合至不同kir的多種kir配體和/或抗kir抗體序列，其可以通過綴合、多聚化或(就肽配體而言)通過包含于融合蛋白中而締合于一起。在另一方面，提供抗kir抗體，其包含來自交叉反應(yīng)性抗kir抗體的抗kir抗體序列。

可獲得或產(chǎn)生kir結(jié)合序列的交叉反應(yīng)性抗kir抗體為已知的。該抗體的實例描述于例如watzl等，tissueantigens,56，第240頁(2000)中。另一個實例為抗體nkvsf1(也稱為pan2dmab；識別cd158a(kir2dl1)、cd158b(kir2dl2)和p50.3(kir2ds4)的共同表位)，其具有示于例如pct專利申請wo2006/003179(innatepharma；novonordisk；universityofgenoa)的圖15中的可變區(qū)和cdr序列。與kir家族的各種成員(包括kir2dl1和kir2dl2/3)反應(yīng)的單克隆抗體df200為該交叉反應(yīng)性抗體的另一個實例。產(chǎn)生df200的雜交瘤已以標(biāo)識號“df200”、注冊號cncmi-3224(在2004年6月10日注冊)寄存于cncm菌種中心(collectionnationaledeculturesdemicroorganismes,institutpasteur,25,ruedudocteurroux,f-75724pariscedex15,france)?？僧a(chǎn)生若干其他單克隆抗體并且證明為交叉反應(yīng)性抗kir抗體。其他實例為wo2006/003179中所述的抗體1-7f9和1-4f1。

交叉反應(yīng)性抗kir抗體可對其所結(jié)合的兩種或兩種以上kir具有任何合適的親和力和/或親合力。親和力是指抗kir抗體或其他抗原結(jié)合蛋白結(jié)合至表位或抗原決定簇的強度。通常，以解離常數(shù)kd測量親和力，該解離常數(shù)定義為[ab]×[ag]/[ab-ag]，其中[ab-ag]為抗體-抗原復(fù)合物的摩爾濃度，[ab]為未結(jié)合的之抗體的摩爾濃度，并且[ag]為未結(jié)合抗原的摩爾濃度。親和力常數(shù)ka由1/kd定義。適用于通過競爭抑制、平衡透析等確定結(jié)合肽特異性和親和力的方法可見于例如harlow等，antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1988)；colligan等編著，currentprotocolsinimmunology,greenepublishingassoc.andwileyinterscience,n.y.,(1992,1993)以及muller,meth.enzymol.92:589-601(1983)中。

通常，本發(fā)明提供的抗kir抗體對至少一種kir具有約10⁴至約10¹⁰m^-1(例如，約10⁷至約10⁹m^-1)范圍內(nèi)的親和力。本文中的術(shù)語免疫反應(yīng)通常是指抗kir抗體以低于約10^-4m的解離常數(shù)kd結(jié)合至kir。例如，在一個特定方面，本發(fā)明提供抗kir抗體，其相對于kir2dl1和kir2dl2/3的平均解離常數(shù)(kd)為約7×10^-9m或更大，如由例如表面等離子共振(spr)篩選(例如通過以biacore^tmspr分析裝置進行分析)所測定。在一個更特定的示例性方面，本發(fā)明提供抗kir抗體，其對于kir2dl2/3的kd為約2×10^-9m(例如，約0.1–4×10^-9m)或更大，并且對于kir2dl1的kd為約11×10^-9m(例如，約7-15×10^-9m)或更大。

可通過本文別處所述的任何方法或其在本領(lǐng)域中的已知等效方法來測定親和力。可用于測定親和力的一種方法的實例提供于munson&pollard,anal.biochem.107:220(1980)的斯卡查德分析中。結(jié)合親和力也可以通過平衡法(例如，elisa或放射免疫測定(ria))或動力學(xué)分析(例如biacore^tm分析)來測定。

抗kir抗體的特征還或作為選擇可在于以下列解離常數(shù)顯示kir結(jié)合：小于約100nm、小于約50nm、小于約10nm、約5nm或更小、約1nm或更小、約0.5nm或更小、約0.1nm或更小、約0.01nm或更小或甚至約0.001nm或更小。

親合力是指結(jié)合蛋白與抗原之間總相互作用的總強度(例如，抗kir抗體與kir之間相互作用的總強度)。親和力為抗體或其他結(jié)合肽上的單個抗原結(jié)合位點與單個表位或抗原決定簇之間總的非共價相互作用的強度。親合力通常取決于三個主要因素：結(jié)合蛋白對其所結(jié)合的表位或抗原決定簇的固有親和力、抗體或結(jié)合蛋白和抗原的效價(例如，效價為3、4或更大的抗kir抗體相較于二價抗體對抗原通常顯示出更高程度的親合力，并且二價抗體相較于單價抗體對抗原具有更高親合力，尤其在抗原中存在重復(fù)的表位的情況下)和/或相互作用組分的幾何排列。親合力通常由與用于評估親和力的技術(shù)相同類型的技術(shù)來測量。

在另一個方面，本發(fā)明提供與來自兩種或兩種以上物種的kir交叉反應(yīng)的抗kir抗體。例如，在一個方面，本發(fā)明提供與人和食蟹獼猴的kir交叉反應(yīng)的抗kir抗體。在一個特定方面，本發(fā)明提供與至少兩種人kir交叉反應(yīng)并且也結(jié)合至食蟹獼猴的nk細胞的抗kir抗體。此類抗kir抗體可包含來自或源自顯示該交叉反應(yīng)性概況的抗體nkvsf1的序列。必要時，可在食蟹獼猴中對此類抗kir抗體進行毒性測試和其他可用的研究。

可與多種kir交叉反應(yīng)的抗體可用于本發(fā)明的組合組合物和方法中。此類抗體的示例性交叉反應(yīng)性概況包括抗體與kir2dl1+2dl2/3交叉反應(yīng)、與3dl1+3dl2交叉反應(yīng)、與2dl1(和2dl2/3)+2ds4交叉反應(yīng)，以及與2dl1(和2dl2/3)交叉反應(yīng)但不與2ds4交叉反應(yīng)。

因此，例如，本發(fā)明方法或組合物可包含如例如wo2005003168中所述結(jié)合kir2dl1、kir2dl2和kir2dl3并且減少或阻斷kir介導(dǎo)的對nk細胞的細胞毒性的抑制作用的抗kir抗體。

適用于本發(fā)明組合方法和組合物中的示例性抗kir抗體包括如下抗kir抗體，其包含對應(yīng)于抗kir抗體df200的vl區(qū)或基本上由該vl區(qū)組成(為基本相似的并且保持相似的結(jié)合分布和親和力)的vl區(qū)，或與df200的vl序列高度相似(例如具有至少約90％同一性或95％一性)的vl序列/域。df200的vl序列示于wo2006/3179中。此類抗kir抗體也可以或者定義為包含df200的輕鏈可變cdr的集合(也示于wo2006/3179中)。此類抗體通常也包含df200的vh域或高度相似的序列(例如，與df200vh域具有高度同一性或者基本上由該序列組成的序列)或df200的至少重鏈可變cdr(示于wo2006/3179中)。

如本文所用，術(shù)語“序列同一性百分比”或“序列同一性”是指兩個序列之間的同一性百分比，其是考慮間隙數(shù)目和各間隙長度下，序列所共有的相同位置數(shù)目的函數(shù)，即％同源性＝相同位置數(shù)目/總位置數(shù)目×100，其中需要引入所述間隙以最理想地比對兩個序列?？墒褂萌缦挛姆窍拗菩詫嵗兴龅臄?shù)學(xué)算法來比較序列并且測定兩個序列之間的同一性百分比。

可使用e.myers和w.miller(comput.appl.biosci.,4:11-17(1998))的算法(其已并入align程序(2.0版)中)，使用pam120權(quán)數(shù)殘基表、間隙長度罰分12和間隙罰分4來測定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比。另外，可使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453(1970))的算法(已并入gcg軟件包中的gap程序中)(可得自www.gcg.com)，使用blossum62矩陣或pam250矩陣和間隙權(quán)數(shù)16、14、12、10、8、6或4以及長度權(quán)數(shù)1、2、3、4、5或6來測定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比。

在某些情況下，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可進一步用作“查詢序列”以針對公開數(shù)據(jù)庫進行搜索，以例如鑒別相關(guān)序列?？墒褂胊ltschol等，(1990)j.mol.biol.215:403-10的xblast程序(2.0版)進行此類搜索?？梢詘blast程序(得分＝50、字長＝3)進行blast蛋白質(zhì)搜索以獲得與本發(fā)明抗體同源的氨基酸序列。為出于比較目的獲得間隙比對，可如altschul等，(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402中所述使用間隙blast。當(dāng)使用blast和間隙blast程序時，可使用各自程序(例如，xblast和nblast)的默認參數(shù)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

在另一個示例性方面，本發(fā)明的組合組合物或方法包括如下抗kir抗體，其包含對應(yīng)于抗體1-7f9的vh和vl序列(示于wo2006/3179中)或與抗體1-7f9的vh和vl序列高度相似(例如，基本上由其組成)或至少包含1-7f9的vl和vhcdr的vh和vl序列。

與交叉反應(yīng)性和/或中和性抗kir抗體競爭

在另一個方面，本發(fā)明方法或組合物的特征在于包含與這些抗體中的一者或并入本文中的參考文獻中所述的其他抗kir抗體中的一者(例如，1-7f9)競爭的抗kir抗體。

與示例性抗kir抗體(例如df200、1-7f9和/或nkvsf1)競爭的抗體可使用已知的篩選分析法來鑒別。多種此類測定按常規(guī)實踐并且為本領(lǐng)域中所熟知(參見例如，美國專利號5,660,827，其以引用方式并入本文中)?；诶鏴lisa、放射免疫測定、western印跡法以及使用biacore分析的方案適用于此類競爭研究中。

可例如預(yù)先混合對照抗體(例如，df200、nkvsf1或1-7f9)與不同量的測試抗體(例如，以約1:1、1:2、1:10或約1:100的比率)一段時期，之后施加于kir抗原樣本中?；蛘?，可在暴露于kir抗原樣本期間簡單地單獨添加并且混合對照物和不同量的測試抗體。只要可區(qū)分結(jié)合抗體與游離抗體(例如，通過使用分離或洗滌技術(shù)以消除未結(jié)合的抗體)以及對照抗體與測試抗體(例如，通過使用物種特異性或同種型特異性二抗或通過以可檢測標(biāo)記特異性標(biāo)記對照抗體)，即能夠確定測試抗體是否降低對照抗體與不同kir2dl抗原的結(jié)合，指示測試抗體與對照物識別基本相同的表位。(經(jīng)標(biāo)記)對照抗體在完全無關(guān)抗體(其不結(jié)合kir)存在下的結(jié)合可用作對照高值。對照低值可通過將經(jīng)標(biāo)記的對照抗體與相同但未標(biāo)記的對照抗體一起孵育而獲得，其中將出現(xiàn)競爭并且減少經(jīng)標(biāo)記抗體的結(jié)合。在測試測定中，經(jīng)標(biāo)記抗體反應(yīng)性在測試抗體存在下顯著降低則指示測試抗體識別基本相同的表位，即其與經(jīng)標(biāo)記的對照抗體競爭。例如，在對照抗體:測試抗體介于約1:1或1:10和約1:100之間的任何比率下使對照抗體與kir2dl1和kir2dl3抗原中的一者或兩者的結(jié)合減少至少約50％、例如至少約60％、或更優(yōu)選地至少約70％(例如，約65％至100％)的任何測試抗體即視為與對照物競爭的抗體。

也可通過例如流式細胞術(shù)評估競爭。在該測試中，可首先將具有給定kir的細胞與對照抗體一起孵育，然后與用熒光染料或生物素標(biāo)記的測試抗體一起孵育。如果在與飽和量的對照抗體一起預(yù)孵育后所獲得的結(jié)合為在未與對照抗體一起預(yù)孵育下由測試抗體所獲得的結(jié)合(如通過熒光量測)的約80％、優(yōu)選約50％、約40％或更小(例如約30％)，則稱抗體與對照抗體競爭?；蛘?，如果由經(jīng)標(biāo)記對照抗體(通過熒光染料或生物素標(biāo)記)在與飽和量的測試抗體一起預(yù)孵育的細胞上所獲得的結(jié)合為在未與測試抗體一起預(yù)孵育的情況下所獲得的結(jié)合的約80％、優(yōu)選約50％、約40％或更小(例如約30％)，則稱抗體與對照抗體競爭。

也可有利地使用簡易競爭分析法，其中預(yù)先吸附測試抗體并且以飽和濃度施加于上面固定有kir2dl1或kir2dl2/3或兩者的表面上。簡易競爭分析法中的表面優(yōu)選地為biacore芯片(或其他適用于表面等離子共振分析的介質(zhì))。測量對照抗體與涂有kir的表面的結(jié)合。將該單獨對照抗體與含有kir的表面的結(jié)合與對照抗體在測試抗體存在下的結(jié)合相比較。在測試抗體存在下對照抗體與含有kir2dl1和kir2dl2/3的表面的結(jié)合顯著減少指示測試抗體與對照抗體識別基本相同的表位，因此測試抗體與對照抗體“競爭”。任何使對照抗體與kir2dl1和kir2dl2/3抗原兩者的結(jié)合減少至少約20％或更多、至少約40％、至少約50％、至少約70％或更多的測試抗體即可視為與對照抗體競爭的抗體。優(yōu)選地，該測試抗體將使對照抗體與至少kir2dl1、kir2dl2和kir2dl3抗原中的每一者的結(jié)合減少至少約50％(例如，至少約60％、至少約70％或更多)。應(yīng)當(dāng)理解，可顛倒對照抗體與測試抗體的次序；即，在競爭測定中可首先使對照抗體結(jié)合至表面，然后使測試抗體與表面接觸。優(yōu)選地，首先使對kir2dl1和kir2dl2/3抗原具有較高親和力的抗體結(jié)合至含有kir2dl1和kir2dl2/3的表面，因為對于第二抗體所觀測到的結(jié)合減少(假定所述抗體互相競爭)預(yù)期將有較大量值。此類測定的其他實例提供于本文實例中，以及例如saunal和regenmortel，(1995)j.immunol.methods183:33-41中，其公開內(nèi)容以引用方式并入本文中。

在另一個方面，本發(fā)明方法或組合物的特征在于僅包括不與一種以上kir交叉反應(yīng)的抗體。例如，僅對kir2dl1具有特異性的單克隆抗體已顯示出可阻斷kir2dl1和hla-cw4同種異型，以及與cw4屬于同一組的相似hla-c同種異型之間的相互作用(moretta等，jexpmed.1993；178(2):597-604；其公開內(nèi)容以引用方式并入本文中)。在另一個實例中，針對kir2dl2/3的單克隆抗體也已經(jīng)描述可阻斷kir2dl2/3與hlacw3(或其類似物)同種異型之間的相互作用(moretta等，1993，同上)。任選地，抗體可選自：gl183(kir2dl2/3/s2-特異性，可得自immunotech,france和becktondickinson,usa)；eb6(kir2dl1/s1-特異性，可得自immunotech,france和becktondickinson,usa)；az138(kir3dl1-特異性，可得自moretta等，univ.genova,italy)；q66(kir3dl2-特異性，可得自immunotech,france)；以及dx9、z27(kir3dl1-特異性，可得自immunotech,france和becktondickinson,usa)。

表位

在其他方面，本發(fā)明提供抗針對各種kir上存在的特定抗原區(qū)和/或表位的抗kir抗體。在一個示例性方面，本發(fā)明提供抗kir抗體，其在由選自以下氨基酸殘基的一個或多個所限定的區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合kir2dl1：氨基酸殘基105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181和192。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明提供抗kir抗體，其在由選自以下氨基酸殘基的一個或多個所限定的區(qū)域內(nèi)特異性結(jié)合至kir2dl1和kir2dl2/3：氨基酸殘基105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181和192。

在另一個方面，本發(fā)明提供抗kir抗體，其結(jié)合至kir2dl1，但以相對顯著降低的結(jié)合親和力(為對kir2dl1所顯示親和力的約20％或更小、約30％或更小、約40％或更小、約50％或更小、約60％或更小、約70％或更小等)結(jié)合至其中r131為ala的kir2dl1突變體。在另一個方面，本發(fā)明提供抗kir抗體，其結(jié)合至kir2dl1，但以相對降低的結(jié)合親和力(為對kir2dl1所顯示親和力的約20％或更小、約30％或更小、約40％或更小、約50％或更小、約60％或更小、約70％或更小等)結(jié)合至其中r157為ala的kir2dl1突變體。在另一個方面，本發(fā)明提供抗kir抗體，其結(jié)合至kir2dl1，并以相對降低的結(jié)合親和力(為對kir2dl1所顯示親和力的約20％或更小、約30％或更小、約40％或更小、約50％或更小、約60％或更小、約70％或更小等)結(jié)合至其中r158為ala的kir2dl1突變體。

在另一個方面，本發(fā)明提供結(jié)合至kir2dl1殘基131、157和158的抗kir抗體。

在另一個方面，本發(fā)明提供結(jié)合至kir2ds3(r131w)但不結(jié)合至野生型kir2ds3的抗kir抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供結(jié)合至kir2dl1和kir2dl2/3以及kir2ds4的抗kir抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供結(jié)合至kir2dl1和kir2dl2/3兩者但不結(jié)合至kir2ds4的抗kir抗體。

為說明抗kir抗體序列在抗kir抗體的組成和構(gòu)造中的用途，此處將描述示例性抗kir抗體序列和抗體序列變體。示例性kir抗體df200和1-7f9的可變區(qū)和cdrs的氨基酸和核酸序列還公開于pct申請?zhí)杦o2006/003179中，該專申請的公開內(nèi)容以引用方式并入本文中。

在一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-l1序列：lysalaserglnasnvalvalthrtyrvalser(seqidno:43)。在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-l1：thralaserserservalsersersertyrleutyr(seqidno:44)。

在另一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其也或作為選擇包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-l2序列：glyalaserasnargtyrthr(seqidno:45)。在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其也或作為選擇包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-l2：序列serthrserasnleualaser(seqidno:46)。

在另一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其也或作為選擇包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-l3：glyglnglytyrsertyrphetyrthr(seqidno:47)。在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其也或作為選擇包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-l3：hisglntyrhisargserproprothr(seqidno:48)。

作為另一個示例性特征，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-h1：glypheserphethrphetyrglyvalhis(seqidno:49)。

在另一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-h2：valiletrpserglyglyasnthrasptyrasnalaalapheileser(seqidno:50)。

在另一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-h3：asnproargproglyasntyrprotyrglymetasptyr(seqidno:51)。

在一個不同方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-h1：glytyrthrphethrsertyrtrpmethis(seqidno:52)。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-h2：thriletyrproglyasnseraspthrasntyrasnglnlysphelysgly(seqidno:53)。

本發(fā)明的另一個方面具體實施為一種抗kir抗體，其包含由以下序列組成或基本上由以下序列組成的cdr-h3：prothrthralathrargserseralametasptyr(seqidno:54)。

這些cdr序列的基本和新型特性為與其他必要的cdr和fr序列組合結(jié)合至一種或多種kir上呈現(xiàn)的表位的能力。如上所述，此類序列中的某些殘基可能幾乎不或完全不促成kir表位結(jié)合。此外，此類cdr序列也或作為選擇可能容許一處或幾處插入而基本不影響其表位結(jié)合特征(特異性和/或親和力)。然而，在本發(fā)明的另一方面，可使此類序列顯著變化以產(chǎn)生可用的變異體。此類變化進一步論述于下文中。

這些示例性cdr序列可彼此組合、與下文所述的變體cdr序列或其他抗kircdr(通常來自kir結(jié)合性抗kir抗體)組合。在一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含選自以下的大部分或所有cdr序列：seqidnos:43、45、47、49、50和51。

在另一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗體，其包含基本上由以下序列組成的輕鏈可變區(qū)(vl)序列：metgluserglnthrleuvalpheileserileleuleutrpleutyrglyalaaspglyasnilevalmetthrglnserprolyssermetsermetservalglygluargvalthrleuthrcyslysasnsergluasnvalvalthrtyrvalsertrptyrglnglnlysprogluglnserprolysleuleuiletyrglyalaserasnargtyrthrglyvalproaspargphethrglyserglyseralathraspphethrleuthrileserservalglnalagluaspleualaasptyrhiscysglyglnglytyrsertyrprotyrthrpheglyglythrlysleuaspilelysarg(seqidno:55)。該序列的基本和新型特性在于其促成kir結(jié)合。此序列中有可能缺失、添加或取代一些氨基酸而基本不影響此類特性。

在另一個示例性方面，本發(fā)明提供一種抗體，其包含基本上由以下序列組成的vl序列：metasppheglnvalglnilepheserpheleuleuileseralaservalilemetserargglyglnilevalleuthrglnserproalasermetseralaserleuglygluargvalthrmetthrcysthralaserserservalsersersertyrleutyrtrptyrglnglnlysproglyserserprolysleutrpiletyrserthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglnalagluaspalaalathrtyrtyrcyshisglntyrhisargserproprothrpheglyglyglythrlysleugluilelysarg(seqidno:56)。

如果序列呈現(xiàn)于適當(dāng)情況下，則seqidno:55和seqidno:56兩者的n端部分在合適的宿主細胞中可裂解(例如，seqidno:55的約前23個氨基酸在充當(dāng)vl序列(在其為相關(guān)肽的全部內(nèi)含物或表示肽的暴露的n端部分的情況下)的信號序列之后可裂解)。因此，本發(fā)明也提供抗kir抗體，其包含基本上由seqidno:55和seqidno:56的n端截短形式(例如，其中其n端部分的約20個氨基酸已經(jīng)移除)組成的vl序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其也或作為選擇包含基本上由以下序列組成的重鏈可變區(qū)(vh)序列：metalavalleuglyleuleuphecysleuvalthrpheprosercysvalleuserglnvalglnleugluglnserglyproglyleuvalglnproserglnserleuserilethrcysthrvalserglypheserphethrprotyrglyvalhistrpvalargglnserproglylysglyleuglutrpleuglyvaliletrpserglyglyasnthrasptyrasnalaalapheileserargleuserileasnlysaspasnserlysserglnvalphephelysmetasnserleuglnvalasnaspthralailetyrtyrcysalaargasnproargproglyasntyrprotyrglymetasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalserser(seqidno:57)。此序列的前20個氨基酸殘基可充當(dāng)由此序列組成或基本上由此序列組成的肽或位于適當(dāng)情況下的包含此序列的蛋白質(zhì)鏈的信號序列。因此，本發(fā)明也提供一種抗kir抗體，其包含基本上由seqidno:57缺少其約前1至20個殘基的片段組成的vh序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其也或作為選擇包含基本上由以下序列組成的重鏈可變區(qū)(vh)序列：metglucysasntrpileleupropheileleuservalthrserglyvaltyrsergluvalglnleuglnglnserglythrvalleualaargproglyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrtrpmethistrpmetlysglnargproglyglnglyleuglutrpileglythriletyrproglyasnseraspthrasntyrasnglnlysphelysglylysalalysleuthralavalthrserthrasnthralatyrmetgluleuserserleuthrasngluaspseralavaltyrtyrcysserargprothrthralathrargserseralametasptyrtrpglyglnglythrservalthrvalserser(seqidno:58)。此序列的前20個氨基酸殘基可充當(dāng)由此序列組成或基本上由此序列組成的肽或位于適當(dāng)情況下的包含此序列的蛋白質(zhì)鏈的信號序列。因此，本發(fā)明也提供一種抗kir抗體，其包含基本上由seqidno:58缺少其約前1至20個殘基的片段組成的vh序列。

在一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含基本上由seqidno:55或其n端截短部分組成的vl序列和基本上由seqidno:57或其n端截短部分組成的vh序列。

如已提及，抗原結(jié)合性抗體序列(例如抗kir抗體序列)的合適序列變體可并入本發(fā)明的抗體中。在大部分類型的抗體序列中進行變型可為合適的。因此，例如，抗kir抗體可包含變體恒定序列和/或變體構(gòu)架序列。

在一個方面，本發(fā)明提供一種抗kir抗體，其包含一個或多個變體cdr序列(即，與類似野生型cdr序列不同之處在于一處或多處相對于其野生型相關(guān)序列影響序列的生物學(xué)和/或物理化學(xué)特性的氨基酸插入、缺失、添加和/或取代的cdr序列)。參見例如，pct申請?zhí)杦o2006/072625中公開的技術(shù)。cdr、vh和vl序列變體可分別與一個或多個“親本”cdr、vh和vl序列(例如抗kirmabdf200和/或抗kirmabnkvsf1的cdr、vh和vl序列)顯示出任何適合程度的同一性。通常，與親本序列結(jié)合至基本相同抗原決定區(qū)的變體序列將與親本序列保持至少約40％氨基酸序列同一性，例如與親本序列保持約50％或50％以上、約60％或60％以上、約70％或70％以上、約75％或75％以上、約80％或80％以上、約85％或85％以上、約90％或90％以上或至少約95％(例如，約45％至99％、約55％至99％或約65％至99％)同一性。然而，在一些情況下，尤其相對于靶向基本上相同的表位的cdr序列，具有甚至較低程度的同一性的變體可為合適的。

結(jié)合至不同抗原決定區(qū)或抗原決定區(qū)的不同集合(或“分布”)的cdr、vh和vl序列變體也可通過本文別處所述的任何技術(shù)(合理設(shè)計、誘發(fā)、定向進化等)而產(chǎn)生。在這種情況下，可預(yù)期與親本序列的氨基酸序列同一性程度顯著較低。例如，在cdr-l1、cdr-h1、cdr-h2或cdrh3變體與親本序列具有不同表位結(jié)合分布的情況下，促進nkcamr(例如kir)結(jié)合的變體與親本cdr序列可能僅顯示約20％至30％氨基酸序列同一性。

pct申請?zhí)杦o2006/072625進一步提供抗kir抗體序列的變體，其包括cdr和可變區(qū)序列的特定結(jié)構(gòu)式，該申請的公開內(nèi)容以引用方式并入本文中。

通常，變體主要因保守性取代而與“親本”序列有所不同；變體中例如至少約35％、約50％或50％以上、約60％或60％以上、約70％或70％以上、約75％或75％以上、約80％或80％以上、約85％或85％以上、約90％或90％以上、約95％或95％以上(例如，約65％至99％)的取代為保守性氨基酸殘基置換。在本發(fā)明的上下文中，保守性取代可由pct專利申請?zhí)杦o2006/072625(novonordiskas和innatepharmasa)的表4、5和6中的一者或多者中所反映的氨基酸類別內(nèi)的取代所限定。以引用方式并入本文中的pct申請?zhí)杦o2006/072625還描述了其他保守性取代分組；通過選擇保守性較低的取代使功能實質(zhì)改變；可用于設(shè)計和選擇肽變體的原理；在親水/親水性特性方面保守；使變體肽的結(jié)構(gòu)維持基本類似于親本肽的結(jié)構(gòu)，包括在保守性取代、親水特性、重量守恒、二級結(jié)構(gòu)比較或相似性得分(如通過使用blast程序所測定)方面評估肽的相似性的方法；變體與親本之間的其他變異點/分異點為可接受的；cdr的有利序列變化；引起糖基化改變的序列變異；高變區(qū)插入和產(chǎn)生變體抗體以及更一般地說產(chǎn)生cdr變體。

在本發(fā)明的氨基酸序列的情況下同一性可通過任何合適的技術(shù)，通常通過尼德曼-溫思科比對分析(needleman-wunschalignmentanalysis)來測定(參見needleman和wunsch，j.mol.biol.(1970)48:443-453)，例如經(jīng)由以align2.0使用blosum50評分矩陣(起始間隙罰分為-12并且擴展罰分為-2)進行分析而提供(關(guān)于對并入align程序中的整體比對技術(shù)的論述，參見myers和miller，cabios(1989)4:11-17)。align2.0程序的復(fù)本可例如經(jīng)由sandiegosupercomputer(sdsc)生物學(xué)工作臺得到。由于尼德曼-溫思科比對提供兩個序列之間的總體或整體同一性測量結(jié)果，故應(yīng)了解可以類似于完全序列的方式使用可為較大肽序列的部分或子序列的靶序列，或者，可使用如由例如史密斯-沃特曼比對(smith-waterman)(j.mol.biol.(1981)147:195-197)所測定的局部比對值來評估子序列之間的關(guān)系，所述局部比對值可通過可用程序獲得(可適用于分析同一性的其他局部比對方法包括應(yīng)用啟發(fā)式局部比對算法的程序，例如fasta和blast程序)。用于評估同一性的其他相關(guān)方法描述于例如國際專利申請wo03/048185中。設(shè)法對尼德曼-溫思科算法進行改良的高氏算法(gotohalgorithm)或者可用于整體序列比對。參見例如，gotoh,j.mol.biol.162:705-708(1982)。

抗體的制備

單克隆抗體尤其可使用由kohler等，nature,256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法或通過其他熟知的隨后研發(fā)的方法(參見例如，goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice，第59-103頁(academicpress,1986))來制備。可通過化學(xué)融合、電融合或任何其他合適的技術(shù)，用任何合適類型的骨髓瘤、異源骨髓瘤、淋巴母細胞樣細胞、漿細胞瘤或類似永生化細胞和任何合適類型的抗體表達細胞形成雜交瘤和其他融合細胞。

轉(zhuǎn)化的永生化b細胞也可用于高效地制備抗體。轉(zhuǎn)化的b細胞可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如用艾伯斯坦-巴爾病毒(epsteinbarrvirus)或轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)化而制備。(參見例如，"continuouslyproliferatinghumancelllinessynthesizingantibodyofpredeterminedspecificity,”zurawaki,v.r.等，monoclonalantibodies，kennettr.h.等編著，plenumpress,n.y.1980，第19-33頁)。因此，穩(wěn)定而持續(xù)和/或永生化的表達抗nkcir抗體的細胞和細胞系為本發(fā)明的另一個特征。用于制備抗nkcir抗體的方法的步驟可包括例如以下步驟：制備可產(chǎn)生抗amr抗體和/或抗stm抗體的永生化b細胞，使其與適當(dāng)配偶體融合以制備抗nkcir抗體，或?qū)ζ溥M行測序并且使用此類序列制備重組抗nkcir抗體。

可用作用于重組蛋白質(zhì)表達的宿主的細胞系為本領(lǐng)域中所熟知并且包括多種可自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)獲得的永生化細胞系。這些細胞系尤其包括中國倉鼠卵巢(cho)細胞、nso細胞、sp2細胞、hela細胞、幼倉鼠腎(bhk)細胞、猴腎細胞(cos)、人肝細胞癌細胞(例如，hepg2)、a549細胞以及多種其他細胞系。其他可使用的細胞系為昆蟲細胞系，諸如sf9細胞。當(dāng)將編碼抗體基因的核酸(或含有核酸的載體)引入哺乳動物宿主細胞中時，可通過培養(yǎng)宿主細胞足以允許抗體在宿主細胞中表達或更優(yōu)選地使抗體分泌到培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中的一段時期以制備抗體?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法自培養(yǎng)基中回收抗體?？贵w在直接表達而無分泌信號時也可自宿主細胞溶解物中回收。

可通過應(yīng)用多種本領(lǐng)域已知的合適技術(shù)(包括例如，免疫親和柱純化；硫酸鹽沈淀；聚焦層析；制備型sds-page等)純化來自細胞培養(yǎng)物、細胞溶解物以及轉(zhuǎn)基因動物或由其獲得的生物材料(例如，來自產(chǎn)生抗體的轉(zhuǎn)基因動物的腹水)的抗體。

抗nkcir抗體也可在細菌細胞和真核單細胞微生物(例如酵母)中制備。細菌細胞制備的抗體缺乏正常糖基化并且因此就adcc功能和可能另外與在哺乳動物細胞和/或動物中產(chǎn)生的基本上相同抗體有關(guān)的免疫反應(yīng)的其他方面而言可能有缺陷。

可使用適用于純化、篩選和選擇抗體的方法，包括wo2006/072625中所述的方法?？赏ㄟ^任何合適的技術(shù)或技術(shù)組合篩選和選擇抗nkcir抗體。例如，可以使用多種免疫測定形式來選擇與特定蛋白質(zhì)、變體或片段選擇性結(jié)合的抗體。例如，常規(guī)使用固相elisa免疫測定來選擇對蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)變體或其片段具有選擇性免疫反應(yīng)性的抗體。參見harlow和lane(同上)。單克隆抗體的結(jié)合親和力可例如通過munson等，anal.biochem.,107:220(1980)的斯卡查德分析來測定。

通常篩選抗nkcir抗體的調(diào)節(jié)nk細胞活性的能力，所述調(diào)節(jié)方式為例如抑制nkcir介導(dǎo)的信號，促進nk細胞經(jīng)由nkcar介導(dǎo)的信號活化。已研發(fā)多種適用于此類情況的nk細胞測定，包括例如流式細胞術(shù)篩選法。參見例如mcginnes等，jimmunolmethods80198470-85。與培養(yǎng)nk細胞、評估nk細胞等有關(guān)的方法為本領(lǐng)域已知的。參見例如，campbell和colonna，naturalkillercellprotocols(methodsinmolecularbiologyseries第121卷)(2000)。

在抗nkcir抗體的情況下，nk細胞中和活性可通過抗nkcir抗體復(fù)原由nkcir陽性nk細胞引起的靶細胞溶解的能力來表明。也可通過各種基于細胞的細胞毒性測定來評估抗nkcir抗體相關(guān)nk細胞調(diào)節(jié)(例如，kir抑制)。重導(dǎo)向殺傷實驗(redirectedkilling)為一種用于確定nk細胞受體誘導(dǎo)細胞毒性的能力的實驗系統(tǒng)。評估涂布有對候選受體具特異性的抗體的nk細胞殺死表達抗體所結(jié)合的fc受體的靶細胞的能力。在另一個變體中，可在細胞因子釋放測定中評估與抗kir抗體有關(guān)的nk細胞活性調(diào)節(jié)作用。也可使用與各種抗nkcir抗體有關(guān)的其他生物活性來評估抗nkcir抗體。例如，可評估抗nkcir抗體誘導(dǎo)、促進和/或增強由介導(dǎo)抗體依賴性細胞毒性(adcc)的igg2a、igg3和一些igg1子類抗體所誘導(dǎo)之a(chǎn)dcc的能力?？墒褂勉t釋放測定評估誘導(dǎo)adcc的能力。

通常以至少基本純的形式使用和提供抗nkcir抗體?；炯兊姆肿訛樵诎l(fā)現(xiàn)其的組合物中相對于其所屬的分子類別為主要物質(zhì)的分子(例如，基本純的抗體為發(fā)現(xiàn)其的組合物中的主要蛋白質(zhì)物質(zhì))?；炯兊奈镔|(zhì)占組合物中的此類型分子的至少約50％并且通常將構(gòu)成組合物中至少約70重量％、至少約80重量％、至少約85重量％、至少約90重量％、至少約95重量％或更大百分比的物質(zhì)。通常，包含抗nkcir抗體的組合物在組合物中的所有存在的肽物質(zhì)的情況下或至少相對于建議使用的情況下的基本活性肽物質(zhì)顯示出至少約98％、98％或99％抗nkcir抗體均質(zhì)性。例如，肽穩(wěn)定劑/緩沖劑(例如白蛋白)可在不妨礙抗nkcir抗體的活性的情況下有意包括于最終醫(yī)藥調(diào)配物中，并且因此可以從此類純度計算中排除。在基本純的組合物的情況下也可以接受不干擾基本活性的雜質(zhì)的存在。可通過適于給定化合物的方法(例如，層析法；瓊脂糖和/或聚丙烯酰胺凝膠電泳；hplc分析等)測量純度。

分離的分子是指不與顯著水平(例如，約1％以上、約2％以上、約3％以上或約5％以上)的任何外來且不需要的生物分子(例如產(chǎn)生抗nkcir抗體的細胞、細胞培養(yǎng)物、化學(xué)介質(zhì)或動物中包含的非抗nkcir抗體生物分子)締合的分子。分離的分子也是指已因人干預(yù)(自動、手動或兩者)顯著長時間(例如，至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約1小時或更長時間)而通過該純度階段的任何分子。在本發(fā)明提供的各種組合物的許多中，例如在包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的組合物中，抗nkcir抗體可以就組合物中的全部分子物質(zhì)的數(shù)目而言相對較小的量存在(例如，在包含大量藥學(xué)上可接受的載體、穩(wěn)定劑和/或防腐劑的組合物的情況下)。在一些情況下，諸如bsa的其他肽可包含于此類具有先前純化的抗nkcir抗體的組合物中。然而，假如組合物的此類其他組分為抗nkcir抗體的預(yù)期應(yīng)用所接受，此類組合物仍可描述為包含分離的抗nkcir抗體。換句話講，術(shù)語“分離的”不旨在排除與其他化合物或材料的人工或合成混合物，例如可以形成藥學(xué)上可接受的制劑的部分。

藥學(xué)上可接受的載體

抗nkcir抗體可與一種或多種適于一種或多種預(yù)期施用途徑的載體(稀釋劑、賦形劑等)和/或佐劑組合以提供藥學(xué)上可接受的組合物。

抗nkcir抗體可以例如與以下混合：乳糖、蔗糖、粉末(例如，淀粉粉末)、烷酸的纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、阿拉伯樹膠、明膠、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷和/或聚乙烯醇，以及任選地進一步制成片劑或囊封以用于常規(guī)施用。或者，抗nkcir抗體可以溶解于生理食鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纖維素膠體溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黃蓍膠和/或各種緩沖劑中。其他載體、佐劑和施用方式為醫(yī)藥領(lǐng)域所熟知。載體或稀釋劑可以包含時間延遲物質(zhì)，例如單獨的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或其與蠟的組合，或其他功能上相似的物質(zhì)。

藥學(xué)上可接受的載體通常包含生理學(xué)上與抗nkcir抗體相容的任何和所有合適的溶劑、分散介質(zhì)、涂料、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。藥學(xué)上可接受的載體的實例包括水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其任何組合。在許多情況下，在該組合物中可能需要包含例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉的等張劑。藥學(xué)上可接受的物質(zhì)(例如濕潤劑)或少量的輔助物質(zhì)(例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑)可合乎需要地延長抗kir抗體、相關(guān)組合物或組合的存放期或增強其有效性。載體和藥物組合物的其他組分的適合性是根據(jù)對抗體的所需生物學(xué)特性無顯著負面影響來確定。

根據(jù)本發(fā)明的抗nkcir抗體組合物、相關(guān)組合物和組合可為多種合適的形式。此類形式包括例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液(例如，可注射和可輸注溶液)、分散液或懸浮液、乳液、微乳液、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體、樹狀體及其他納米粒子(參見例如，baek等，methodsenzymol.2003；362:240-9；nigavekar等，pharmres.2004年3月；21(3):476-83)、微粒以及栓劑。制劑和鹽進一步描述于pct申請?zhí)杦o2006/072625中，

通常，呈可注射或可輸注溶液形式的組合物，例如類似于用于以其他抗體使人被動免疫的那些的組合物可用于遞送本發(fā)明的抗nkcir抗體。遞送抗nkcir抗體組合物的典型模式為腸胃外施用(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)和/或肌肉內(nèi)施用)。在一個方面，通過靜脈輸注或注射向人患者施用抗nkcir抗體。

用于醫(yī)藥用途的組合物也可包含各種稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、清潔劑(例如，非離子型清潔劑，例如tween-80)、穩(wěn)定劑(例如，糖或無蛋白質(zhì)氨基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑和/或適于包含于用于醫(yī)藥用途的組合物中的其他物質(zhì)。合適的組分的實例也描述于例如berge等，j.pharm.sci.,6661,1-19(1977)；wang和hanson,j.parenteral.sci.tech:42,s4-s6(1988)；美國專利6,165,779和6,225,289；以及本文引用的其他文獻中。此類藥物組合物也可包含防腐劑、抗氧化劑或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他添加劑。其他藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域所已知(參見例如wo2006/072625中的參考文獻)。

血液惡性疾病的治療

本發(fā)明提供用于治療患有或已患有血液惡性疾病或血液惡性疾病前兆的個體的治療方法。該治療涉及施用給患有程度最小或不可檢測的疾病的個體的抗nkcir抗體、抗nkcir抗體組合物和/或相關(guān)組合物。本發(fā)明也提供用于施用抗nkcir抗體以用于對血液惡性疾病進行此類治療的優(yōu)選治療方案，所述血液惡性疾病包括白血病(例如，aml、cml、mds)和骨髓瘤(例如，mm、smm)以及血液惡性疾病前兆，例如mds、smm和mgus。

本文的術(shù)語“治療”是指遞送有效量的該制劑以達成預(yù)防任何癥狀或疾病病況產(chǎn)生的目的或達成預(yù)防或延遲進展、減輕、改善或消除已產(chǎn)生的此類癥狀或疾病病況的目的。因此，術(shù)語“治療”旨在包括治療如下個體的程度最小或不可檢測的疾病，該個體(i)在第一治療之后有部分反應(yīng)或完全反應(yīng)，(ii)有所緩解，(iii)罹患可檢測的疾病(例如，aml、mm、mds)，或(iv)患有惡性疾病前兆。因此，所涵蓋的治療包括治療患有smm或mgus但尚未患有mm的個體。另外，治療包括治療患有mds但未患有aml的個體。術(shù)語“治療”包括誘導(dǎo)療法和鞏固療法。

如本文所用的術(shù)語“不可檢測的疾病”是指其中疾病的生物學(xué)和/或醫(yī)學(xué)標(biāo)記已低于細胞學(xué)可檢測水平的個體的疾病病況。例如，當(dāng)患者的全身白血病負荷低于細胞學(xué)可檢測水平，即，大約10⁹個細胞時，患有白血病的患者即稱為患有“不可檢測的疾病”。又如，當(dāng)基本不存在多發(fā)性骨髓瘤的骨髓或血液表現(xiàn)和/或無血清和尿液m蛋白組分的跡象時，患有骨髓瘤的患者即稱為患有“不可檢測的疾病”。可以使用標(biāo)準(zhǔn)程序評估疾病的生物學(xué)和/或醫(yī)學(xué)標(biāo)記。例如，可以使用電泳和/或免疫固定來評估血清和尿液m蛋白水平。

如本文所用，術(shù)語“緩解”是指慢性或惡性疾病的臨床和主觀特征部分或完全消失。

如本文所用，術(shù)語“血液惡性疾病前兆”和/或“血液惡性疾病前兆”是指前癌細胞。這些前癌細胞尚非惡性，但傾向于變成惡性細胞。前癌細胞可能看上去與正常細胞不同，但其尚未侵入周圍組織。示例性惡性疾病前兆包括但不限于mds、smm和mgus。

本文中的術(shù)語“血液惡性疾病”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴惡性疾病以及脾和淋巴結(jié)的癌癥。示例性淋巴瘤包括b細胞淋巴瘤和t細胞淋巴瘤。b細胞淋巴瘤的非限制性實例包括低級/nhl濾泡細胞淋巴瘤(fcc)、套細胞淋巴瘤(mcl)、彌漫性大細胞淋巴瘤(dlcl)、小淋巴球性(sl)nhl、中級/濾泡性nhl、中級彌漫性nhl、高級免疫母細胞性nhl、高級淋巴母細胞性nhl、高級小無核裂細胞nhl、巨瘤病nhl、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(waldenstrom’smacroglobulinemia)、淋巴聚細胞樣淋巴瘤(lpl)、套細胞淋巴瘤(mcl)、濾泡性淋巴瘤(fl)、彌漫性大細胞淋巴瘤(dlcl)、伯基特氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma,bl)、aids相關(guān)淋巴瘤、單核細胞性b細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴腺病變；小淋巴球性、濾泡性、彌漫性大細胞、彌漫性小核裂細胞、大細胞免疫母細胞性淋巴母細胞瘤；小非核裂、伯基特氏和非伯基特氏、濾泡性、主要大細胞淋巴瘤；濾泡性、主要小核裂細胞淋巴瘤；以及渡泡性、混合小核裂細胞和大細胞淋巴瘤。t細胞淋巴瘤的非限制性實例包括結(jié)外t細胞淋巴瘤、皮膚t細胞淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤以及血管免疫母細胞性t細胞淋巴瘤。血液惡性疾病還包括白血病，例如(但不限于)繼發(fā)性白血病、慢性淋巴細胞性白血病(cll)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、b細胞前淋巴細胞性白血病(b-pll)、急性淋巴母細胞白血病(all)以及骨髓發(fā)育不良(mds)。血液惡性疾病進一步包括骨髓瘤，例如(但不限于)多發(fā)性骨髓瘤(mm)和郁積型多發(fā)性骨髓瘤(smm)。術(shù)語血液惡性疾病涵蓋其他血液和/或b細胞或t細胞相關(guān)癌癥。例如，血液惡性疾病還包括其他造血細胞，包括樹突狀細胞、血小板、紅細胞、自然殺傷細胞以及多形核性白細胞(例如，嗜堿粒細胞、嗜酸粒細胞、中性粒細胞和單核細胞)的癌癥。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明確的是，這些惡性疾病前兆和惡性疾病常因分類系統(tǒng)改變而具有不同名稱，并且患有以不同名稱分類的淋巴瘤的患者也可受益于本發(fā)明的組合治療方案。

在一個示例性方面，本發(fā)明提供降低具有可檢測水平的癌細胞的哺乳動物宿主(例如人患者)中的血液惡性疾病進展的方法，其包括施用足以可檢測地降低宿主的血液惡性疾病進展的量的抗nkcir抗體、抗nkcir抗體組合物或相關(guān)組合物(例如，編碼抗nkcir抗體的核酸)。

可通過針對特定類型的疾病的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)則來定義疾病或癌癥的進展。任選地通過評估啟動細胞的選擇性克隆擴增來確定進展。檢測癌癥和癌癥進展的方法可通過任何合適的技術(shù)實現(xiàn)，該合適技術(shù)的若干實例為本領(lǐng)域已知。合適技術(shù)的實例包括pcr和rt-pcr(例如，對癌細胞相關(guān)基因或“標(biāo)記”進行)、活組織檢查、成像技術(shù)、核型分析以及其他染色體分析、免疫測定/免疫細胞化學(xué)檢測技術(shù)、組織學(xué)和/或組織病理學(xué)測定、細胞動力學(xué)研究以及細胞周期分析、流式細胞術(shù)以及身體檢查技術(shù)(例如，針對身體癥狀)。檢測癌癥和癌癥進展的示例性方法包括檢測細胞遺傳學(xué)異常，例如贅生性遺傳標(biāo)記，其通過分離異常細胞群，從異常細胞中分離核酸，以及使分離的核酸與一種或多種靶向基因重排的寡核苷酸接觸來完成。該接觸檢測細胞遺傳學(xué)異常的存在，例如免疫球蛋白(ig)和/或t細胞受體基因重排。

向受試者遞送抗nkcir抗體(通過直接施用或使其由核酸表達，例如由包含編碼抗nkcir抗體的核酸序列的痘病毒基因轉(zhuǎn)移載體表達)以及實踐本發(fā)明的其他方法可用于降低、治療、預(yù)防或以其他方式改善癌癥進展的任何合適的方面。本發(fā)明的方法尤其適用于降低和/或改善腫瘤生長(例如，骨髓中漿細胞的百分比、循環(huán)中腫瘤細胞的數(shù)目)以及與其相關(guān)的任何參數(shù)或癥狀(例如，m蛋白水平)。獨立地和共同地降低、預(yù)防或以其他方式改善癌癥進展的此類方面的方法為本發(fā)明的有利特征。

降低癌癥進展可包括例如以下方面的任何可檢測降低：(1)轉(zhuǎn)化成贅生性細胞的正常細胞的比率(或其任何方面)，(2)前贅生性細胞(例如，smm或mgus)或贅生性細胞的增殖率，(3)顯示前贅生性和/或贅生性表型的細胞數(shù)目，(4)包含前贅生性和/或贅生性細胞的細胞培養(yǎng)基(例如，細胞培養(yǎng)物、組織或器官(例如，哺乳動物宿主中的器官))的實體面積，(5)正常細胞和/或前贅生性細胞將轉(zhuǎn)化成贅生性細胞的可能性，(6)癌細胞將進展至癌癥進展的下一方面的可能性(例如，轉(zhuǎn)移可能性降低)，或(7)其任何組合。此類變化可使用任何上述技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其合適對應(yīng)物來檢測，通常在施用治療方案之前的適合時間應(yīng)用所述技術(shù)以評估治療方案的有效性。

在另一個方面，本發(fā)明提供在人患者中降低癌癥進展風(fēng)險、降低已進入癌啟動期的細胞群進一步癌癥進展的風(fēng)險和/或提供治療方案以降低癌癥進展的方法，其包括以足以實現(xiàn)部分或完全反應(yīng)的量和方案對該患者施用一種或多種第一治療(例如，誘導(dǎo)療法，例如化學(xué)治療劑)，以及對該患者施用一定量抗nkcir抗體或相關(guān)組合物(或應(yīng)用組合施用方法)。在患者正保持對第一治療的反應(yīng)同時，例如當(dāng)患者有所緩解或疾病程度最小時施用抗nkcir抗體。

抗nkcir化合物可以單治療劑形式或與其他治療劑組合施用。如本文所用，術(shù)語“單治療劑”是指將包含抗nkcir化合物而不含任何其他藥學(xué)活性劑和/或無額外藥學(xué)活性劑的藥物用于治療個體的特定疾病病狀?；蛘撸诒景l(fā)明的一些實施方案中，抗nkcir抗體或抗體片段的施用可與其他治療劑組合。例如，可使用多種治療劑治療癌癥。本發(fā)明的抗體組合物和方法可與任何其他一般用于治療特定疾病，尤其治療腫瘤、癌癥疾病或患者表現(xiàn)的其他疾病或病癥的方法組合。只要已知特定治療方法對患者病狀本身無害，并且不顯著抵消本發(fā)明藥物組合物中抗體的活性，即涵蓋其與本發(fā)明的組合。

對于癌癥治療，本發(fā)明的藥物組合物可與諸如手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法等的典型方法組合使用。本發(fā)明因此提供組合療法，其中本發(fā)明的藥物組合物在手術(shù)同時、之前或之后使用；或在施用常規(guī)化學(xué)治療劑、放射治療劑或抗血管生成劑或靶向免疫毒素或凝血配體同時、之前或之后施用至患者。其他抗癌劑可在施用本發(fā)明的抗kir抗體組合物之前、同時或之后施用。在一些情形下，甚至可能需要顯著延長治療時期，其中在分別施用抗癌劑或抗癌治療與施用本發(fā)明抗體組合物之間存在幾天(例如，2、3、4、5、6或7天)、幾周(例如，2、3、4、5、6、7或8周)或甚至幾個月(例如，1、2、3、4、5、6、7或8個月)時間間隔。在抗癌治療旨在基本破壞腫瘤(例如手術(shù)或化學(xué)療法)并且施用本發(fā)明抗體組合物旨在預(yù)防微轉(zhuǎn)移或腫瘤再生長的情況下，這可能有利。還設(shè)想將利用本發(fā)明的基于抗kir抗體的組合物或抗癌劑的一次以上施用。這些藥劑可隔日或隔周可互換地施用；或進行以本發(fā)明的抗kir抗體組合物的治療的循環(huán)，繼而進行抗癌劑療法的循環(huán)。在任何情況下，為使用組合療法實現(xiàn)腫瘤衰退，僅需要以有效發(fā)揮抗癌效應(yīng)的組合量遞送兩種藥劑，而與施用時間無關(guān)。

為實踐組合抗癌療法，應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明的抗體組合物與另一種抗癌劑以在患者體內(nèi)有效產(chǎn)生有利的組合抗癌作用的方式組合施用至患者。當(dāng)一種或多種藥劑與本發(fā)明的含有抗體的組合物組合用于治療方案中時，組合結(jié)果不需要為在單獨進行各種治療時所觀察到的效應(yīng)的疊加。雖然一般需要至少疊加效應(yīng)，但超過單一療法中的一者的任何增強的抗癌作用將為有利的。另外，不特定需要組合治療以顯示協(xié)同效應(yīng)，雖然這是可能的并且有利的。

組合施用包括共同施用不同調(diào)配物或單個醫(yī)藥調(diào)配物，以及以任一順序連續(xù)施用抗nkcir抗體或抗體片段以及第一治療。優(yōu)選地，所有施用的活性劑同時發(fā)揮其生物活性。

視患者和癌癥階段而定，第一治療可以涉及以下藥劑和/或療法中的一種或多種：手術(shù)、放射療法、免疫調(diào)節(jié)劑、化學(xué)治療劑、激素療法以及抗血管生成劑。還需要將施用抗nkcir抗體或抗體片段與施用另一種抗體相組合，例如，針對與特定癌癥相關(guān)的另一腫瘤抗原的抗體。例如，抗nkcir抗體或抗體片段可與美羅華(rituxan)組合施用。

就手術(shù)而言，任何手術(shù)干預(yù)可與本發(fā)明組合實施。

對于放射療法，涵蓋局部誘導(dǎo)癌細胞內(nèi)dna損傷的任何機制，例如γ照射、x射線、uv照射、微波和甚至電子發(fā)射等。還涵蓋將放射性同位素導(dǎo)向性遞送至癌細胞，并且這可與靶向抗體或其他靶向方式結(jié)合使用。

在其他方面，免疫調(diào)節(jié)劑或方案可與本發(fā)明抗體組合物組合施用或作為本發(fā)明抗體組合物的一部分施用。免疫調(diào)節(jié)劑的優(yōu)選實例包括細胞因子。各種細胞因子可用于此類組合方法中?？捎糜诒景l(fā)明所涵蓋的組合中的細胞因子的實例包括il-α、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-15、il-21、tgf-β、gm-csf、m-csf、g-csf、tnf-α、tnf-β、laf、tcgf、bcgf、trf、baf、bdg、mp、lif、osm、tmf、pdgf、ifn-α、ifn-β、ifn-γ。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，在符合臨床適應(yīng)癥，例如患者的病狀和細胞因子的相對毒性下施用用于組合治療或本發(fā)明組合物中的細胞因子?？膳c本發(fā)明的抗體組合物組合施用或作為本發(fā)明抗體組合物的一部分施用的其他免疫調(diào)節(jié)化合物包括特異性結(jié)合至淋巴細胞上的其他抑制性受體的抗體，包括但不限于諸如抗ctla4抗體或抗cd94jnkg2a抗體(參見例如，美國公開專利申請20030095965)的抗體。本領(lǐng)域已知的這些分子的變體和衍生物也或作為選擇可用于此類方法中，并且適當(dāng)時并入本發(fā)明的組合物中。

在某些實施方案中，本發(fā)明的包含抗kir抗體的治療組合物可與化學(xué)治療劑或激素治療劑組合施用或可以進一步包含化學(xué)治療劑或激素治療劑。多種激素治療和化學(xué)治療劑可用于本文公開的組合治療方法中。

示例性化學(xué)治療劑包括但不限于多聚乙酰(acetogenin)(例如，布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))、阿霉素(adriamycin)、烷基化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶(例如，苯左多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麥圖多巴(meturedopa)和優(yōu)多巴(uredopa))、二膦酸鹽(例如，氯屈膦酸鹽(clodronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、ne-58095、唑來膦酸(zoledronicacid)/唑來膦酸鹽、阿倫膦酸鹽(alendronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、替魯膦酸鹽(tiludronate)和利塞膦酸鹽(risedronate))；更生霉素(dactinomycin)、δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol))、乙撐亞胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基蜜胺、三亞乙基膦酰胺、三亞乙基硫代膦酰胺和三甲基三聚氰胺)、β-拉帕醌(β-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙堿(colchicine)；樺木酸(betulinicacid)；喜樹堿(camptothecin)(例如，拓撲替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、乙酰喜樹堿(acetylcamptothecin)、莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；卡利斯達汀(callystatin)；cc-1065(例如，阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；足葉草毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinicacid)；替尼泊甙(teniposide)；自念珠藻環(huán)肽(cryptophycin)(例如，自念珠藻環(huán)肽1和自念珠藻環(huán)肽8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(例如，kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；匍枝珊蝴醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogenmustard)(例如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)膦酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracilmustard))；亞硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷尼司汀(ranimnustine))；抗生素，例如烯二炔類抗生素(例如，刺孢霉素(calicheamicin))；達米辛(dynemicin)；艾斯帕米辛(esperamicin)；新制癌菌素發(fā)色團(neocarzinostatinchromophore)和色蛋白烯二炔抗生素(例如，阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、奧斯拉霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博萊霉素(bleomycins)、放線菌素c(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅霉素(caminomycin)、噬癌菌素(carzinophilin)、克羅米辛(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、道諾霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧基-l-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、潑非霉素(potfiromycin)、嘌吟霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin))；抗代謝物(例如，甲胺喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu))；葉酸類似物(例如，迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate))；嘌呤類似物(例如，氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如環(huán)胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine))；雄激素(例如，二甲睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、環(huán)琉雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睪內(nèi)酯(testolactone))；抗腎上腺劑(例如，胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane))；葉酸補充劑(例如，夫羅林酸(frolinicacid))；醋葡內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺醣苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；埃夫密辛(elformithine)；乙酸依利醋銨(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；乙環(huán)氧啶(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(lentinan)；羅尼達寧(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)(例如，美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin))；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；硝拉維林(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubiin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多醣k；丙亞胺(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofuan)；螺旋鍺(spirogermanium)；細格孢氮雜酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯族毒素(trichothecene)(例如，t-2毒素、弗納庫林a(verracurina)、桿孢菌素a(roridina)和胺癸叮(anguidine))；胺基甲酸乙酯(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside,“ara-c”)；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)(例如，紫杉醇(taxol)、紫杉特爾(taxotere)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(doxetaxel))；克羅南布(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物(例如，順鉑和卡鉑)；長春堿(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；奧賽力鉑(oxaliplatin)；甲酰四氫葉酸(leucovovin)；長春瑞濱(vinorelbine)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibanronate)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥胺酸(dmfo)；類視黃素(retinoid)(例如，視黃酸(retinoicacid))；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任一者的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。

如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解到的，與nkcir抑制劑(例如，抗kir抗體)組合使用的化學(xué)治療劑的適當(dāng)劑量將接近涉及施用單獨化學(xué)治療劑或其與其他化學(xué)治療劑的組合的臨床療法中已使用的劑量。根據(jù)所治療的病狀，劑量可能出現(xiàn)變化，施用治療的醫(yī)師將能夠確定用于個別受試者的適當(dāng)劑量。

抗激素劑用于調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制可促進癌癥生長的激素的作用。如上所述，本發(fā)明的nkcir抑制劑(例如，抗kir抗體)可與抗激素劑組合使用。示例性抗激素劑包括但不限于lhrh激動劑(例如，亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、曲普瑞林(triptorelin)和布舍瑞林(buserelin))；抗雌激素和選擇性雌激素調(diào)節(jié)劑(serm)(例如，他莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-經(jīng)基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene))；雌激素受體下調(diào)劑(erd)；抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、環(huán)丙孕酮(cyproterone)和比卡魯胺(bicalutamide))；芳香酶抑制劑(例如，安美達錠(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲唑(letrozole)、4(5)-咪唑、氨魯米特、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、弗米斯坦(formestanie)、伏羅唑(vorozole)和法屈唑(fadrozole))；以及孕激素(例如，甲孕酮(medroxy)、氯地孕酮(chlormadinone)和甲地孕酮(megestrol))。

本發(fā)明的nkcir抑制劑(例如，抗kir抗體)可與任一種或多種抗血管生成療法組合使用或可進一步包含抗血管生成劑?？寡苌蓜┑姆窍拗菩詫嵗ㄖ泻托钥贵w、反義rna、sirna、rnai、rna適配子以及核糖核酸酶，尤其包括抑制涉及異常細胞增殖的信號傳導(dǎo)路徑中的基因表達的抗體，所述基因如pkc-α、raf、h-ras、egf-r、vegf或vegf-r。

具治療有效性的這些上述化學(xué)治療藥物的給藥方案和劑量將取決于所治療的特定癌癥、疾病程度及其他為具有此本領(lǐng)域技術(shù)的醫(yī)師所熟悉的因素并且可由醫(yī)師確定。

在另一個方面，本發(fā)明提供促進哺乳動物宿主(例如人患者)的癌癥緩解的方法，該方法包括對宿主施用包含抗nkcir抗體(例如抗kir抗體)的組合物，以促進宿主的癌癥緩解。

在另一個方面，本發(fā)明提供在哺乳動物宿主中降低產(chǎn)生癌癥病狀的風(fēng)險、縮短癌癥病狀發(fā)病的時間、降低在早期階段診斷的癌癥的嚴(yán)重程度和/或減少癌癥產(chǎn)生時的侵害面積的方法，該方法包括對宿主施用預(yù)防有效量的本發(fā)明的抗nkcir抗體或相關(guān)組合物以達到期望的生理作用。優(yōu)選地，宿主患有mds、smm或mgus，并且癌癥病狀為mm，其中抗nkcir抗體降低產(chǎn)生mm的風(fēng)險和/或縮短mm發(fā)病的時間。

nk細胞計數(shù)和活化標(biāo)記在患有smm的患者體內(nèi)顯著增加。通常，患有smm的個體在用化合物(例如，結(jié)合nkcir的抗體)治療之前未經(jīng)第一治療所治療；然而，本發(fā)明還設(shè)想先前用非nkcir劑治療的smm患者。

不受理論的約束，據(jù)信本發(fā)明方法在用于疾病程度最小的個體時相較于用于腫瘤負荷較高的患者而言最有效，因為所述方法并非特別適用于恢復(fù)有疾病的體征和癥狀的個體的nk細胞功能。因此，在一些涉及除前期惡性病狀以外的病變(例如smm或mgus)的實施方案中，優(yōu)先用第一治療治療患者，以使個體的疾病程度最小或不可檢測。例如，以誘導(dǎo)療法并且任選地以鞏固療法進行治療可使疾病緩解或產(chǎn)生完全反應(yīng)，從而增強本發(fā)明方法的功效。

在另一個方面，本發(fā)明提供增加診斷患有癌癥的人患者存活超過相關(guān)時期的可能性的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供改善癌癥患者的生活質(zhì)量的方法，該方法包括對患者施用有效改善其生活質(zhì)量的量的本發(fā)明組合物。在另一個方面，可應(yīng)用本文所述的本發(fā)明方法以顯著減少脊椎動物宿主體內(nèi)的癌細胞數(shù)目，從而例如降低腫瘤細胞的總數(shù)。在相關(guān)意義上，本發(fā)明提供殺死脊椎動物(例如人癌癥患者)的前贅生性細胞和/或贅生性細胞的方法。任選地，癌癥為選自aml、cml、mm、smm和mgus的血液惡性疾病。

在另一個方面，本發(fā)明提供抑制nkcir的化合物的用途，其用于制備用于治療患有或先前已患有血液惡性疾病前兆或血液惡性疾病的個體的藥物組合物。在該用途的一個實施方案中，個體的疾病程度最小或不可檢測。在另一個實施方案中，個體患有血液惡性疾病前兆。在另一實施方案中，個體患有smm(郁積型骨髓瘤)、mgus(意義未明的單克隆丙種球蛋白病)或mds(骨髓增生異常綜合征)。

本發(fā)明還提供用于治療患有或先前已患有血液惡性疾病前兆或血液惡性疾病的個體的抑制nkcir的化合物。

急性骨髓白血病(aml)

急性骨髓白血病(aml)是美國和歐洲成人中最常見白血病類型之一。在2006年，美國估計診斷出大約11,930例新增aml病例，占所有癌癥的1％以下和所有白血病的34％。在40歲以下aml的發(fā)病率較低，但隨年齡逐漸增加，從40歲群體中每100,000人約1例增加至75歲和75歲以上群體中每100,000人15例以上。表現(xiàn)aml的中值患者年齡為65歲至70歲。較年輕aml患者的成功治療比年長aml患者的成功治療常見得多。對于55歲至65歲或超過65歲的年長患者，從治療(誘導(dǎo)化學(xué)療法)至死亡的中值時間為5至10個月。雖然完全緩解率為約50％，但緩解通常短暫，并且很少持續(xù)12個月以上。在誘導(dǎo)化學(xué)療法之后保持緩解3年的機率為10％以下。

年齡相關(guān)的結(jié)果差異與共同罹病和預(yù)后因素有關(guān)。許多年長患者不能耐受采用細胞毒性劑的標(biāo)準(zhǔn)治療及其并發(fā)癥?；加心挲g相關(guān)慢性心臟、肺部、肝臟或腎臟病癥的患者處于較大的來自化學(xué)療法的急性毒性風(fēng)險。

異常核型特征在aml中為常見的。核型在定義急性白血病的病理生理學(xué)、自然史以及對療法的反應(yīng)中的重要性為關(guān)鍵概念。最常與年輕aml患者治療失敗有關(guān)的細胞遺傳學(xué)異常(例如染色體5或7或復(fù)雜核型異常)顯著更常見于老年人中，存在于32％至57％的患者中。相比之下，“有利的”細胞遺傳學(xué)異常(例如t(8；21)、t(15；17)或inv(16))更常見于較年輕患者中并且在某種程度上為造成其更好的無病存活期的原因。常用于aml中的某些疾病進展生物標(biāo)記包括flt3突變和/或npm1突變，其為兩個最重要的正常核型aml的預(yù)后生物標(biāo)記。flt3在aml中一般為單個最重要的預(yù)后因素。大約25-35％的aml患者有flt3突變。具有flt3突變的患者的結(jié)果以及對標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法的反應(yīng)較差。

aml的當(dāng)前治療

用于大部分aml患者的治療策略分成兩個一般階段：誘導(dǎo)療法和緩解后療法，其示于圖1中。

誘導(dǎo)療法

aml療法的第一目標(biāo)為誘導(dǎo)完全緩解(cr)。成人aml緩解定義為正常周邊血細胞計數(shù)和正常細胞骨髓(骨髓中母細胞小于5％)并且無疾病的體征或癥狀。此外，不存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病或其他骨髓外浸潤的體征或癥狀。

誘導(dǎo)療法旨在使全身白血病負荷降低至約10⁹個細胞的細胞學(xué)可檢測水平以下。實現(xiàn)完全緩解的先決條件為在誘導(dǎo)化學(xué)療法之后達到骨髓發(fā)育不全，通常持續(xù)1或2周。然而，在完全緩解時，患者仍有顯著然而勉強可檢測的殘留白血病負荷(微小殘留病)，需要某種形式的緩解后療法。

對于持續(xù)20年以上，標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化學(xué)療法包括蒽環(huán)霉素和阿糖胞苷。最常見方案組合施用道諾霉素3天與連續(xù)輸注阿糖胞苷7天(3+7方案)。在大部分使用該方案的前瞻性研究中，65％至75％的60歲以下患者實現(xiàn)cr，并且大約50％的60歲以上患者實現(xiàn)cr。年長患者實現(xiàn)cr的可能性降低的原因在于抗性疾病風(fēng)險提高以及因全血球減少癥的并發(fā)癥而死亡的風(fēng)險提高。其他與誘導(dǎo)療法后cr率較低相關(guān)的因素包括存在不良細胞遺傳學(xué)、先前血液病癥以及在診斷時體能狀態(tài)不良。

鑒于年長患者對標(biāo)準(zhǔn)療法的反應(yīng)率相對較低，試圖進行劑量強化誘導(dǎo)療法方案。然而，迄今為止，無誘導(dǎo)方案經(jīng)證明在緩解或死亡率方面優(yōu)于3+7方案。

緩解后療法

緩解后療法旨在進一步降低殘留白血病細胞數(shù)，其在初始cr時可能高達10⁸至10⁹個細胞。這可通過任一引起顯著骨髓抑制的細胞毒性化學(xué)療法，或通過經(jīng)由異源移植置換患者干細胞來實現(xiàn)。

在占aml群體中最大比例的年長患者中，具有治療性目的的化學(xué)療法不構(gòu)成具有有利風(fēng)險-效益概況的治療方案，然而通常向年長患者提供鞏固化學(xué)療法。用于年長aml患者的強化鞏固或維持化學(xué)療法方案已在臨床試驗中經(jīng)過測試，但未證明是有益的。這主要歸因于化學(xué)療法相關(guān)毒性以及年齡相關(guān)患者共同罹病。因此，體能狀態(tài)顯著降低或有與誘導(dǎo)化學(xué)療法相關(guān)的顯著器官毒性的患者不為強化緩解后療法的候選者。

用抗nkcir化合物治療aml

可有利地施用抗nkcir化合物作為緩解后療法。例如，可根據(jù)本文所公開的劑量和給藥方案，用抗nkcir抗體治療對先前療法(例如在誘導(dǎo)療法以及任選的鞏固療法后)實現(xiàn)cr的患者。在實施方案中，患者具有不良預(yù)后(例如處于有高進展風(fēng)險的群組中)，例如患者具有與不良預(yù)后相關(guān)的flt3或npm1突變。抗nkcir治療可為單治療劑治療或與用于治療疾病的其他藥劑組合。然而，優(yōu)選地，抗nkcir抗體將在不伴隨使用對nk細胞活性具有負面影響的化學(xué)治療劑的情況下施用。

郁積型多發(fā)性骨髄瘤(smm)

自2003年以來郁積型多發(fā)性骨髓瘤通過使用國際共同標(biāo)準(zhǔn)(internationalmyelomaworkinggroup.criteriafortheclassificationofmonoclonalgammopathies,multiplemyelomaandrelateddisorders:areportfromtheinternationalmyelomaworkinggroup.brjhaematol2003；121:749-57)來定義：

o血清單克隆蛋白質(zhì)為3g/dl或更高，

o和/或骨髓中有10％或10％以上的漿細胞，

o但無相關(guān)器官或組織障礙(無終末器官損傷，包括骨骼病變)以及相關(guān)癥狀的跡象。

mayo臨床小組已改進這些標(biāo)準(zhǔn)以闡明應(yīng)排除僅具血清游離鏈的患者并且漿細胞需為純系的(kylera,rajkumarsv.criteriafordiagnosis,staging,riskstratificationandresponseassessmentofmultiplemyeloma.leukemia2009；23:3-9)。

smm的當(dāng)前治療

當(dāng)前無smm療法可用。當(dāng)前對此醫(yī)學(xué)病狀的管理限于密切追蹤以能夠診斷出向應(yīng)治療的活動性mm的早期進展。在第一年期間應(yīng)每3個月一次追蹤患者以確定進展模式。對具有穩(wěn)定的m蛋白并且根據(jù)凱爾氏預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)(kyle'sprognosticcriteria)(bladéj等，jclinoncol201028:690-97)進展風(fēng)險低的未進展患者可考慮采用較低追蹤頻率。

smm發(fā)病率隨年齡增加，患者在診斷時的中值年齡處于65歲至70歲范圍內(nèi)。smm占所有新診斷的mm病例的大約15％。鑒于mm在美國的估算發(fā)病率在20,000例新病例/年中，每年在美國將診斷出至多3,000例smm新病例。然而，大部分smm當(dāng)前未診斷出，幾乎所有mm之前可能皆存在smm，如下文所論述。

匯集證據(jù)表明nk細胞涉及mm免疫監(jiān)視，包括展示活化nk細胞對源自mm的惡性細胞具細胞毒性的離體資料。在疾病早期階段，骨髓瘤細胞廣泛表達上述活化nk配體(mica和micb、ulbp)并且下調(diào)抑制性1類hla配體(carbonee等，blood2005；105:251-58)。另外，低腫瘤負荷向侵襲性mm的進展伴有nk細胞的定量減少和功能衰竭。在患有mgus以及郁積型或早期mm的患者中nk細胞計數(shù)和活化標(biāo)記顯著增加。相反，晚期mm患者中nk細胞計數(shù)減少并且nk細胞對刺激變得具低反應(yīng)性(carbone等，2005；sawanoborim等，actahaematol1997；98:150-54)。

兩項新近研究表明所有mm之前均存意義未明的無癥狀單克隆丙種球蛋白病(mgus)，mgus特征在于血清m蛋白<3g/dl并且骨髓漿細胞<10％。然而，僅一半mgus患者進展，并且在這種情況下，m蛋白逐漸增加，可能在明顯mm之前導(dǎo)致smm。已完全了解這些漿細胞增殖的病理生理學(xué)，以及涉及mgus向smm進展和smm向有癥狀mm進展的機制。然而，若干步病原性過程的2個主要步驟已經(jīng)充分表征：

o純系漿細胞最初有限轉(zhuǎn)化，由后天遺傳事件造成。mgus、smm的漿細胞具有類似于骨髓瘤細胞的遺傳和表型概況，將其與其正常對應(yīng)物明顯區(qū)分開。

omgus向smm和smm向mm的逐漸進展似乎不僅與贅生性漿細胞中發(fā)生的遺傳事件有關(guān)，并且與骨髓微環(huán)境變化的累積有關(guān)。

充分描述kyle等小組追蹤的276名smm患者的群組的自然史，得出結(jié)論：

o在第5年向有癥狀并且不可治愈的惡性疾病進展的累積概率為73％。大部分患者產(chǎn)生mm，而僅2％患者進展為原發(fā)性淀粉樣變性病(al)。

osmm的總進展風(fēng)險極大地受自診斷以來的時間影響。其在前5年中為每年約10％，但在后續(xù)5年中僅為每年3％，之后降低至每年1％。中值進展時間(ttp)在2年至3年范圍內(nèi)。

o進展的風(fēng)險顯著地受單克隆蛋白質(zhì)的水平、骨髓漿細胞的比例或兩者影響。如下文所示，通過使用這2個變量產(chǎn)生的3個預(yù)后組之間在中值進展時間方面存在相當(dāng)大差異。在高風(fēng)險組中，87％在第15年時進展成明顯惡性疾病，并且中值進展時間短至2年。相反，在低風(fēng)險組中，僅39％的人員進展，中值時間為19年。

表2示出進展成活動性多發(fā)性骨髓瘤的機率(來自kylera等，nengljmed2007；356:2582-90)

其他進展因素已在其他研究中鑒別并且在下表中有所提及。新近數(shù)據(jù)尤其強調(diào)2個免疫學(xué)預(yù)測物的重要性，所述免疫學(xué)預(yù)測物可改善對smm的預(yù)測：

o處于低于0.126或高于8的斷點處的異常游離輕鏈比率(flc)似乎為獨立的風(fēng)險因素。如通過對同一mayo群組進行研究顯示，相較于僅考慮血清m蛋白水平和骨髓漿細胞百分比的初始分類，并入flc使得分類得以改良，其中患者分布更平衡。

o骨髓漿細胞bmpc的異常表型以及也如年長者研究中所示，所謂免疫不全麻痹，其定義為未涉及的ig同種型中的一者或兩者降低。基于這2個參數(shù)，提出評分系統(tǒng)，其中在分別不存在、存在一個或兩個因素時，smm向mm的累積進展率為4％、46％和72％。然而，通過流式細胞術(shù)對bmpc表型進行表征仍為繁瑣的，并且可能難以在團體間再現(xiàn)。

最終，患有所謂進展的smm(即血清m蛋白值逐漸增加)的患者進展成有癥狀mm的時間短于具有穩(wěn)定m蛋白的患者(中值1.3年相較于3.9年)。

表3示出進展的主要因素。以抗nkcir抗體治療可以為：

用抗nkcir化合物治療smm

抗nkcir化合物可有利地施用至患有例如由標(biāo)準(zhǔn)國際骨髓瘤工作組(standardinternationalmyelomaworkinggroup)定義所定義的smm或mgus的患者。在實施方案中，患者具有不良預(yù)后(例如，處于具有高進展風(fēng)險的組中)，例如患者具有與不良預(yù)后相關(guān)的突變或處于根據(jù)表2中的分組的第1組中。任選地，可治療具有向mm進展的一個或多個經(jīng)定義的風(fēng)險因素的患者，例如可基于向活動性多發(fā)性骨髓瘤進展的機率鑒別或選擇屬于第1組、第2組或第3組的患者(參見例如kylera等，nengljmed2007；356:2582-90的標(biāo)準(zhǔn))并且用抗nkcir化合物治療?？筛鶕?jù)本文所公開的劑量和給藥方案用抗nkcir抗體治療患者?？筺kcir治療可為單治療劑治療或與用于治療疾病的其他藥劑組合。然而，優(yōu)選地，抗nkcir抗體將在不伴隨使用對nk細胞活性具有負面影響的化學(xué)治療劑的情況下施用。

多發(fā)性骨髓瘤(mm)

多發(fā)性骨髓瘤為第二最常見血液癌癥(在2007年美國出現(xiàn)19,900例新病例，并且在西歐出現(xiàn)類似數(shù)目的病例)。mm由漿細胞惡性增殖產(chǎn)生，其在大部分但并非所有病例中產(chǎn)生純系免疫球蛋白(所謂的m蛋白)。mm的特征在于骨骼破壞、低鈣血癥、骨髓和腎衰竭。在國際上使用準(zhǔn)確共同標(biāo)準(zhǔn)來定義mm(kyle和rajkumar,2009)。

mm的當(dāng)前治療

歷史治療由以下組成：細胞減滅術(shù)療法(所謂的由高劑量皮質(zhì)類固醇“誘導(dǎo)”)，以及常規(guī)的抗有絲分裂化學(xué)療法，包括烷基化劑或有效性較低(但骨髓毒性較低)的阿霉素和長春新堿的組合。

在“強化”步驟的誘導(dǎo)(也稱為高劑量化學(xué)療法)之后最有效治療通常繼之以施用高劑量的美法侖烷基化劑(alkylator)(200mg/m2)。其骨髓毒性需要通過移植自體性造血細胞進行血液救護，這會縮短再生不全期。通常通過在誘導(dǎo)期結(jié)束時施用的gcsf和/或環(huán)磷酰胺使造血細胞自骨髓向周邊血液移動。然而，出于安全性原因，強化僅可為小于65歲并且無嚴(yán)重共同罹病的患者所接受。

此類強化治療使得在歷史誘導(dǎo)治療下在至多10％至20％的患者中實現(xiàn)vgpr和pr成為可能。在無強化的情況下，并且由此對于大于65歲的患者，很少實現(xiàn)完全反應(yīng)(cr)和極佳部分反應(yīng)(vgpr)。五項大型隨機化研究能夠表明基于強化的方案相較于化學(xué)療法在反應(yīng)、無進展存活期以及3種總存活率狀況方面的優(yōu)越性(評述于attal等，2007中)。

在過去數(shù)年內(nèi)出現(xiàn)兩類新型免疫調(diào)節(jié)藥，即“imid”，例如沙利度胺(thalidomide)和來那度胺(lenalidomid)；以及蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米(bortezomib)，并且其主要用作與皮質(zhì)類固醇或細胞毒性化學(xué)療法的組合療法的一部分。兩種藥物類別組合至少2種作用：細胞減滅術(shù)與調(diào)節(jié)漿細胞微環(huán)境。將這些新藥與類固醇和常規(guī)化學(xué)療法(包括高劑量化學(xué)療法)組合使得顯著改善反應(yīng)率以及尤其改善vgpr率或cr率成為可能。然而，不可檢測最小程度殘留的疾病在分子層面上的緩解在可記錄時似乎極少，在10％以下的患有這些病狀的患者中實現(xiàn)，實現(xiàn)cr的患者在數(shù)年后必然復(fù)發(fā)。

至少50％病例在第一次復(fù)發(fā)時對治療有反應(yīng)，但第二次或后續(xù)復(fù)發(fā)最終將變得難以由任何可用治療治愈。因此，除少數(shù)成功移植有異源造血細胞的年輕患者之外，該疾病仍不可治愈。然而，程序的毒性顯著限制其適應(yīng)癥。

當(dāng)前治療仍限于有癥狀患者。任何治療對無癥狀患者的進展或存活的效益尚未證明。治療的適應(yīng)癥共同定義為：

在大于65歲或有嚴(yán)重共同罹病的患者中，歷史治療由雙重誘導(dǎo)療法組成：美法侖+潑尼松(mp)。若干研究顯示mp與3種新藥劑(沙利度胺、硼替佐米或來那度胺)中的任一者的組合優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)mp。當(dāng)前測試甚至可產(chǎn)生更佳結(jié)果的其他組合，包括來那度胺+地塞米松(dex)，以及來那度胺+硼替佐米+dex。在小于65歲并且無嚴(yán)重共同罹病的患者中，如先前通過誘導(dǎo)開始治療，使腫瘤負荷能夠降低，之后收集干細胞并且在使自體性造血細胞回增下進行強化。在自體性hct之后即開始探索通過重復(fù)細胞減滅術(shù)化學(xué)療法組合imid和蛋白酶抑制劑進行鞏固。

疾病反應(yīng)的評估

目前在所有試驗中應(yīng)使用imwg(國際mm工作組)的國際統(tǒng)一反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，如由該領(lǐng)域中的領(lǐng)導(dǎo)專家小組在2006年于leukemia中所發(fā)表。

可通過各種方法評估反應(yīng)，包括分子層面上的緩解(例如定義為<1個惡性細胞/10,000個bm細胞)，通常涉及使用以等位基因特異性寡核苷酸對骨髓樣本進行的實時pcr來檢測和定量cr患者的微小殘留疾病。還使用多參數(shù)流式細胞術(shù)。其他方法包括可在血清中定量可定量的游離輕鏈，以及骨髓的免疫學(xué)評估。

對誘導(dǎo)、鞏固(包括強化)療法的完全和部分反應(yīng)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)則(例如，imwg準(zhǔn)則)來評估。cr、pr或vgpr患者可用本發(fā)明的抗nkcir抗體治療。

用抗nkcir化合物治療mm

在使用化學(xué)療法進行治療和/或用免疫調(diào)節(jié)劑(例如imid或蛋白體抑制劑)治療之后，可在對此類誘導(dǎo)和/或任選的鞏固療法有部分或完全反應(yīng)并因此疾病程度最小的患者中有利地施用抗nkcir化合物作為誘導(dǎo)(和/或鞏固和/或強化)后療法?？筛鶕?jù)本文所公開的劑量和給藥方案，用抗nkcir抗體治療在療法之后(例如在誘導(dǎo)療法和任選的鞏固療法之后)實現(xiàn)反應(yīng)或緩解的患者。抗nkcir治療可為單治療劑治療或與用于治療疾病的其他藥劑組合。然而，優(yōu)選地，抗nkcir抗體將在不伴隨使用對nk細胞活性具有負面作用的化學(xué)治療劑的情況下施用。

抗nkcir抗體的給藥和給藥方案

在一個方面，本發(fā)明提供的治療方法包括對個體施用包含治療有效量的抗nkcir抗體的組合物。治療有效量可為例如約0.0003mg(抗體)/kg(患者體重)至約3mg/kg(例如，約0.003mg/kg至約3mg/kg，例如約0.015mg/kg至約3mg/kg，例如，約0.075mg至約3mg/kg、約0.3mg/kg至約3mg/kg和約1mg/kg至約3mg/kg中的任何一者，或約0.0003mg/kg、約0.003mg/kg、約0.015mg/kg、約0.075mg/kg、約0.3mg/kg、約1mg/kg和約3mg/kg中的任何一者)的劑量?？筴ir抗體的劑量和制劑描述于pct申請?zhí)杦o2008/084106中，該申請的公開內(nèi)容以引用方式并入本文中。在一個實施方案中，該方法包括例如以每天3次至每2個月一次的范圍內(nèi)的給藥頻率重復(fù)施用至少一次。也可施用該劑量例如至少3次、至少6次或至少10次。在一個實施方案中，靜脈內(nèi)施用抗體。在另一個實施方案中，抗體結(jié)合至nk細胞表面上的抑制性kir增強nk細胞的細胞毒性活性。在另一個實施方案中，抗體為交叉反應(yīng)性抗kir抗體。例如，抗體可為如pct申請?zhí)杦o2008/084106所述的制劑中的抗體1-7f9。

在一個優(yōu)選實施方案中，選擇劑量以在人患者體內(nèi)提供基本完全飽和作用。如本文所用，術(shù)語“基本完全飽和”是指至少90％的靶標(biāo)nkcir占有率，并且優(yōu)選地是指至少95％的受體占有率。該方法任選地包括評估患者的nk細胞增強和/或抗腫瘤活性(其可通過使用任何合適的技術(shù)進行，其中若干技術(shù)為本領(lǐng)域已知，包括例如，nkcir占有率水平、cd107a標(biāo)記等，如本文所述)。通常通過經(jīng)合適時期(例如約1小時)靜脈內(nèi)給施用來施用制劑。

例如，可以一定劑量和一定給藥頻率施用抗nkcir抗體以在血漿內(nèi)達成nk細胞上至少約90％、優(yōu)選至少約95％nkcir占有率持續(xù)至少約一個月、兩個月、三個月或六個月，從而使飽和持續(xù)一段延長時期(例如，至少3個月、6個月)。在單獨的實施方案中，劑量在約0.1mg/kg至約3mg/kg、約0.3mg/kg至約3mg/kg、約0.1mg/kg至約1mg/kg以及約1mg/kg至約3mg/kg的范圍內(nèi)，進一步優(yōu)選地，其中該抗體為抗kir抗體，進一步優(yōu)選地，其中該抗體為1-7f9。給藥頻率可在每天一次至每2個月一次、約每周一次至約每2個月一次的范圍內(nèi)；或可為約每月一次?；蛘?，給藥頻率可選自每天約三次、約兩次和約一次；每周約五次、約四次、約三次和約兩次；以及每兩周、每四周和每六周約一次。

在一個優(yōu)選實施方案中，約每周2次至約每月一次或約每月一次至約每2個月一次施用引起受體基本完全飽和(例如，至少約90％或95％受體占有率)的劑量的抗nkcir抗體。可施用該劑量例如至少3次、至少6次或6次以上。例如，該方法可以包括以一定劑量和一定給藥頻率施用抗nkcir抗體以實現(xiàn)nk細胞上至少約90％或95％nkcir占有率持續(xù)至少約2周、1個月、6個月、9個月或12個月。

在一個優(yōu)選實施方案中，方案引起持續(xù)的基本完全受體飽和。施用引起受體基本完全飽和持續(xù)至少約1周、2周或1個月的時期的劑量的抗nkcir抗體。當(dāng)劑量引起受體基本完全飽和(例如，至少約90％或95％受體占有率)持續(xù)約一周時，可以例如每周一次至每兩周一次施用該劑量；當(dāng)劑量引起受體基本完全飽和持續(xù)約兩周時，可以例如每兩周一次至每月一次施用該劑量。當(dāng)劑量引起受體基本完全飽和持續(xù)約兩周至約一個月時，可以例如約每月一次施用該劑量。在每個方案中，可施用該劑量例如至少3次、至少6次或6次以上。例如，該方法可以包括以一定劑量和一定給藥頻率施用抗nkcir抗體以實現(xiàn)nk細胞上至少約95％kir占有率持續(xù)至少約6個月、9個月或12個月。

在另一個優(yōu)選實施方案中，方案引起間歇性基本完全受體飽和。施用引起受體基本完全飽和(例如，至少約90％或95％受體占有率)持續(xù)至少約1周、2周或1個月的時期的劑量的抗nkcir抗體。當(dāng)劑量引起受體基本完全飽和持續(xù)約一周至兩周時，可以例如約每月一次或每至少兩個月時期一次(例如，每兩個月一次)施用該劑量。當(dāng)劑量引起受體基本完全飽和持續(xù)約兩周至約一個月時，可以例如約每至少兩個月時期一次(例如，每兩個月一次)施用該劑量。在單獨的實施方案中，劑量在約0.1mg/kg至約0.3mg/kg的范圍內(nèi)，約每月一次施用；在一個實施方案中，劑量在約0.1mg/kg至約3mg/kg的范圍內(nèi)，優(yōu)選在1mg/kg至約3mg/kg的范圍內(nèi)，約每約兩個月一次(或每兩個月以上時期一次，即少于每兩個月時期一次)施用，進一步優(yōu)選地，其中該抗體為抗kir抗體，進一步優(yōu)選地，其中該抗體為1-7f9?？芍貜?fù)治療，以使得治療方案引起間歇性基本完全受體飽和持續(xù)至少6個月、9個月或12個月的時期。

通常經(jīng)靜脈內(nèi)施用抗體，但其他合適的給藥方式為已知的，并且還描述于例如wo2008/084106中。

雖然抗kir抗體1-7f9或其s241p變體為用于調(diào)節(jié)nk細胞活性和/或治療疾病的優(yōu)選抗體，但其他抗nkcir和抗kir抗體也可用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。然而，此類抗體應(yīng)與抗kir抗體1-7f9具有相似的kd值，在患者體內(nèi)具有相似清除率，并且具有相似的分布體積，其中“相似”意指在相應(yīng)抗kir抗體1-7f9參數(shù)的約50％以內(nèi)，優(yōu)選約30％以內(nèi)。抗kir抗體1-7f9在最多0.015mg/kg的劑量下具有約4ng/ml的高親和力kd并且具有約20ng/ml的低親和力kd；其清除率為約0.5ml/h/kg，并且分布體積為約115ml/kg(參見wo2008/084106)。適用于本發(fā)明一種或多種方法中的示例性抗nkcir抗體可具有以下特性：(a)降低或阻斷nk細胞上的抑制性nkcir的信號傳導(dǎo)；(b)高親和力kd為約2至約6ng/ml；(c)低親和力kd為約10至約30ng/ml；(d)清除率為約0.25至約0.75ml/h/kg；(e)分布體積為約50ml/kg至約175ml/kg?？筺kcir抗體的受體占有率可使用如本發(fā)明中所述適于由抗體結(jié)合的特定nkcir的測定來測定(參見例如，實施例2)?？筺kcir抗體的藥代動力學(xué)特性可使用如本發(fā)明中所述適于特定抗nkcir抗體的測定來測定(參見例如，實施例1)。

實施例

實施例1–患者中的藥代動力學(xué)

通過elisa測定抗kir抗體1-7f9的血漿濃度，如下文所簡要描述。

用kir2dl3涂布溶液(100微升/孔)涂布培養(yǎng)板并且在約+4℃下孵育過夜。接著使用自動培養(yǎng)板洗滌器用洗滌緩沖液(400微升/孔)洗滌培養(yǎng)板3次。添加阻斷緩沖液(200微升/孔)并且在室溫下于培養(yǎng)板震蕩器上孵育培養(yǎng)板約2小時。此后，用洗滌緩沖液(400微升/孔)再洗滌培養(yǎng)板3次。

將標(biāo)準(zhǔn)物、質(zhì)量對照物和樣本添加至培養(yǎng)板中(100微升/孔)，之后在室溫下于培養(yǎng)板震蕩器上孵育約2小時。再洗滌培養(yǎng)板3次(如上)，之后添加小鼠抗人igg4:過氧化酶工作溶液(100微升/孔)。接著在室溫下于培養(yǎng)板震蕩器上再孵育培養(yǎng)板約2小時，之后再次將其洗滌。

將tmb添加至培養(yǎng)板中(100微升/孔)，接著在室溫下于培養(yǎng)板震蕩器上將其孵育約30分鐘。通過添加停止溶液(50微升/孔)終止酶促反應(yīng)。在450nm下(參考濾光片650nm)讀取吸光度。該研究的定量下限為5.000ng/ml并且該研究的定量上限為110.0ng/ml。

實施例2–kir占有率測定

通過四色熒光分析對人全血樣本評估受體占有率。簡而言之，評估經(jīng)edta抗凝的周邊血液中的t淋巴細胞和nk淋巴細胞上游離和結(jié)合kir2d受體的水平。游離位點測定將通過以綴合pe的1-7f9(其結(jié)合至kir2d分子)染色來評估未結(jié)合的kir2d。結(jié)合位點測定將通過以綴合pe的小鼠抗人igg4單克隆抗體(其識別結(jié)合至kir2d受體的1-7f9)染色來評估由1-7f9占有的kir2d受體。游離和結(jié)合測定將允許評估1-7f9-pe或抗higg4-pe的陽性染色百分比以及熒光強度[mesf]。在以下兩個測定中使用以下綴合抗體的組合：

游離位點測定：cd3/1-7f9/cd45/cd56

結(jié)合測定：cd3/higg4/cd45/cd56

在bectondickinsonfacscalibur上使用bectondickinsoncellquest軟件分析樣本。t細胞定義為cd45+cd3+淋巴細胞并且nk細胞定義為cd45+cd3-cd56+細胞。

實施例3-臨床aml研究

對年長aml患者(>60歲)進行單一劑量遞增試驗，所述患者在誘導(dǎo)和鞏固化學(xué)療法之后最初完全緩解，但不適于骨髓移植。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)3+3設(shè)計，并且總共研究7個劑量水平：0.0003mg/kg至3mg/kg的劑量范圍。在給藥之后，針對安全性、pk和kir占有率監(jiān)測患者直至kir占有率不再可檢測為止。

也進行擴展試驗。完成劑量遞增試驗并且仍完全緩解的aml患者可參與擴展試驗，其中以每月計對患者進行給藥至多6次。以與患者在先前試驗中所接受的劑量相同的劑量對患者進行給藥。

患者、材料和方法

在兩個試驗中，首先完全緩解(cr)并且不適于移植的年長aml患者(>60歲)適于所述研究。aml為根據(jù)who標(biāo)準(zhǔn)。(brunningrd,matutese,harrisnl等：acutemyeloidleukaemia:introduction.injaffees,harrisnl,steinh等編著：pathologyandgeneticsoftumorsofhaematopoieticandlymphoidtissues.lyon,france:iarcpress,2001.worldhealthorganizationclassificationoftumors,3，第77-80頁)。緩解為根據(jù)nci標(biāo)準(zhǔn)定義的形態(tài)完全緩解(cr)(cheson等，jco，第21卷，第24期，第4642-4649頁(2003))，或僅在1或2個誘導(dǎo)化學(xué)療法循環(huán)以及至少1個并且最多6個鞏固化學(xué)療法循環(huán)后血小板計數(shù)不完全恢復(fù)的cri。

在劑量遞增試驗中篩選時，自最后一次施用化學(xué)療法起的時間為至少30天并且至多120天。其他合格標(biāo)準(zhǔn)包括(但不限于)nk細胞上kir2dl1和kir2dl2/3的表達、ecog(oken,m.m.等，toxicityandresponsecriteriaoftheeasterncooperativeoncologygroup.amjclinoncol5:649-655,1982)狀態(tài)0-2以及來自先前治療的全部毒性皆已恢復(fù)。

對于擴展試驗，在可接受的安全性概況下完成劑量遞增試驗為另一合格標(biāo)準(zhǔn)。

其他標(biāo)準(zhǔn)包括絕對嗜中性粒細胞計數(shù)>1×10⁹/l，血小板>80×10⁹/l，骨骼中母細胞小于5％，無奧爾桿狀體(auerrod)；無疾病癥狀；所有先前抗白血病療法的急性毒性皆已恢復(fù)；患者nk細胞上的kir表達(結(jié)合抗kir抗體1-7f9的能力)；如由研究者所判定無嚴(yán)重相關(guān)器官功能障礙；以及臨床實驗室值如下：(a)血清肌酸酐≤2mg/dl，(b)總膽紅素≤1.5×正常值上限，以及(c)as≤3×正常值上限。

研究設(shè)計

劑量遞增試驗為多中心、開放標(biāo)簽、單劑量遞增安全性和耐受性試驗。計劃研究七個劑量水平：0.0003mg/kg、0.003mg/kg、0.015mg/kg、0.075mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg。一般選擇(3+3)設(shè)計用于該試驗。每個患者分配一個劑量，并且監(jiān)測安全性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)直至患者nk細胞上的kir占有率不可檢測為止。持續(xù)不斷地分析安全性、pk和kir占有率，并且在給藥后前4周期間從各劑量組獲得的數(shù)據(jù)一般形成劑量遞增決策的基礎(chǔ)。

擴展試驗被設(shè)計為重復(fù)給藥、多中心、開放標(biāo)簽、安全性和耐受性試驗。給予各個患者的劑量與患者在單劑量試驗中所接受的劑量相同?；颊呖梢?周時間間隔接受6次施用，即6個給藥循環(huán)，最長持續(xù)6個月時間。各給藥循環(huán)由給藥訪問和安全性監(jiān)測訪問組成。在最后一次給藥后，監(jiān)測患者的安全性直至患者nk細胞上的kir占有率不可檢測為止。該安全性追蹤期的持續(xù)時間可能根據(jù)所接受的劑量而定，并且預(yù)期最長為最后一次給藥后24周。

使用美國國家癌癥學(xué)會不良事件常見術(shù)語準(zhǔn)則(usnationalcancerinstitutecommonterminologycriteriaforadverseevents(ctcae))第3.0版評估抗kir抗體1-7f9施用的安全性(即任何觀察到的毒性)。另外評估藥代動力學(xué)終點、kir占有率、nk和t細胞活化的標(biāo)記、wt-1腫瘤標(biāo)記、無進展存活期以及總存活期。

aml研究的結(jié)果

在劑量遞增試驗中在接受0.0003mg/kg、0.003mg/kg、0.015mg/kg、0.075mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg以及3mg/kg的各劑量水平的患者中評估受體飽和?？偠灾?，劑量0.0003mg/kg引起kir部分飽和(50％占有率)持續(xù)約2小時時期；劑量0.003mg/kg引起kir完全飽和(90％占有率)持續(xù)不到24小時時期；劑量0.015mg/kg引起kir完全飽和持續(xù)不到7天時期；劑量0.075mg/kg引起kir完全飽和持續(xù)將近7天時期；劑量0.3mg/kg引起kir完全飽和持續(xù)7天以上并且不到14天時期；劑量1mg/kg引起kir完全飽和持續(xù)不到3周時期(介于約2周和3周之間)；劑量3mg/kg引起kir完全飽和持續(xù)4周以上時期。

評估以0.0003mg/kg、0.003mg/kg、0.015mg/kg、0.075mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg以及3mg/kg的劑量水平治療的患者從開始治療起的無病存活期(dfs)。結(jié)果示于表4中。接受1mg/kg和3mg/kg的劑量水平的患者的dfs相較于接受較低劑量的患者顯著較長。另外，當(dāng)復(fù)發(fā)時間是從開始iph21療法的時間起計算時存在較強的劑量關(guān)系指示，其中在較低劑量下11周的中值(3周至112周范圍)相較于在較高劑量下43周的中值(36周至71周范圍)。因此受體飽和(包括持續(xù)飽和持續(xù)較長時期)似乎不誘導(dǎo)nk細胞馴育(education)顯著低反應(yīng)性或缺乏并且似乎比用不使受體飽和的劑量重復(fù)刺激更有效。另外，接受1mg/kg和3mg/kg的患者的dfs(73周和對于仍無病的患者而言持續(xù)不斷)似乎比對于不接受治療的患者所預(yù)期的dfs長得多。因此，用抗kir抗體調(diào)節(jié)nk細胞在施用至有所緩解的患者時具有顯著有益作用。在重復(fù)給藥循環(huán)過程期間(此處6次施用1mg/kg和3mg/kg劑量水平以引起約一個月飽和，每月一次施用)進行抗體給藥以實現(xiàn)完全受體飽和至少2周，并且具體地講實現(xiàn)持續(xù)完全受體飽和時，該作用尤其高。

實施例4–對郁積型多發(fā)性骨髓瘤的臨床研究

對smm患者進行使用引起持續(xù)或間歇飽和的兩個不同劑量的抗kir抗體1-7f9的雙臂試驗(two-armtrial)。用以下治療第一組a：0.2mg/kg，該劑量在每次注射后經(jīng)至少約7天引起完全(>90％)但短暫飽和，并且組b接受2mg/kg，該劑量在兩次連續(xù)注射之間引起完全且持續(xù)飽和。以每月計對患者進行給藥至多6次，并且檢查安全性和功效的標(biāo)準(zhǔn)，包括指示疾病向mm進展的標(biāo)準(zhǔn)。

患者、材料和方法

適于該研究的患者患有根據(jù)源自國際骨髓瘤工作組定義(brjhaematol2003；121:749)的定義的具有任何風(fēng)險程度的smm:血清m蛋白≥3g/dl，和/或骨髓漿細胞≥10％而無終末器官損傷的跡象(crab)：

-(c)不存在高鈣血癥:ca<10.5mg/dl

-(r)不存在腎衰竭:肌酸酐<2mg/dl(177μmol/l)或計算的肌酸酐清除率(根據(jù)mdrd)>50ml/分鐘

-(a)不存在貧血:hb>11g/dl

-(b)標(biāo)準(zhǔn)骨骼檢查不存在溶解性骨骼病變(如果臨床指示，則可使用mri)。

患者還必須患有可測量的疾病(該疾病定義為血清m蛋白≥1g/dl的疾病)并且無疲勞、復(fù)發(fā)性感染或任何mm的臨床懷疑的跡象。

研究設(shè)計

評估兩個劑量，其中通過隨機分組來分配患者：

-在組a中：0.2mg/kg，該劑量在每次注射后經(jīng)至少7天引起完全(>90％)但短暫的飽和。

-在組b中：2mg/kg，該劑量在兩次連續(xù)注射之間引起完全且持續(xù)的飽和。

在兩個組中，每4周6次通過靜脈途徑經(jīng)1小時施用抗kir抗體1-7f9。在整個研究期間對所有患者使用相同劑量。將每4周一次施用抗kir抗體1-7f9，歷時6個循環(huán)。疾病在6個循環(huán)后對研究治療實現(xiàn)至少最小程度反應(yīng)的患者將再以6個循環(huán)的治療期加以治療。在研究中將追蹤患者至多12個月或18個月(即在完成治療后6個月)(或者如果治療完成后6個月kir飽和仍>30％，則時間更長)。

評估標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)經(jīng)修改以包括源自ebmt準(zhǔn)則(bladé等；brjhaematol1998；102:115)的最小程度反應(yīng)的imwg統(tǒng)一反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(duriebgm等；leukemia2006；20:1467)對反應(yīng)進行分類。最小程度反應(yīng)的定義源自ebmt標(biāo)準(zhǔn)(bladé等；brjhaematol1998；102:115)并且需要以下兩者：(a)血清蛋白含量降低25％至49％，(b)24小時尿蛋白m排泄減少50％至89％而仍超過200毫克/24小時。

對血清和尿電泳呈陰性的所有患者進行免疫固定和骨髓檢查；在基線時在疾病實現(xiàn)cr標(biāo)準(zhǔn)的所有患者中測量血清游離輕鏈，并且在疾病實現(xiàn)cr標(biāo)準(zhǔn)的所有患者中進行骨髓免疫表型分型。使用劑量測定法經(jīng)血清和尿蛋白質(zhì)電泳定量m蛋白。當(dāng)缺失尿樣本時，僅關(guān)于血清水平評估反應(yīng)。

另外，在研究時期內(nèi)記錄dor(反應(yīng)持續(xù)時間)、pfs(無進展存活期)以及進展時間(tpp)。

實施例5–在對第一線療法有反應(yīng)后多發(fā)性骨髓瘤的臨床研究

進行具有葛涵氏單階段ii期設(shè)計(gehan’sone-stagephaseiidesign)的開放標(biāo)簽、隨機化兩個獨立組、多中心研究以評估血清中m蛋白水平對人單克隆抗kir抗體1-7f9的兩個不同劑量方案的反應(yīng)?；颊邔⒁?.2mg/kg或2mg/kg的劑量(根據(jù)其隨機分組)接受4次1-7f9注射，以四周時間間隔經(jīng)一小時輸注施用。

患者、材料和方法

最初需要全身性療法并且接受第一線治療(常規(guī)劑量的化學(xué)療法或高劑量化學(xué)療法)以及自體性造血細胞移植，之后接受或未接受鞏固治療的mm患者適于該研究。

患者可有殘留疾病或?qū)ο惹爸委熡蟹磻?yīng)。殘留疾病為如下疾?。浩渲?a)可定量血清m蛋白≥3g/l，除β-球蛋白面積的峰值之外，在這種情況下如果≥10g/l血清m蛋白可視作可定量，或(b)血清m蛋白<3g/l，可測量的所涉及的游離輕鏈≥100mg/l以及異常游離輕鏈比率(<0.26或>1.65)。

對于有部分反應(yīng)(pr和vgpr)并且處于平臺期的患者，部分反應(yīng)應(yīng)符合imwg統(tǒng)一反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)：從第一線化學(xué)療法治療之前的血清m蛋白值降低≥50％，以及24小時尿m蛋白減少≥90％或減少至<200毫克/24小時。極佳部分反應(yīng)根據(jù)imwg統(tǒng)一反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)定義為血清m蛋白降低90％或90％以上以及尿m蛋白水平<100毫克/24小時。血清m蛋白≥3g/l的患者的平臺期：在至少2個月期間血清中的m蛋白含量穩(wěn)定，以及對于血清m蛋白<3g/l的患者：血清中的游離輕鏈水平穩(wěn)定。

此外，患者的ecog(美國東部腫瘤協(xié)作組(easterncooperativeoncologygroup))體能狀態(tài)為0、1或2。

研究設(shè)計

通過靜脈內(nèi)途徑經(jīng)1小時，根據(jù)隨機化組，以0.2mg/kg或2mg/kg的劑量每4周一次施用抗體1-7f9的輸注，持續(xù)4個循環(huán)。在4個月時有反應(yīng)(血清m蛋白下降)的患者將允許接受額外的每4個月一次施用的治療期。在整個研究期間對同一組中的所有患者使用相同劑量。

第一劑量0.2mg/kg預(yù)期引起完全受體飽和至多約1周。

第二劑量2mg/kg略高于使受體飽和至少1個月時期的劑量。

評估標(biāo)準(zhǔn)

基于使用劑量測定法于血清和24小時尿電泳中定量的m蛋白水平以及使用濁度測定法以結(jié)合位點freelite測定所定量的游離輕鏈水平來評估功效。評估存活終點，包括ttp(進展時間)、pfs(無進展存活期)、dor(反應(yīng)持續(xù)時間)以及os(總存活期)。

結(jié)果

在以0.2mg/kg或2mg/kg治療(4次給藥)的各組中的前7名患者中，在2mg/kg治療組(持續(xù)受體飽和)中觀察到一例對治療的反應(yīng)，如由m蛋白下降所評估(在2次連續(xù)訪視時確定m蛋白由25％降低)。

本文引用的所有參考文獻(包括出版物、專利申請和專利)全文在此以引用方式并入本，并且其引用程度如同各參考文獻在本文中個別且特定地指示以引用方式并入并且闡述其全文(達到法律允許的最大程度)，而與特定文獻在本文別處任何單獨地并入無關(guān)。

除非本文另外指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本發(fā)明的上下文中使用術(shù)語“一個(a)”、一種(an)”和“該(the)”以及類似指示詞視作涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。

除非另外說明，否則本文所提供的所有精確值表示相應(yīng)近似值(例如，關(guān)于特定因素或測量值所提供的所有示例性精確值可視為也提供適當(dāng)時經(jīng)“約”修飾的相應(yīng)近似測量值)。

除非另外說明或上下文明顯相矛盾，否則本文關(guān)于某一或某些要素使用諸如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的術(shù)語對本發(fā)明的任何方面或?qū)嵤┓桨傅拿枋鲋荚趯Α坝稍摶蛟摰忍囟ㄒ亟M成”、“基本上由該或該等特定要素組成”或“實質(zhì)上包含”該或該等特定要素的本發(fā)明的相似方面或?qū)嵤┓桨柑峁┲С?例如，除非另外說明或上下文明顯相矛盾，否則本文所述組合物包含特定要素應(yīng)理解為也描述組合物由該要素組成)。

除非另外主張，否則使用本文所提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，“諸如”)僅旨在更好地闡明本發(fā)明而不對本發(fā)明范疇構(gòu)成限制。本說明書中的語言不應(yīng)理解為指示任何未主張的要素對于本發(fā)明的實踐而言必不可少。

序列表

<110>innatepharmasa

andre,pascale

buffet,renaud

rozencweig,marcel

tiollier,jerome

<120>nk細胞調(diào)節(jié)治療和用于治療血液惡性疾病的方法

<130>44292.118602

<140>pct/us11/061840

<141>2011-11-22

<150>61/415973

<151>2010-11-22

<160>58

<170>patentin3.3版

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<213>小家鼠(musmusculus)

<400>1

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<213>小家鼠

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165170175

cyspheglyserpheargaspserprotyrglutrpserasnserser

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<213>智人

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354045

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505560

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65707580

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100105110

trpg1yproglythrvalval

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<212>prt

<213>智人

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151015

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210

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proservalpheproleualaprocysserargserthrsergluser

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180185190

thrvalproserserserleuglythrlysthrtyrthrcysasnval

195200205

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210215220

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355360365

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<213>智人

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<212>prt

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1510

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<212>prt

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asnproargproglyasntyrprotyrglymetasptyr

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<212>prt

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151015

gly

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<212>prt

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<220>

<223>抗體序列

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prothrthralathrargserseralametasptyr

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<212>prt

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<212>prt

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<220>

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151015

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202530

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serserprolysleutrpiletyrserthrserasnleualasergly

65707580

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859095

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100105110

glntyrhisargserproprothrpheglyglyglythrlysleuglu

115120125

ilelysarg

130

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<212>prt

<213>人工的

<220>

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metalavalleuglyleuleuphecysleuvalthrpheprosercys

151015

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202530

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alapheileserargleuserileasnlysaspasnserlyssergln

859095

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100105110

tyrcysalaargasnproargproglyasntyrprotyrglymetasp

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tyrtrpglyglnglythrservalthrvalserser

130135140

<210>58

<211>140

<212>prt

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<220>

<223>抗體序列

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metglucysasntrpileleupropheileleuservalthrsergly

151015

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proglyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

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505560

glutrpileglythriletyrproglyasnseraspthrasntyrasn

65707580

glnlysphelysglylysalalysleuthralavalthrserthrasn

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thralatyrmetgluleuserserleuthrasngluaspseralaval

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