本發(fā)明涉及高分子材料技術(shù)領(lǐng)域或是藥物制劑領(lǐng)域，特別涉及一種mPEG修飾的石膽酸和制備方法以及作為藥物載體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

當(dāng)代藥物學(xué)研究表明，藥物發(fā)揮其療效，除了與藥物本身的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)外，還與藥物的物理狀態(tài)如粒徑大小、表面電荷等相關(guān)。聚合物的親水和親油片段在水溶液中通過分子自組裝原理可以形成納米膠束。其表面親水、內(nèi)部親油，因此難溶性藥物通過這種膠束在傳送與控釋領(lǐng)域具有很多的優(yōu)點(diǎn)：提高難溶性藥物在溶液中的溶解度、減少易降解藥物在達(dá)到作用靶點(diǎn)的過程中發(fā)生降解、提高藥物的生物利用度、延長體內(nèi)循環(huán)時間、增強(qiáng)對細(xì)胞膜的粘附能力，同時還可以通過對膠束表面進(jìn)行化學(xué)修飾，使其靶向進(jìn)入疾病細(xì)胞減少藥物在使用時對正常組織的副作用。其中聚乙二醇(PEG)是最廣泛的表面修飾材料。

聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)系列產(chǎn)品包括單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，無毒、無刺激性，并與許多有機(jī)物組份有良好的相溶性。其優(yōu)異的生物相容性，在體內(nèi)能溶于組織液中，分子量4000以下的PEG能被機(jī)體迅速排除體外而不產(chǎn)生任何毒副作用，其安全性已經(jīng)得到了美國FDA的認(rèn)證。

石膽酸(Lithocholic acid，LCA)是膽汁酸之一，不溶于水，它不是由膽甾醇在肝中直接生物合成的，而是由鵝脫氧膽酸在腸內(nèi)通過細(xì)菌代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，石膽酸(LCA)具有剛性分子結(jié)構(gòu)，作為膽甾衍生物存在于哺乳動物膽汁中，具有一定的抗癌作用。

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)是一種天然存在的木脂素類化合物，具有抑制細(xì)胞微管蛋白聚合破壞微管形成的特性，產(chǎn)生顯著的抗癌和抗病毒活性。但是它難溶于水且毒副作用大，影響臨床應(yīng)用。其它抗癌藥如紫衫醇、多西紫杉醇和喜樹堿也有類似的問題。

本發(fā)明提供并公開兩親性mPEG修飾的石膽酸，它是在石膽酸上接親水性的mPEG鏈，改善石膽酸的親水性，成為一種兩親性聚合物膠束納米材料，易包裹難溶性藥物，提高難溶性藥物水溶性，便于制劑制備和使用，同時膠束納米粒外殼mPEG鏈有利于減少體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬，延長體內(nèi)循環(huán)時間，再者納米粒能提高藥物腫瘤靶向性，增加藥物療效，減少藥物毒副作用，另外石膽酸本身具有一定抗腫瘤活性，是一種潛在的抗腫瘤藥物，且無毒、生物相容性好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明描述并要求一種兩親性mPEG修飾的石膽酸、制備方法和其作為藥物膠束載體材料的應(yīng)用。它是一種安全性好，生物可降解、臨界膠束濃度低的兩親性聚合物，可在水中自組裝形成聚合物膠束，作為納米藥物傳遞系統(tǒng)，同時材料本身具有抑制腫瘤生長的作用。

本發(fā)明的目的在于提供一種兩親性mPEG修飾的石膽酸及其制備方法。

本發(fā)明的目的在于提供一種兩親性mPEG修飾的石膽酸作為藥物載體在藥物制劑學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的mPEG修飾的石膽酸，是指在石膽酸上羧基上接親水鏈mPEG，改善其兩親性，可在水中自組裝形成聚合物膠束。

本發(fā)明的目的在于提供一種兩親性mPEG修飾的石膽酸，其中單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分子量為300～10000。

本發(fā)明所述的兩親性mPEG修飾的石膽酸，其制備過程如下：

mPEG溶于無水二氯甲烷，加入氧化銀、碘化鉀、對甲苯磺酰氯(TsCl)，室溫下磁力攪拌2～4h，反應(yīng)液經(jīng)硅藻土過濾，過量二氯甲烷洗滌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉溶劑即得到mPEG-OTs粗品；將上述合成的mPEG-OTs溶于濃氨水，加入氯化銨，40℃恒溫油浴磁力攪拌3d，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，有機(jī)層用無水硫酸鎂脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，滴加過量冰乙醚，沉淀，過濾，收集沉淀，真空干燥12h，得mPEG-NH2；

稱取石膽酸(LCA)，置于含有二氯甲烷的三口圓底燒瓶中，攪拌下滴加N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，至石膽酸全部溶解，置于冰浴中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)，攪拌兩小時后，緩慢加入溶于二氯甲烷中的mPEG-NH2，在室溫下攪拌24h，反應(yīng)液用飽和食鹽水稀釋，分層后，收集有機(jī)層，水層用二氯甲烷萃取(5×100ml)，收集合并有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，滴加過量冰乙醚，沉淀，過濾，收集沉淀，真空干燥12h，得mPEG-LCA。

本發(fā)明的目的還在于提供一種載藥聚合物膠束納米粒，其特征在于用本發(fā)明所述的兩親性mPEG修飾的石膽酸，包載難溶性藥物，制成載藥聚合物膠束納米粒，其制備方法包括以下過程：將mPEG修飾的石膽酸溶于雙蒸水中，自組裝形成濃度1～4mg/ml的空白膠束溶液，將難溶性藥物溶于有機(jī)溶劑后，逐滴加入到上述的空白膠束溶液中，經(jīng)超聲處理后，置于雙蒸水中透析除去有機(jī)溶劑，透析液經(jīng)離心，過濾后，必要時凍干，制得150～300nm的聚合物載藥膠束。

本發(fā)明所述的mPEG修飾的石膽酸，具有膠束臨界膠束濃度低，生物相容性好，延長體循環(huán)時間，靶向到癌細(xì)胞能力強(qiáng)等特點(diǎn)。

本發(fā)明所述的mPEG修飾的石膽酸，具有易形成載藥聚合物納米粒，制備納米粒工藝簡便，納米粒膠束穩(wěn)定性好，載藥量高等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1：mPEG-LCA的¹H-NMR圖

圖2：mPEG-LCA的熒光發(fā)射光譜I₁/I₃與聚合物對數(shù)濃度關(guān)系圖

圖3：PPT溶液和PPT-mPEG-LCA NPs的體外釋放曲線

圖4：PPT溶液、PPT-mPEG-LCANPs和mPEG-LCA NPs對細(xì)胞抑制作用圖

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明所涉及的兩親性mPEG修飾的石膽酸、制備方法以及載藥應(yīng)用。但是，下述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被看作是以任意方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1mPEG-OTs的制備

稱取干燥處理后的mPEG(1900Da，4g)于50mL圓底燒瓶中，加入30mL無水二氯甲烷溶解。分別加入氧化銀(Ag2O，0.92g)、碘化鉀(KI，0.66g)、對甲苯磺酰氯(TsCl，0.76g)，室溫下磁力攪拌2～4h，反應(yīng)液經(jīng)硅藻土過濾，30℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，滴加冰乙醚，混勻，冰箱中沉淀十分鐘后，過濾沉淀，真空干燥12h，得mPEG-Ots(3.96g)。

實(shí)施例2mPEG-NH2制備

將實(shí)施例1合成的mPEG-OTs溶于50mL濃氨水，加入氯化銨(NH₄Cl，1.35g)，40℃恒溫油浴磁力攪拌3d。反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，有機(jī)層用無水硫酸鎂脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，滴加過量冰乙醚，冰箱中沉淀十分鐘后，過濾，收集沉淀，真空干燥12h，得mPEG-NH2(3.32g)。

實(shí)施例3mPEG-LCA制備方法：

稱取石膽酸(112.95mg，0.3mmol)，置于含有12ml二氯甲烷的三口圓底燒瓶中，滴加DMF，至石膽酸(LCA)全部溶解，置于冰浴中攪拌，加入EDAC(172.53mg，0.9mmol)，攪拌兩小時后，緩慢加入溶于3ml二氯甲烷mPEG-NH₂(380mg，0.2mmol)，在室溫下攪拌24h，反應(yīng)液用36ml的飽和食鹽水稀釋，分層后，收集有機(jī)層，水層用二氯甲烷萃取(5×100ml)。收集合并有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，滴加過量冰乙醚，沉淀，過濾，收集沉淀，真空干燥12h，得mPEG-LCA(306.1mg)，經(jīng)¹H-NMR(如圖1)確認(rèn)。

實(shí)施例4mPEG-LCA的臨界膠束濃度的測定

精密稱取1.011mg的芘，置于10ml容量瓶中，用丙酮稀釋，至刻度線，定溶，配制濃度為5.0×10^-6mol·L^-1。取9個10mL的容量瓶，分別加入上述配置好的芘溶液1mL，氮?dú)獯蹈?。另精密稱取10mg聚合物，置于10ml容量瓶中，用水稀釋，至刻度線，定溶，配制濃度為1mg/ml的聚合物溶液。然后在上述容量瓶中，分別加0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5和5ml的聚合物溶液，用水稀釋至刻度線，定容。配制成濃度為0.001，0.0025，0.05，0.01，0.025，0.05，0.1，0.25和0.5mg/ml的含有芘的聚合物溶液?；旌铣?0min，40℃水浴1h，靜止過夜。用熒光光譜儀Shimadzu RF5301測定熒光強(qiáng)度，芘的發(fā)射光譜為390nm，激發(fā)波長為374和386nm，狹縫寬度為10.0nm。

采用374和386nm處的熒光強(qiáng)度比值(I₁/I₃)比值與lgC(mg/ml)作曲線，處理數(shù)據(jù)，繪制圖表。通過切線法由緩慢增大的直線段和突躍直線段的交點(diǎn)所對應(yīng)的聚合物濃度即為該聚合物材料的臨界膠束濃度(CMC)的值。

芘熒光激發(fā)譜中I₃₇₄/I₃₈₆隨mPEG-LCA質(zhì)量濃度對數(shù)值的變化，拐點(diǎn)處(見圖2)表明聚合物在此濃度時恰好形成膠束，為3.8×10^-2mg·mL^-1。由此表明mPEG-LCA膠束的臨界膠束濃度較小，以此制備的載藥膠束具有較好的稀釋穩(wěn)定性。

實(shí)施例5空白mPEG-LCA納米粒(mPEG-LCA NPs)的制備

將mPEG修飾的石膽酸溶于雙蒸水中，經(jīng)超聲自組裝形成濃度1～4mg/ml的mPEG-LCA NPs溶液。

實(shí)施例6載鬼臼毒素(PPT)mPEG-LCA納米粒的制備

稱取10mg的mPEG-LCA溶于雙蒸水中制得2mg/ml的空白膠束溶液，磁力攪拌4h，將16mg的鬼臼毒素(PPT)溶于200μL甲醇中，逐滴加入到上述空白膠束溶液中，冰浴超聲30min(超聲功率95w，工作3s，間歇3s)，置于雙蒸水中透析除去甲醇，透析液經(jīng)離心，過濾后，制得粒徑為10～300nm的載藥mPEG-LCA膠束納米粒(PPT-mPEG-LCA NPs)溶液。PPT-mPEG-LCA NPs的一些性質(zhì)(見表1)。

表1.PPT-mPEG-LCA NPs的一些性質(zhì)。

結(jié)果顯示，mPEG修飾的石膽酸可以在水中自發(fā)形成膠束，制備的納米粒粒徑小，載藥量高?？梢栽黾庸砭识舅?PPT)的溶解度，另外PEG鏈修飾可以延長體循環(huán)時間，有利于納米聚合物膠束發(fā)揮更好的靶向作用。

實(shí)施例9載藥聚合物膠束納米粒體外釋放研究

體外釋放實(shí)驗(yàn)操作

精密稱取4ml載藥納米粒溶液及4ml PPT溶液，平行三批，裝入3500Da透析袋中，置于40mlpH7.4的PBS的釋放介質(zhì)中，37±0.5℃的恒溫?fù)u床中，100rpm振蕩，分別于0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，36h，48h，72h，96h取出1ml溶液，過0.45μm微孔濾膜，補(bǔ)液1ml，取20μl濾液進(jìn)高效液相測定濃度，以累計釋放百分率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制釋放曲線。處理數(shù)據(jù)，繪制圖表(見圖3)。

計算，測定各個時間樣品藥物濃度后Cn(μg/ml)，按公式求的校正濃度C，計算累計釋放百分率Q(t)，w為納米膠束中的PPT含量。

Q(t)％＝C(μg/ml)*40/W(μg)*100％

結(jié)果顯示，PPT-mPEG-LCA NPs在24h內(nèi)釋放低于60％，PPT在24h內(nèi)釋放接近90％，表明納米粒具有很好的緩釋作用。

實(shí)施例10體外細(xì)胞毒性研究

納米制劑組：PPT-mPEG-LCA NPs，培養(yǎng)液稀釋至濃度為0.39μg/mL～50μg/mL。

原料藥組：鬼臼毒素溶液(PPT)，培養(yǎng)液稀釋至濃度為0.39μg/mL～50μg/mL。

空白納米粒組：mPEG-LCA NPs，培養(yǎng)液稀釋至上述相同濃度。

取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的人肺癌細(xì)胞(A549)，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，計數(shù)制成細(xì)胞懸液；分別以6×10³～1×10⁴個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，置CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h：按上述實(shí)驗(yàn)方案分別給予所需濃度的納米制劑組、原料藥組、空白納米粒溶液，每一濃度平行6孔，繼續(xù)培養(yǎng)。48h后，向每孔加入10μL MTT液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4h后，向每孔加入150μL DMSO，使用酶標(biāo)儀檢測490nm處吸光度。處理數(shù)據(jù)，繪制圖表(見圖4)，計算半數(shù)抑制濃度IC₅₀值(見表2)

表2.體外對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用(IC₅₀值)

結(jié)果顯示，空白納米粒組對于A549細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用。PPT-mPEG-LCA NPs制劑組的IC₅₀小于PPT原料藥，說明載藥PPT-mPEG-LCA NPs能使鬼臼毒素對A549毒性明顯增強(qiáng)，提高抗腫瘤活性。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。