相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2009年6月12日提交的美國臨時申請第61/186,690號的權(quán)益，該申請的全文通過引用納入本文。

關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明

本發(fā)明在由以下機構(gòu)授予的美國政府資助下完成：nih-基金號dk071534。美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

本發(fā)明一般涉及用于代謝疾病如苯丙酮尿癥的營養(yǎng)控制的藥用食物。具體地，本發(fā)明涉及含糖巨肽作為主要蛋白來源的補充有附加量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和酪氨酸的藥用食物。

發(fā)明背景

苯丙氨酸(phe)是必需氨基酸，其在正常代謝個體內(nèi)由酶苯丙氨酸羥化酶(pah；ec1.14.16.1)轉(zhuǎn)化成酪氨酸。每年，在每15000個新生嬰兒中約有1個新生兒的此酶的功能缺失或減損，診斷為患有代謝疾病苯丙酮尿癥(pku)(scriverc.r.2001,themetabolic&molecularbasesofinheriteddisease,8thed.(遺傳疾病的代謝和分子基礎(chǔ)，第八版)，紐約：麥格勞-希爾教育出版集團(mcgraw-hill)。若患有pku個體的飲食沒有在生命前20天內(nèi)得到更改，phe及其降解產(chǎn)物會積累在血液和腦中，造成神經(jīng)損傷和認知障礙。

pku的膳食控制需要低phe飲食，建議維持終生。由于高phe含量，患pku的個體必須避免如肉、乳品、豆類和面包等食物。盡管一些低蛋白天然食物可用于低phe飲食中(主要是某些水果和蔬菜)，標(biāo)準(zhǔn)pku飲食中的大多數(shù)膳食蛋白通常由無phe氨基酸制劑提供。超過19歲成人的每日總phe消耗的記錄不能超過女性220-770毫克/天和男性290-1200毫克/天的目標(biāo)值(acostap和yanicellis.2001,方案1-苯丙酮尿癥(pku),見division,r.p.,(編者),therossmetabolicformulasystemnutritionsupportprotocols.(洛氏代謝制劑系統(tǒng)營養(yǎng)支持方案)，第4版：洛氏產(chǎn)品部(rossproductdivision))。

針對pku的基于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸制劑的飲食很難遵守、具有限制性且不可口。不遵守是標(biāo)準(zhǔn)pku飲食的常見問題，可引起嚴(yán)重的神經(jīng)心理損傷。因此，本領(lǐng)域需要比基于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的制劑更可口且為pku患者提供必要的蛋白，包括必需氨基酸，同時有效維持血液和大腦中低phe水平的藥用食物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供設(shè)計用于增加患代謝疾病如pku的個體的飲食適應(yīng)性和生活質(zhì)量的藥用食物。一方面，本發(fā)明包括用于控制代謝疾病的藥用食物。該食物含糖巨肽(gmp)和附加補充量的某些氨基酸，包括精氨酸和亮氨酸。所述藥用食物中，氨基酸精氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白；所述重量比更優(yōu)選約75毫克精氨酸/克總蛋白。所述藥用食物中，氨基酸亮氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約100-200毫克亮氨酸/克總蛋白；更優(yōu)選約100毫克亮氨酸/克總蛋白。

在某些實施方式中，所述藥用食物還含有補充量的氨基酸酪氨酸。所述藥用食物中氨基酸酪氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白；更優(yōu)選約85毫克酪氨酸/克總蛋白。

在一些實施方式中，所述藥用食物中附加的補充氨基酸總重量約為來自gmp中蛋白和補充氨基酸一起總重量的22％-38％。所述食物還可補充有其他氨基酸，包括但不限于組氨酸和色氨酸。在還含補充量的氨基酸色氨酸和組氨酸的實施方式中，優(yōu)選所述附加的補充氨基酸總重量約為來自gmp中蛋白和補充氨基酸一起總重量的25％-42％。任選地，所述藥用食物不附加補充氨基酸甲硫氨酸。

在某些實施方式中，本發(fā)明所包括的藥用食物可通過改變所述食物中含有的附加補充氨基酸的優(yōu)選組合來靶向特定代謝疾病。例如，對于控制苯丙氨酸代謝疾病如苯丙酮尿癥，所述食物優(yōu)選在gmp以外還含有補充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和酪氨酸。然而，對于控制酪氨酸代謝疾病如酪氨酸血癥，所述食物不含任何補充量的酪氨酸。

本發(fā)明所包括的藥用食物可以是各種標(biāo)準(zhǔn)食物產(chǎn)品的形式。優(yōu)選形式包括飲品、棒、薄餅(wafer)、布丁、凝膠體、脆餅干、果泥干、果仁奶油、醬、色拉醬、脆谷片、薄片、泡夫、丸或擠壓固體。

在某些實施方式中，所述藥用食物可在生產(chǎn)中經(jīng)熱處理，例如烘焙所述食物。發(fā)明人已確定在加熱處理期間，氨基酸水平可能降低；特別是任何添加的色氨酸、酪氨酸、組氨酸、亮氨酸或精氨酸的氨基酸水平。因此，在一些這種實施方式中，用于制作所述藥用食物的附加補充氨基酸的起始量高于用于非熱處理食物的量，從而最終重量比落入所述優(yōu)選范圍內(nèi)。作為非限制性示例，在優(yōu)選實施方式中，藥用食物中熱處理前的氨基酸色氨酸與總蛋白的起始重量比大于約12毫克色氨酸/克總蛋白，藥用食物中熱處理前的氨基酸酪氨酸與總蛋白的起始重量比大于約85毫克酪氨酸/克總蛋白，藥用食物中熱處理前的氨基酸組氨酸與總蛋白的起始重量比大于約23毫克組氨酸/克總蛋白，藥用食物中熱處理前的氨基酸亮氨酸與總蛋白的起始重量比大于約100毫克亮氨酸/克總蛋白，和/或藥用食物中熱處理前的氨基酸精氨酸與總蛋白的起始重量比大于約75毫克精氨酸/克總蛋白。

在這種示例性實施方式中，藥用食物中的起始氨基酸水平可以是使所述藥用食物中的氨基酸色氨酸與總蛋白的最終重量比為約12-14毫克色氨酸/克總蛋白，使所述藥用食物中的氨基酸酪氨酸與總蛋白的最終重量比為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白，使所述藥用食物中的氨基酸組氨酸與總蛋白的最終重量比為約20-24毫克組氨酸/克總蛋白，使所述藥用食物中的氨基酸亮氨酸與總蛋白的最終重量比為約100-200毫克亮氨酸/克總蛋白，和/或使所述藥用食物中的氨基酸精氨酸與總蛋白的最終重量比為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白。

用于pku控制飲食的本發(fā)明藥用食物必須含非常低的苯丙氨酸水平。因此，在某些優(yōu)選實施方式中，所述藥用食物所含gmp中每克gmp蛋白含不多于2.0毫克苯丙氨酸污染物。盡管該純度的gmp可由供應(yīng)商提供，但在某些這種實施方式中，所述gmp可在將其納入所述藥用食物前加以純化。由于向食物中添加純化gmp中所沒有的補充量的氨基酸，所以在某些優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的藥用食物含有低于1.5毫克苯丙氨酸/克總蛋白。某些非蛋白成分如巧克力可向所述藥用食物提供痕量的苯丙氨酸；因此在某些實施方式中，所述藥用食物含約1.2到約1.8毫克苯丙氨酸/克總蛋白。

用于控制酪氨酸代謝疾病的本發(fā)明藥用食物必須含非常低的苯丙氨酸和酪氨酸水平。因此，這種實施方式不含補充量的酪氨酸。在控制酪氨酸代謝疾病的實施方式中，所述藥用食物優(yōu)選優(yōu)選含少于2.0毫克的苯丙氨酸與酪氨酸加和/克總蛋白。

在用于控制酪氨酸代謝疾病的含補充量氨基酸精氨酸和亮氨酸的一些實施方式中，所述藥用食物中添加的補充氨基酸總重量為來自gmp中蛋白和補充氨基酸的總重量的約16％-29％。在用于控制酪氨酸代謝疾病的另一些實施方式中，在亮氨酸和精氨酸以外，所述藥用食物含有附加的補充量氨基酸組氨酸和色氨酸。在一些實施方式中，所述藥用食物中附加補充氨基酸的總重量優(yōu)選為來自gmp中蛋白和補充氨基酸一起的總重量的約19％-33％。為了在沒有酪氨酸時維持其他補充氨基酸的推薦補充水平，可在所述藥用食物中加入額外gmp。

第二方面，本發(fā)明包括制備上述藥用食物的方法。所述方法包括步驟：提供糖巨肽(gmp)和附加補充量的某些氨基酸，包括精氨酸和亮氨酸，和將所提供的材料與一種或多種非蛋白成分混合以制備食物。所提供氨基酸精氨酸與所提供總蛋白的重量比優(yōu)選為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白；更優(yōu)選約75毫克精氨酸/克總蛋白。所提供氨基酸亮氨酸與所提供總蛋白的重量比優(yōu)選為約100-200毫克亮氨酸/克總蛋白；所述比值更優(yōu)選約100毫克亮氨酸/克總蛋白。

在所述方法的一些優(yōu)選實施方式中，還提供補充量的氨基酸酪氨酸。所提供氨基酸酪氨酸與所提供總蛋白的重量比優(yōu)選為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白；所述比值更優(yōu)選約85毫克酪氨酸/克總蛋白。在一些此類實施方式中，所述藥用食物中附加補充氨基酸的總重量是來自gmp中蛋白和補充氨基酸一起的總重量的約22％-38％。

在某些實施方式中，本發(fā)明所包括的方法可以通過改變所提供的補充氨基酸組合而改進以使藥用食物靶向特定代謝疾病。例如，對于制備用于控制苯丙氨酸代謝疾病如苯丙酮尿癥的藥用食物，在gmp以外還提供補充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和酪氨酸。然而，對于制備用于控制酪氨酸代謝疾病如酪氨酸血癥的藥用食物，不提供補充量的酪氨酸。

在某些優(yōu)選實施方式中，所述方法包括純化所述gmp的步驟使其含有不多于2.0mg苯丙氨酸污染物/克gmp蛋白。在一些這種實施方式中，純化gmp的步驟可通過一種或多種下述技術(shù)進行：陽離子交換色譜、超濾、和滲濾。這種實施方式還可包括用凍干或噴霧干燥法干燥所述純化gmp的額外步驟。

某些實施方式可包括額外步驟以使所述食物形成布丁、凝膠體或果泥干的形式。其他實施方式可包括將所述食物形成棒、脆餅干、薄片、泡夫、丸，或?qū)⑺鍪澄飻D壓成擠壓固體的步驟。

在制備所述食物時，某些實施方式可包括熱處理所提供的混合物的額外步驟。該步驟的非限制性示例為在烘箱或其他加熱室中烘焙所述食物。發(fā)明人已確定某些氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、亮氨酸和組氨酸在熱處理期間有損失或降解。因此，在這種實施方式中，所提供用于制作所述藥用食物的附加補充氨基酸的起始量優(yōu)選高于用于非熱處理食物的量，從而由于氨基酸在熱處理時有損失或降解，最終重量比落入優(yōu)選范圍內(nèi)。

作為非限制性示例，在優(yōu)選實施方式中，熱處理前所提供氨基酸色氨酸與所提供總蛋白的起始重量比可大于約12毫克色氨酸/克總蛋白；熱處理前所提供氨基酸酪氨酸與所提供總蛋白的起始重量比可大于約85毫克酪氨酸/克總蛋白；熱處理前所提供氨基酸組氨酸與所提供總蛋白的起始重量比可大于約23毫克組氨酸/克總蛋白；熱處理前所提供氨基酸亮氨酸與所提供總蛋白的起始重量比可大于約100毫克亮氨酸/克總蛋白；和/或熱處理前所提供氨基酸精氨酸與所提供總蛋白的起始重量比可大于約75毫克精氨酸/克總蛋白。

熱處理期間，所述食物中這些氨基酸水平可能降低。優(yōu)選地，熱處理后所述藥用食物中氨基酸色氨酸與總蛋白的最終重量比為約12-14毫克色氨酸/克總蛋白，熱處理后所述藥用食物中氨基酸酪氨酸與總蛋白的最終重量比為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白，熱處理后所述藥用食物中氨基酸組氨酸與總蛋白的最終重量比為約20-24毫克組氨酸/克總蛋白，熱處理后所述藥用食物中氨基酸亮氨酸與總蛋白的最終重量比為約100-200毫克亮氨酸/克總蛋白，和/或熱處理后所述藥用食物中氨基酸精氨酸與總蛋白的最終重量比為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白。

第三方面，本發(fā)明包括治療代謝疾病的方法，所述疾病包括但不限于苯丙氨酸代謝疾病、酪氨酸代謝疾病、色氨酸代謝疾病、或組氨酸代謝疾病。這些方法包括步驟：給予患代謝疾病的人含糖巨肽(gmp)和附加補充量的兩種或更多氨基酸包括精氨酸和亮氨酸的藥用食物。所述藥用食物中氨基酸精氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白；所述比值更優(yōu)選約75毫克精氨酸/克總蛋白。所述藥用食物中氨基酸亮氨酸與蛋白的重量比優(yōu)選為約100-200毫克精氨酸/克總蛋白；更優(yōu)選約100毫克亮氨酸/克總蛋白。

在所述藥用食物沒有補充酪氨酸的實施方式中，用所述藥用食物治療的人可患有酪氨酸代謝疾病，包括但不限于i型酪氨酸血癥、ii型酪氨酸血癥、iii型酪氨酸血癥/霍金素尿癥、或尿黑酸尿癥/黃褐病。在這種實施方式中，所述藥用食物優(yōu)選含低于2.0毫克的苯丙氨酸與酪氨酸加和/克總蛋白。

在其他實施方式中，所給予的藥用食物還含有補充量的氨基酸酪氨酸。所述藥用食物中氨基酸酪氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白；所述比值更優(yōu)選約85毫克酪氨酸/克總蛋白。在這種實施方式中，用藥用食物治療的人可患有苯丙氨酸代謝疾病，包括但不限于苯丙酮尿癥(pku)；色氨酸代謝疾病，包括但不限于高色氨酸血癥；或組氨酸代謝疾病，包括但不限于肌肽血癥、組氨酸血癥或尿刊酸尿癥。在患有色氨酸代謝疾病的人接受治療的實施方式中，所給予的藥用食物不含補充量的色氨酸。在患有組氨酸代謝疾病的人接受治療的實施方式中，所給予的藥用食物不含補充量的組氨酸。

在被治療的人患有苯丙酮尿代謝疾病的實施方式中，該人優(yōu)選至少2歲。所給予的藥用食物優(yōu)選含低于1.5毫克苯丙氨酸/克總蛋白。

結(jié)合附圖，通過以下詳細描述，本發(fā)明的這些和其他特征對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。

附圖簡要說明

圖1顯示喂食含酪蛋白、補充有限制iaa的gmp(gmp充足)或補充有除phe外的限制iaa的gmp(gmpphe缺乏)的斷奶野生小鼠在42天中體重對時間的函數(shù)。數(shù)值為均值±sem；n＝10。對于gmpphe-缺乏組，從第4天至研究結(jié)束，將phe加入飲用水中(1gphe/l)。第14天到第42天的每天bw變化沒有顯著差異。

圖2顯示喂食gmp或氨基酸(aa)飲食47天的pku小鼠腦的5部分：小腦、腦干、下丘腦、頂葉皮層和前梨狀皮層中的phe濃度。數(shù)值為均值±sem；n＝8。*與aa不同，p≤0.001。

圖3顯示喂食gmp或氨基酸(aa)飲食47天的pku小鼠的小腦phe水平與血漿蘇氨酸(thr)+異亮氨酸(iso)+纈氨酸(val)水平的函數(shù)。

圖4顯示糖巨肽(biopure-gmp；達維思科食品國際有限公司(daviscofoodsinternationalinc.)，明尼蘇達州勒蘇爾)和酪蛋白(alacid；新西蘭乳品公司(newzealandmilkproducts)，加利福尼亞州圣羅莎)的氨基酸分布，表示為克氨基酸/100克產(chǎn)品。

圖5顯示在家持續(xù)15周進食氨基酸(aa)或糖巨肽(gmp)的單一pku對象在過夜禁食后早餐前獲得的平均phe濃度。數(shù)據(jù)顯示15周研究時間中的6周僅給對象提供已知phe濃度的食物：第3周及15周(aa飲食)和4、7、11及13(gmp飲食)。血液和血漿中的phe濃度用phe攝入校正，表示為每100mgphe攝入的mmolphe/l。用兩種方法之一測定phe濃度，串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)分析血點采集(bloodspotcollection)和aa分析儀測量血漿phe。數(shù)值為均值±se；aa飲食(血漿phen＝4和血液phen＝4)，gmp飲食(血漿phe100克和血液phen＝8)。*與aa飲食不同，p<0.05。

圖6顯示攝取糖巨肽(gmp)或aa飲食的餐后血漿中總氨基酸(aa)和血液尿素氮的濃度。早餐后2.5小時獲取血漿；n＝11，例外是研究第5和6天的血液尿素氮，其n＝6?？傃獫{aa表示血漿中所測所有aa的總和。數(shù)值為均值±sem。與所述aa飲食的第4天相比，攝取所述gmp飲食的總血漿aa增加且血液尿素氮減少。在重復(fù)測量anova中時間具有顯著的效果。*與所述aa飲食第4天有顯著差異，p<0.05(成對t檢驗，對象配對)。

圖7顯示患苯丙酮尿癥的個體對象(n＝11)在進食氨基酸飲食或糖巨肽(gmp)飲食4天后血漿中的苯丙氨酸濃度。早餐后2.5小時獲取血液，并分離血漿用于分析完整aa分布。進食所述aa飲食或所述gmp飲食4天后，對象顯示一定血漿苯丙氨酸濃度范圍。所述aa飲食最后一天(第4天)與所述gmp飲食最后一天(第8天)相比，血漿苯丙氨酸濃度沒有顯著差異；對象配對的成對t檢驗所得p＝0.173。組均值±sem為619±82μmol/l(aa飲食)和676±92μmol/l(gmp飲食)。血漿中苯丙氨酸濃度的變化均值為57±52μmol/l。phe，苯丙氨酸。

圖8顯示食用4天糖巨肽(gmp)和氨基酸(aa)飲食相比，患苯丙酮尿癥的對象中餐后(pp；早餐后2.5小時)血漿苯丙氨酸濃度與禁食血漿(禁食，禁食過夜)的比較。顯示組均值和個體對象的響應(yīng)；n＝6(第4天與第8天相比)。進食所述gmp飲食時，禁食與pp的濃度相比的血漿苯丙氨酸濃度沒有顯著變化(p＝0.349)；然而對象配對的成對t檢驗發(fā)現(xiàn)所述aa飲食顯示血漿苯丙氨酸顯著增加(p＝0.048)，。phe，苯丙氨酸。

圖9顯示出進食4天(第5-8天)所述糖巨肽(gmp)飲食后餐后血漿中的蘇氨酸和異亮氨酸濃度。數(shù)值為均值±sem；n＝11，早餐后2.5小時獲取血漿。研究第3和4天，所有對象進食氨基酸(aa)飲食；第5-8天，所有aa制劑換為gmp食物產(chǎn)品。在重復(fù)測量anova中時間具有顯著的效果。*與所述aa飲食最后一天(第4天)有顯著差異，p<0.05(成對t測試，對象配對)。**與所述aa飲食最后一天(第4天)有顯著差異，p<0.0001。異亮氨酸和蘇氨酸的血漿濃度分別在第5和7天后不再顯著增加。ile，異亮氨酸；thr，蘇氨酸。

圖10顯示gmp草莓布丁與氨基酸制劑(phlexy-10混合飲品,北美shs公司(shsnorthamerica)，美國馬里蘭州羅克維爾)相比的氨基酸分布。數(shù)值為均值±sd。樣本數(shù)為n＝2。gmp草莓布丁和氨基酸棒上方的相同字母表示數(shù)值沒有統(tǒng)計差異(p>0.05)。

圖11的柱狀圖顯示用四種不同標(biāo)準(zhǔn)(氣味、味道、余味和總分)對本發(fā)明的gmp食物bettermilk^tm和常用氨基酸制劑phenex-2^tm，的接受度評分。所述評分為27個無pku成人(無斜紋柱)和4個pku成人(斜紋柱)的平均。數(shù)值為均值±sd；*p≤0.01，成對t檢驗。接受度評分為：1–極討厭、2–非常討厭、3–討厭、4–有點討厭、5-有點喜歡、6-喜歡、7-非常喜歡和8-極喜歡。

圖12的柱狀圖顯示進行g(shù)mp飲食和氨基酸飲食的pku對象的生長素釋放肽、胰島素和氨基酸的血漿水平。生長素釋放肽和胰島素數(shù)值表示所述aa早餐的第3+4天、所述gmp早餐的第7+8天的各對象的等體積血漿合并。所述aa飲食最后一天(第4天)和所述gmp飲食最后一天(第8天)的餐后(pp)血漿aa值總和。所有數(shù)值為均值±sem；生長素釋放肽禁食數(shù)值的n＝6。*表明與所述aa早餐的餐后生長素釋放肽有顯著差異(p＝0.03，成對t檢驗，對象配對；n＝10)。**表明與所述aa早餐的胰島素有中等顯著差異(p＝0.053，成對t檢驗，對象配對；n＝10)。***表明與所述aa早餐的血漿aa總值有顯著差異(p＝0.049，成對t檢驗，對象配對；n＝11)。

圖13為進行g(shù)mp(空心圓)和氨基酸(實心圓)飲食的pku對象早餐開始180分鐘后血漿生長素釋放肽濃度(x軸)和早餐后2小時飽食感(y軸)的關(guān)系圖。較低的餐后生長素釋放肽與較高的飽食感關(guān)聯(lián)。線表示針對個體飲食治療數(shù)據(jù)擬合的最小二乘回歸線；aa早餐為虛線，gmp早餐為實線。線具有顯著差異。使用后退淘汰和混合效應(yīng)模型，預(yù)測餐后飽食評分的最佳模型包括飲食治療、餐后生長素釋放肽和生長素釋放肽與飲食治療之間的相互關(guān)系。

具體實施方式

i.概述

描述本發(fā)明材料和方法之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述具體方法、方案、材料和試劑，這些可發(fā)生變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅是描述具體實施方式，不應(yīng)用來限制本發(fā)明的范圍，所述范圍僅受任何隨后提交的非臨時申請的限制。

必須注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義，除非文中另有明確說明。同樣，術(shù)語“一個”(或“一種”)、“一種或多種”和“至少一種”在本文中可以互換使用。還應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語“包括”、“包含”、和“具有”可以互換使用。

除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。雖然也可采用與本文所述類似或等同的任何方法和材料實施或測試本發(fā)明，但對優(yōu)選的方法和材料加以描述。本文具體提及的所有出版物和專利都通過引用全文納入本文用于所有目的，包括描述和公開所述出版物報道的可與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的化學(xué)物質(zhì)、設(shè)備、統(tǒng)計分析和方法。本說明書引用的所有參考文獻都應(yīng)看作對本領(lǐng)域技術(shù)水平的指示。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認本發(fā)明不能憑借在先發(fā)明而先于這些公開內(nèi)容。

本文所用術(shù)語“約”表示在比給定值低10％或高10％范圍內(nèi)。

本文所用的術(shù)語“藥用食物”表示“制備以用于在醫(yī)師監(jiān)督下進食或腸道給予的食物，且該食物針對疾病或病癥的特定飲食控制，所述疾病或病癥的的獨特營養(yǎng)需求已基于公認的科學(xué)原理由醫(yī)學(xué)評估確立”(罕見病藥物法(orphandrugact)第5(b)部分,21u.s.c.360ee(b)(3))。藥用食物與用于特殊飲食應(yīng)用的廣義食物類別和實現(xiàn)健康要求的食物的區(qū)別在于藥用食物需要用于滿足疾病或病癥的獨特營養(yǎng)需求、在醫(yī)學(xué)監(jiān)督下使用且用于疾病或病癥的特殊飲食控制。

所述術(shù)語“藥用食物”并不涉及給帶病患者喂食的所有食物。藥用食物為針對嚴(yán)重患病或需要所述產(chǎn)品作為主要治療形式的患者的特殊配制和加工的食物(不同于以天然狀態(tài)使用的天然產(chǎn)生的食材)。被視為藥用食物的產(chǎn)品至少必須滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：所述產(chǎn)品必須為用于口服或管飼的食品；所述產(chǎn)品必須標(biāo)記為用于有獨特營養(yǎng)需求的特定醫(yī)學(xué)紊亂、疾病或病癥的飲食控制；且所述產(chǎn)品必須在醫(yī)學(xué)監(jiān)督下使用(摘自美國食品和藥品管理局，guidanceforindustry:frequentlyaskedquestionsaboutmedicalfoods(《行業(yè)指南：關(guān)于藥用食物的常見問題》)，食品安全和應(yīng)用營養(yǎng)中心，2007年5月)。

本文所用“補充量”的氨基酸表示添加到混合物中或包含在食物中且不是來自(a)gmp蛋白的痕量污染，或(b)非蛋白產(chǎn)品中所含痕量氨基酸的氨基酸量。非蛋白產(chǎn)品的非限制性示例為巧克力，其含有痕量phe但不被認為是蛋白或氨基酸的顯著來源。補充的量可來自被認為含有顯著含量的給定氨基酸或含該氨基酸的蛋白的任何其他來源，包括但不限于市售氨基酸補充物。

本文所用食物中“總蛋白”表示所述食物中來自gmp的蛋白和所述食物中來自附加補充氨基酸的蛋白總和。

在本公開中全文使用以下縮寫：aa，氨基酸；ala，丙氨酸；arg，精氨酸；asn，天冬酰胺；asp，天冬氨酸；bw，體重；cys，半胱氨酸；dri，膳食參考攝入量；gln，谷氨酰胺；glu，谷氨酸；gly，甘氨酸；gmp，糖巨肽；his，組氨酸；iaa，必需氨基酸；iso或ile，異亮氨酸；leu，亮氨酸；lnaa，大型中性氨基酸；met，甲硫氨酸；ms/ms，串聯(lián)質(zhì)譜；pah，苯丙氨酸羥化酶；pe，蛋白等價物；phe，苯丙氨酸；pku，苯丙酮尿癥；pro，脯氨酸；sem，均值標(biāo)準(zhǔn)差；ser，絲氨酸；thr，蘇氨酸；tyr，酪氨酸；trp，色氨酸；val，纈氨酸；wt，野生型。

ii.本發(fā)明

發(fā)明人近期確定，用補充有添加量的氨基酸精氨酸、組氨酸、亮氨酸和任選地其他氨基酸的糖巨肽蛋白制作的藥用食物由于食物中所含氨基酸/蛋白源而給患pku或其他代謝疾病的個體在飲食中提供完備的低phe蛋白源。這些食物比標(biāo)準(zhǔn)aa制劑更可口，且優(yōu)化gmp使血液和腦中phe水平更低的能力。因此，本發(fā)明提供藥用食物、制作所述食物的方法和給予患代謝疾病如pku的個體所述食物的方法。

一方面，本發(fā)明提供含完備低phe蛋白來源的藥用食物。本發(fā)明的藥用食物中的主要蛋白源是糖巨肽(gmp)，一種在其純形式中不含phe的天然產(chǎn)生的蛋白。奶酪制作中，當(dāng)凝乳酶在κ-酪蛋白的105-106氨基酸殘基之間特異切割時形成gmp。副-κ-酪蛋白(殘基1-105)凝固形成奶酪凝乳，而gmp(殘基106-109)留在乳清中。gmp高度極性且在一個或多個蘇氨酸位點被半乳糖胺、半乳糖和o-唾液酸糖基化。

“gmp蛋白”指沒有糖基化部分的純gmp多肽。gmp蛋白含47％(w/w)必需氨基酸，但不含組氨酸(his)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)、精氨酸(arg)、半胱氨酸(cys)或phe。

可使用許多方法從乳清中分離gmp。純化方法的詳細示例可參見例如美國專利號5,968,586。從乳清中分離gmp的現(xiàn)行大規(guī)模技術(shù)使用離子交換色譜或超濾。gmp的等電點(pi)低于3.8，而其他主要乳清蛋白的pi值高于4.3。gmp和其他乳清蛋白的這種物理化學(xué)差異常用于分離方法以乳清中分離gmp。

市售gmp含來自殘留乳清蛋白的phe污染物。市售gmp中的phe污染物含量相差很大(即，5mgphe/g產(chǎn)品，生產(chǎn)商文獻，達維思科食品國際有限公司，美國明尼蘇達州勒蘇爾；2.0mgphe/g產(chǎn)品，lacprodancgmp-20生產(chǎn)商文獻，阿拉食品公司(arlafoods)，丹麥奧爾胡斯)。傳統(tǒng)氨基酸制劑不含phe，這使患有pku的個體能食用含phe的天然食物以滿足其每日攝入。本發(fā)明所用gmp優(yōu)選含不多于2.0mgphe/ggmp。

在某些優(yōu)選實施方式中，市售獲得的gmp在用于本發(fā)明的藥用食物前可純化以去除phe污染物?？赡艿募兓^程本領(lǐng)域已熟知，且包括但不限于通過吸收到陽離子交換樹脂上來捕獲粗gmp中污染的乳清蛋白和收集流通物組分中的純化gmp。本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)例如超濾/滲濾(uf/df)可用于濃縮gmp和清除肽、鹽和非蛋白氮。純化和濃縮步驟后，可用本領(lǐng)域已知的很多技術(shù)干燥該純化的濃縮gmp，包括但不限于凍干和噴霧干燥。

純化的gmp不含his、tyr、trp、cys、arg或phe、且亮氨酸(leu)含量低。his、trp、phe和leu都是必需氨基酸。tyr和arg為條件必需氨基酸，由于phe是tyr的前體，且谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸是arg的前體。因此，gmp作為食物中主要蛋白源必須加以補充以提供營養(yǎng)完備的蛋白。發(fā)明人已確定氨基酸精氨酸、亮氨酸、和酪氨酸的補充量的優(yōu)選范圍，其與本領(lǐng)域以前建議的有所不同。

因此，在某些優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明包括用于控制代謝疾病的藥用食物，所述藥用食物含糖巨肽(gmp)和附加的優(yōu)化補充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸和/或酪氨酸。其他氨基酸也可包含在本發(fā)明的藥用食物中。然而，由于發(fā)明人已確定甲硫氨酸補充不是必需，且事實上其會使藥用食物較不可口，所以在某些優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的藥用食物不含附加補充量的氨基酸甲硫氨酸。批準(zhǔn)用于食品生產(chǎn)的氨基酸獲自本領(lǐng)域已知的多種商業(yè)來源。

所述藥用食物中各補充氨基酸的優(yōu)選重量比表示成該氨基酸在最終藥用食物中每克總蛋白的毫克數(shù)，一克總蛋白定義為來自gmp的蛋白(克氮x6.25)和來自附加補充氨基酸的蛋白(克氮x6.25)之和。在某些優(yōu)選實施方式中，所述藥用食物中的附加補充氨基酸總重量優(yōu)選為來自gmp的蛋白和補充氨基酸一起的總重量的約22％-38％。

所述藥用食物中氨基酸精氨酸與蛋白的重量比優(yōu)選為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白；所述藥用食物中氨基酸精氨酸與總蛋白的重量比更優(yōu)選為約75毫克精氨酸/克總蛋白。

所述藥用食物中氨基酸亮氨酸與蛋白的重量比優(yōu)選為約100-200毫克亮氨酸/克總蛋白；所述藥用食物中氨基酸亮氨酸與總蛋白的重量比更優(yōu)選為約100毫克亮氨酸/克總蛋白。

在含補充量的酪氨酸的那些實施方式中，所述藥用食物中氨基酸酪氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白；所述藥用食物中氨基酸酪氨酸與總蛋白的重量比更優(yōu)選為約85毫克酪氨酸/克總蛋白。

在某些實施方式中，所述藥用食物可任選包含附加的補充氨基酸。例如，組氨酸和/或色氨酸可包含在所述藥用食物中。對于組氨酸補充，所述藥用食物中氨基酸組氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約20-24毫克組氨酸/克總蛋白；所述藥用食物中氨基酸組氨酸與總蛋白的重量比更優(yōu)選為約23毫克組氨酸/克總蛋白。

對于色氨酸補充，所述藥用食物中氨基酸色氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約12-14毫克色氨酸/克總蛋白；所述藥用食物中氨基酸色氨酸與總蛋白的重量比更優(yōu)選為約12毫克色氨酸/克總蛋白。

在某些實施方式中，所述藥用食物可額外補充有必需維生素和礦物質(zhì)，在完備蛋白來源外提供所需的非蛋白營養(yǎng)補充。此外，所述藥用食物可包含常規(guī)食物中通常包含的多種其他低phe物質(zhì)(非蛋白成分)。

本發(fā)明不限于治療phe代謝疾病如pku的藥用食物；相反，本發(fā)明的藥用食物還包括用于控制不存在于gmp中的其他氨基酸的代謝疾病的食物(即，his、trp、tyr或phe的代謝疾病)。對于用于控制酪氨酸代謝疾病如酪氨酸血癥的實施方式，所述食物中包含優(yōu)化的補充量精氨酸和亮氨酸，但不包含補充量的酪氨酸。為了適應(yīng)酪氨酸的缺失，可增加gmp含量。在一些這種實施方式中，附加補充的氨基酸總重量優(yōu)選為來自gmp的蛋白和補充氨基酸一起的總重量的約16％-29％。在這種實施方式中，酪氨酸和苯丙氨酸的總含量優(yōu)選低于2.0mg/克總蛋白。

本發(fā)明的藥用食物包括各種食物類型，包括但不限于制劑、飲品、棒、薄餅、布丁、凝膠體、脆餅干、果泥干、果仁奶油、醬、色拉醬、薄片、脆谷片、泡夫、丸或擠壓固體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地識別這些和其他可能的食物類型，且常規(guī)制備方法可使用本發(fā)明的成分和常規(guī)食物常用的其他低phe物質(zhì)來制作本發(fā)明的藥用食物。

本發(fā)明包含的許多可能類型的食物在生產(chǎn)中經(jīng)熱處理。作為非限制性示例，脆餅干、棒和脆谷片可能經(jīng)烘焙。擠壓固體可能在擠壓前被加熱。果泥干、醬和脆谷片可通過加熱混合物然后冷卻，和在一些情況下干燥最終產(chǎn)物而制作。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明的藥用食物在生產(chǎn)中經(jīng)熱處理。

發(fā)明人已確定熱處理可導(dǎo)致附加補充氨基酸顯著損失。例如，游離氨基酸如trp、tyr、his、leu和arg可能發(fā)生麥拉德反應(yīng)。光照可加速tyr光解反應(yīng)。熱處理或光照所導(dǎo)致附加補充量氨基酸的損失將增加需要加入所述藥用食物中的附加補充氨基酸含量。因此，在一些優(yōu)選實施方式中，經(jīng)熱處理的食物中各補充氨基酸的起始重量比會設(shè)成高于不經(jīng)熱處理食物的量，從而各補充氨基酸在損失后的最終剩余量落入優(yōu)選的重量比。

另一方面，本發(fā)明包括用于管理代謝疾病如pku的藥用食物的制作方法。所述方法包括步驟：提供糖巨肽(gmp)和附加補充量的某些氨基酸包括精氨酸和亮氨酸，并將所提供的材料與其他物質(zhì)混合以制備所述食物。在本方法的某些實施方式中，所提供氨基酸精氨酸與所提供蛋白的重量比為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白，優(yōu)選約75毫克精氨酸/克總蛋白。在本方法的某些實施方式中，所提供氨基酸亮氨酸與所提供總蛋白的重量比為約100-200毫克精氨酸/克總蛋白，優(yōu)選約100毫克亮氨酸/克總蛋白。

如上所述，各種其他物質(zhì)可用于制作所述食物，包括通常用于制作常規(guī)食物的非蛋白成分。然而，所用的其他物質(zhì)必須為低phe或無phe物質(zhì)。

在一些實施方式中，所述方法中使用的附加補充氨基酸總重量為來自gmp中蛋白和補充氨基酸一起的總重量的約22％-38％。本方法包括用于制作各種食品類型的常規(guī)技術(shù)。作為非限制性示例，所述食物混合物可形成布丁、凝膠體或果泥干；所述食物混合物可制成棒、脆餅干、薄片、泡夫或丸；或者所述食物可擠壓為擠壓固體。在本方法的一些實施方式中，所述食物混合物經(jīng)熱處理。熱處理的示例包括但不限于烘焙所述食物混合物、對所述食物混合物進行巴式滅菌、煮沸所述加熱混合物或?qū)λ龌旌衔镞M行熱擠壓。

在本方法的某些實施方式中，所提供氨基酸酪氨酸與所提供蛋白的重量比為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白，優(yōu)選約85毫克酪氨酸/克總蛋白。

在本方法的某些實施方式中，所提供氨基酸組氨酸與所提供蛋白的重量比為約20-24毫克組氨酸/克總蛋白，優(yōu)選約23毫克組氨酸/克總蛋白。

在本方法的某些實施方式中，所述食物中氨基酸色氨酸與蛋白的重量比為約12-14毫克色氨酸/克總蛋白，優(yōu)選約12毫克色氨酸/克總蛋白。

本方法還包括純化所述gmp的步驟使其含有不多于2.0mg苯丙氨酸污染物/克gmp蛋白。本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)可用于純化所述gnp，包括但不限于使用陽離子交換色譜、超濾和滲濾。所述純化的gnp還可用許多已知的干燥技術(shù)中的任意方法進行干燥，所述方法包括但不限于凍干或噴霧干燥。

在另一方面，本發(fā)明包括治療代謝疾病的方法。該方法包括步驟：選擇患代謝疾病的患者并給予該患者含糖巨肽(gmp)和附加優(yōu)化補充量氨基酸精氨酸和亮氨酸的藥用食物。所述藥用食物中氨基酸精氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白；更優(yōu)選約75毫克精氨酸/克總蛋白。所述食物中氨基酸亮氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約100-200毫克精氨酸/克總蛋白；更優(yōu)選約100毫克亮氨酸/克總蛋白。

所述代謝疾病優(yōu)選phe代謝疾病、his代謝疾病、trp代謝疾病、tyr代謝疾病或phe代謝疾病之一。在一些實施方式中，所給予的藥用食物中附加補充氨基酸的總重量為gmp蛋白和補充氨基酸一起的總重量的約22％-38％。

在本方法的某些實施方式中，所述藥用食物不補充酪氨酸，且所選患者患有酪氨酸代謝疾病。在這種實施方式中，所述藥用食物優(yōu)選含低于2.0毫克的苯丙氨酸與酪氨酸加和/克總蛋白。在一些這種實施方式中，所給予的藥用食物中的附加補充氨基酸總重量為gmp蛋白和補充氨基酸一起的總重量的約16％-29％。

本方法的某些實施方式中，本方法所用的藥用食物還包含附加的優(yōu)化補充量的氨基酸酪氨酸。所述藥用食物中氨基酸酪氨酸與總蛋白的重量比優(yōu)選為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白；更優(yōu)選約85毫克酪氨酸/克總蛋白。如果包含優(yōu)化量的精氨酸、亮氨酸和酪氨酸，則所選的患者可患有苯丙氨酸代謝疾病、組氨酸代謝疾病或色氨酸代謝疾病。若患者患有組氨酸代謝疾病，則所給予的藥用食物不含補充量的組氨酸。若患者患有色氨酸代謝疾病，則所給予的藥用食物不含補充量的色氨酸。

在上述的限制下，其他氨基酸可任選地包含在本方法所用的藥用食物中。在本方法的某些實施方式中，所述藥用食物中的氨基酸組氨酸與總蛋白的重量比為約20-24毫克組氨酸/克總蛋白，優(yōu)選約23毫克組氨酸/克總蛋白。

在本方法的某些實施方式中，所述食物中的氨基酸色氨酸與總蛋白的重量比為約12-14毫克色氨酸/克總蛋白，優(yōu)選約12毫克色氨酸/克總蛋白。

在某些優(yōu)選實施方式中，所選患者患有代謝疾病pku。本發(fā)明的藥用食物比傳統(tǒng)氨基酸制劑更可口，有助于降低血漿和腦中的有害phe水平，并有助于提高此類患者中的蛋白存留。在一些實施方式中，所述食物給予至少2歲的人。

盡管在某些優(yōu)選實施方式中，所選患者具有代謝疾病pku，但本方法包括將所述藥用食物給予患有其他代謝疾病的患者。給予本發(fā)明的食物可有效治療的其他代謝疾病包括：酪氨酸代謝疾病(i型酪氨酸血癥、ii型酪氨酸血癥、iii型酪氨酸血癥/霍金素尿癥和尿黑酸尿癥/.黃褐病)；色氨酸代謝疾病(高色氨酸血癥)；和組氨酸代謝疾病(肌肽血癥、組氨酸血癥和尿刊酸尿癥)。

提供以下實施例僅用于說明目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實際上，本發(fā)明所示和描述以外的各種變化通過以上描述以及以下的實施例對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，所述變化也包括在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。

iii.實施例

實施例1：pku鼠模型中補充的糖巨肽飲食

在本實施例中，申請人證明在pku的標(biāo)準(zhǔn)小鼠模型中，與氨基酸飲食相比，補充的糖巨肽飲食支持生長并降低血漿和腦中的苯丙氨酸濃度。pah缺失的小鼠模型pah^enu2小鼠(pku小鼠)是研究pku營養(yǎng)控制的合適模型，因為其表現(xiàn)出與患pku人類相似的高苯丙氨酸血癥和認知缺陷。此外，與膳食蛋白主要由氨基酸提供的人低phe飲食相對應(yīng)，pku小鼠研究使用的基于氨基酸的飲食常不含phe而在飲用水中提供phe。我們的目的是評估攝取含gmp飲食作為單一蛋白來源對野生型(wt)和pku小鼠支持生長并影響血漿和腦中氨基酸特別是phe的濃度的情況。結(jié)果表明，與氨基酸飲食相比，喂食gmp的pku小鼠能適當(dāng)生長且血漿及腦中phe濃度顯著降低。

材料和方法

小鼠.報道的動物設(shè)施和實驗方案經(jīng)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校動物護理和使用委員會(universityofwisconsin-madisoninstitutionalanimalcareandusecommittee)批準(zhǔn)。重量18-22g的4-6周齡雄性和雌性野生型小鼠與pku小鼠(c57bl/6，杰克遜實驗室公司(jacksonlaboratories))在相同環(huán)境下飼養(yǎng)。pku小鼠為pah突變純合體，但其經(jīng)繁殖并在c57bl/6背景上回交以提高交配能力。pku小鼠交配對由俄勒岡州波特蘭市的俄勒岡健康和科學(xué)大學(xué)的caryo.harding提供。對尾生物活檢樣品dna在外顯子7上的擴增區(qū)域用pcr分析進行pah^enu2突變存在的基因分型。小鼠以12-:12-小時明:暗周期在維持22℃屋內(nèi)的不銹鋼、網(wǎng)底籠中獨立飼養(yǎng)，不禁水。所述小鼠每天10點稱重并測定每日食物攝取。各實驗結(jié)束時，在8點和10點之間通過麻醉儀器(isoflo，雅培公司(abbottlaboratories))用異氟烷麻醉小鼠并通過心臟穿刺/放血殺死小鼠，殺死前一小時移去食物。

飲食。設(shè)計純化的的飲食以提供相似量的維生素、礦物質(zhì)、能量和主要營養(yǎng)素(參見表1)。所述飲食中的蛋白來源由酪蛋白、游離氨基酸、gmp(biopuregmp,達維思科食品公司)和經(jīng)加工以減少殘留phe含量的gmp(參見etzelm.r.,jnutr.2004；134:s996–1002)提供。所述gmp飲食以nrc推薦所需量(參見nrc,nutrientrequirementoflaboratoryanimals(《實驗室動物營養(yǎng)需求》)，第4版，華盛頓特區(qū)：國家科學(xué)出版；1995中“小鼠的營養(yǎng)需求”)的1.5倍補充下述限制iaa以彌補氨基酸比完整蛋白更快速的吸收和降解：精氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸。所述氨基酸和gmp低phe飲食的氮含量相似，分別為24.1和22.9克氮/千克飲食，且兩種飲食都提供175克氨基酸/千克飲食。所述飲食的完整氨基酸分析在密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校(密蘇里州哥倫比亞)的試驗中心化學(xué)實驗室中進行(見表2)。

表1：實驗飲食

¹biopuregmp；達維思科食品國際有限公司，明尼蘇達州勒蘇爾。

²經(jīng)加工以減少phe含量的市售gmp。

³此外，下述l-氨基酸包括在總計175克氨基酸/千克飲食中：丙氨酸，3.5；天冬酰胺，6.0；天冬氨酸，3.5；谷氨酸，40；甘氨酸，23.3；異亮氨酸，8.2；鹽酸賴氨酸，18.0；脯氨酸，3.5；絲氨酸，3.5；蘇氨酸，8.2；和纈氨酸，8。

⁴報道于reeves等，ain-93purifieddietsforlaboratoryrodents:finalreportoftheamericaninstituteofnutritionadhocwritingcommitteeonthereformulationoftheain-76arodentdiet(用于實驗嚙齒動物的ain-93純化飲食：美國營養(yǎng)研究院專門書面委員會關(guān)于ain-76a嚙齒動物飲食重新配制的最終報告)jnutr.1993；123:1939–51。

表2：飲食的氨基酸分布

實驗設(shè)計。進行三項實驗。實驗1檢測4周齡雄性wt小鼠喂食42天補充有iaa的gmp以維持食物攝取和生長是否充足。包括三組膳食治療組(n＝10/組)：酪蛋白對照、補充所有限制iaa的gmp(gmp充足)、和為了證實phe限制性而經(jīng)加工以減少殘留phe并補充有除phe外的所有限制iaa的gmp(gmpphe缺乏)。在喂食gmpphe缺乏的飲食3天后食物攝取衰退時，我們在第4天將phe加入飲用水中(1gphe/l)。

實驗2檢測在飲用水中提供21天的phe(1gphe/l)時含氨基酸和gmp的飲食維持雄性和雌性pku小鼠(5-8周齡)生長的能力。包括三組膳食治療組(n＝10/組)：喂食phe缺乏的gmp飲食的pku小鼠，喂食phe缺乏的氨基酸飲食的pku小鼠，和喂食gmp充足飲食的wt小鼠。我們測定pku小鼠的每日飲用水?dāng)z取并根據(jù)蒸發(fā)調(diào)整以確定phe消耗量。

實驗3評估喂食47天含補充有最小量phe(實驗2中確定)的氨基酸和gmp的飲食維持雄性和雌性pku小鼠生長和影響其血漿和腦中氨基酸濃度的能力。包括四組膳食治療組：喂食酪蛋白(n＝8)或gmp充足飲食(n＝7)的6周齡wt小鼠和喂食所述低phe氨基酸(n＝10)或低phe的gmp飲食(n＝11)的8-10周齡pku小鼠。各治療組中的雄性和雌性小鼠數(shù)量相似。喂食21天后通過眼眶放血獲取血液樣品用肝素化毛細管進行氨基酸分析(n＝5/組)。47天后小鼠經(jīng)麻醉，用心臟放血殺死并取下頭部。迅速移出腦并置于干冰冷卻的玻璃板上。用可見標(biāo)志從下述5個區(qū)域取樣品：小腦、腦干、下丘腦、頂葉皮層和前梨狀皮層。樣品放入預(yù)先稱重的聚苯乙烯管中，稱重測定樣品質(zhì)量并-80℃保存直至處理。

氨基酸分析。通過心臟穿刺將血液收集到含終濃度2.7mmol/ledta的注射器中，并通過4℃1700xg離心15分鐘來分離血漿。用裝有離子色譜系統(tǒng)的beckmann6300氨基酸分析儀用茚三酮柱后衍生法檢測血漿中游離氨基酸的分布。加入內(nèi)標(biāo)和注入所述柱中前，用磺基水楊酸將樣品去蛋白化、離心(14000xg；5分鐘)并通過0.2-μm注射過濾器。

腦中游離氨基酸分布在加州大學(xué)戴維斯分校獸藥學(xué)院的氨基酸分析實驗室(加利福尼亞州，戴維斯)中用biochrom30氨基酸分析儀(生物色譜公司(biochrom))進行測定。從腦樣品中提取氨基酸的過程包括以1:10(重量:體積)的比值添加含100μmol/l正亮氨酸為內(nèi)標(biāo)的3％磺基水楊酸(西格瑪化學(xué)品公司(sigmachemicals))，用超聲針均質(zhì)2分鐘，4℃14,000xg離心20分鐘，和用0.45-μm注射器驅(qū)動的過濾器過濾上清液。用0.4mol/llioh將所述濾液調(diào)到ph2.2并將0.05ml注入柱中。數(shù)值表示為納摩爾氨基酸/克組織濕重。

統(tǒng)計。用sas8.2版(sas研究院)和r(維也納大學(xué)，奧地利維也納)進行統(tǒng)計分析。用普通線性模型分析數(shù)據(jù)。膳食治療組之間的差異用保護性最小顯著差異技術(shù)確定。當(dāng)殘差圖表明組間的方差不齊(unequalvariance)時(一些數(shù)據(jù)中出現(xiàn))，對經(jīng)自然對數(shù)變換的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。適當(dāng)時，將性別包括為協(xié)變量以調(diào)整其潛在影響。治療組之間的體重(bw)變化用實驗1中的重復(fù)測量分析進行評價。在pku小鼠中，用簡單線性回歸檢測死亡前48小時的氨基酸膳食攝取和血漿及腦中氨基酸濃度之間的關(guān)系。所有數(shù)值表示為均值±se；p≤0.05視為顯著。

結(jié)果

實驗1。3組膳食治療組之間的初始和最終bw沒有差異(見圖1)。整個42天的研究中酪蛋白和gmp充足組之間的食物攝取和bw沒有差異。3天后小鼠停止進食所述phe缺乏的gmp飲食，此時將phe加入飲用水中并恢復(fù)食物攝取。第14天到第42天，3個膳食組的每天bw變化沒有差異。

與酪蛋白相比，攝取gmp的血漿中氨基酸的分布顯著改變。喂食gmp充足或phe缺乏飲食的野生型小鼠顯示血漿iaa濃度升高，蘇氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸分別為喂食酪蛋白飲食小鼠中濃度(數(shù)據(jù)未顯示)的3倍、2.4倍和1.6倍。與gmp充足和酪蛋白組相比，喂食phe缺乏gmp飲食的小鼠顯示的血漿phe和酪氨酸濃度顯著較低。

實驗2。3個治療組之間21天的初始(16-18±1.4g)和最終(19-21±1.3g)bw及食物攝取(3.3-4.1±0.3g/d)沒有顯著差異。pku小鼠的平均phe攝取，攝取phe缺乏的氨基酸飲食的為6.5±0.5mgphe/d，攝取phe缺乏的gmp飲食的為5.9±0.3mgphe/d(p>0.10)?？紤]到我們從實驗1和2中觀察到生長可能受到飲用水中phe供給的限制，我們決定在實驗3中補充低phe氨基酸和gmp飲食以包括2.5gphe/kg飲食。這為生長的pku小鼠提供每天7.5-10mgphe的phe攝取。

實驗3。4個膳食治療組之間的bw增長、基于飼料攝取與bw增長之比的飼料利用以及蛋白效率比沒有顯著差異(見表3)。pku小鼠比wt小鼠重約2g(p<0.05)，這與前者大2周相一致。研究結(jié)束時，兩種基因型的雌性小鼠的體重都比雄性小鼠輕(20±1g與25±1g；n＝17-18；p<0.0001)。

表3：喂食含酪蛋白、gmp或氨基酸的wt和pku小鼠的bw、飼料利用和器官質(zhì)量(實驗3)¹

¹數(shù)值為均值±se。一行中不含相同字母上標(biāo)的均值有差異，p<0.05。

²蛋白效率比，克bw增長/克蛋白攝取。

相對器官質(zhì)量因飲食和性別表現(xiàn)出顯著差異。喂食氨基酸飲食的pku小鼠的腎臟質(zhì)量顯著大于其他組。喂食gmp充足飲食的wt小鼠的心臟質(zhì)量顯著大于其他組。喂食氨基酸或gmp飲食的pku小鼠與wt小鼠相比具有顯著較大的相對肝臟質(zhì)量。與雄性小鼠相比，兩種基因型的雌性小鼠都顯示顯著較低的相對腎臟質(zhì)量和顯著較高的相對心臟質(zhì)量。

血漿中氨基酸分布受飲食和性別的影響(見表4)。

表4：喂食含酪蛋白、gmp或氨基酸的wt和pku小鼠的血漿氨基酸濃度(實驗3)¹

¹數(shù)值為均值±se，n＝8。一行中不含相同字母上標(biāo)的均值有差異，p<0.05。

²bcaa，異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸之和。

與喂食酪蛋白或gmp飲食的wt小鼠相比，喂食氨基酸或gmp低phe飲食的pku小鼠顯示15倍的血漿phe濃度且血漿酪氨酸和脯氨酸濃度降低60-70％。喂食gmp飲食的wt和pku小鼠的血漿蘇氨酸和異亮氨酸濃度是喂食酪蛋白或氨基酸飲食的wt和pku小鼠數(shù)值的約2倍(p<0.002)。注意到喂食gmp飲食的wt和pku小鼠的血漿賴氨酸濃度(272±11μmol/l)低于喂食酪蛋白或氨基酸飲食的wt和pku小鼠(443±31μmol/l；p<0.0001；n＝17-18)。兩種基因型的雌性小鼠的血漿酪氨酸濃度(74±6與53±8μmol/l)和色氨酸濃度(113±5與81±5μmol/l)都比雄性小鼠高(p<0.01；n＝17-18)。

與氨基酸飲食的小鼠相比，喂食gmp的pku小鼠在血漿氨基酸濃度上有顯著差異。與攝取氨基酸飲食的小鼠相比，攝取gmp47天的pku小鼠的血漿phe濃度顯著降低11％，在21天未觀察到這個現(xiàn)象。殺死小鼠前48小時pku小鼠的phe攝入相似(16-18mgphe/48h)，但顯著低于wt小鼠(58-66mgphe/48h)。在喂食gmp的pku小鼠中，支鏈氨基酸：異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的血漿濃度總和比氨基酸飲食的小鼠增加50％；然而，亮氨酸濃度沒有差異。pku小鼠中，殺死小鼠前48h的膳食氨基酸攝入和血漿氨基酸濃度相關(guān)。最高的正相關(guān)(p<0.0001；n＝15)包括：甘氨酸，r²＝0.88；蘇氨酸，r²＝0.45；異亮氨酸，r²＝0.44；和纈氨酸，r²＝0.34。

小腦中氨基酸分布因飲食而非性別有顯著差異(見表5)。pku小鼠的小腦中phe的濃度為wt小鼠數(shù)值的3-4倍(p<0.0001)。無論何種飲食，pku小鼠的小腦中酪氨酸濃度和支鏈氨基酸總濃度均為wt小鼠的約50％(p<0.0001)。與喂食氨基酸飲食的pku小鼠相比，喂食所述gmp飲食的pku小鼠小腦中的phe濃度降低20％。

此外，在樣品腦的5部分都觀察到phe濃度降低20％的響應(yīng)：小腦、腦干、下丘腦、頂葉皮層和前梨狀皮層(圖2)。喂食gmp飲食的pku小鼠小腦中的蘇氨酸和異亮氨酸濃度與氨基酸飲食的小鼠相比增加了70–100％(p<0.0001)。注意到喂食gmp飲食的pku小鼠小腦中纈氨酸濃度比氨基酸飲食高的相似趨勢(p<0.10)。pku小鼠小腦中的phe濃度與血漿中蘇氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的濃度以及血漿中蘇氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的濃度之和逆相關(guān)，r²＝0.65–0.77(p<0.0001)(圖3)。無論何種飲食，pku小鼠小腦中谷氨酰胺濃度都比wt小鼠低11％(p<0.05)。小腦中神經(jīng)遞質(zhì)血清素前體色氨酸和腦的甘氨酸神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)前體甘氨酸的濃度在各組之間沒有差異。

表5：喂食含酪蛋白、gmp或氨基酸的wt和pku小鼠小腦中的氨基酸濃度(實驗3)¹

¹數(shù)值為均值±se，n＝8。對于pku小鼠，下述氨基酸的樣本數(shù)為3：丙氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、?；撬岷蜕彼?。一行中不含相同字母上標(biāo)的均值有差異，p<0.05。

²bcaa，異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸之和。

討論

本研究評估含補充有iaa的gmp作為單一蛋白源的飲食支持生長和影響pku小鼠血漿及腦中氨基酸濃度的能力。我們觀察到喂食gmp的pku小鼠與氨基酸飲食的相比有相似的生長和顯著較低的血漿及腦phe濃度，這支持利用gmp作為pku飲食中低phe蛋白來源。

當(dāng)作為單一膳食蛋白來源喂食時，用于小鼠生長的含有限量多種iaa的gmp包含：精氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、phe、色氨酸和酪氨酸。我們的結(jié)果表明喂食補充有這些限制iaa的gmp小鼠能充分生長。在實驗1中，喂食酪蛋白或gmp充足飲食的斷奶wt小鼠6周內(nèi)生長幾乎相同。實驗3中，具有相似phe攝取的喂食gmp或氨基酸飲食的pku小鼠在bw增長、飼料效率和蛋白效率比上沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)證明補充有限制iaa的gmp為生長小鼠提供營養(yǎng)充足的膳食蛋白來源。

在大鼠中，進食缺少某iaa的飲食快速抑制血漿和腦中限制iaa的濃度，并降低的食物攝取(harper等,physiolrev.1970；50:428–39)。因此，實驗1中小鼠停止食用phe缺乏的gmp飲食并在該飲食僅3天后就損失bw，以及在飲用水中添加phe使食物攝取和bw增長正?；⒉涣钊梭@訝。喂食所述gmp充足飲食的wt小鼠中異亮氨酸和蘇氨酸的血漿濃度為喂食酪蛋白飲食的wt小鼠的2-3倍。然而，一旦phe缺乏得到糾正，血漿氨基酸濃度的這些變化就不影響喂食gmp小鼠的食物攝取。因此，我們的結(jié)論是攝取補充有所有限制iaa的gmp改變了血漿氨基酸分布而不減少生長小鼠的食物攝取。

與其他iaa相比，蘇氨酸的肝臟攝取較低且通過肝臟蘇氨酸脫水酶活性(ec4.2.1.16)將蘇氨酸氧化為co2在人(darling等,amjphysiolendocrinolmetab.2000；278:e877–84)和大鼠(harper等,physiolrev.1970；50:428–39)內(nèi)都受到限制。因此，若飲食提供的蘇氨酸低于正常水平的15倍，則增加膳食蘇氨酸而不增加總蛋白攝取導(dǎo)致血漿蘇氨酸池擴大而無毒性。在所有3個實驗中，攝取gmp的血漿蘇氨酸濃度與酪蛋白和氨基酸飲食相比都有最大增長。

通過蘇氨酸脫氫酶(ec1.1.1.103)將蘇氨酸降解為甘氨酸在大鼠中是主要的分解代謝途徑，但在人中不是(darling等,amjphysiolendocrinolmetab.2000；278:e877–84)。由于甘氨酸神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)能抑制或刺激神經(jīng)脈沖的傳輸，甘氨酸水平上升在腦中具有潛在的神經(jīng)毒性(spencer等,jneurosci.1989；9:2718–36)。然而，我們證明血漿和腦中的甘氨酸濃度沒有增加，表明喂食提供3倍于正常蘇氨酸攝取的gmp飲食不足以改變腦中甘氨酸濃度。總之，這些發(fā)現(xiàn)支持膳食gmp的安全性。

此外，喂食gmp47天的pku小鼠血漿中的phe濃度比氨基酸飲食的降低11％，這對pku營養(yǎng)控制來說是積極的結(jié)果。與pku控制和已知phe神經(jīng)毒性效應(yīng)最密切相關(guān)的發(fā)現(xiàn)是，我們觀察到喂食gmp的pku小鼠腦5部分的phe濃度比氨基酸飲食的降低20％。腦中phe濃度與患pku個體精神損傷關(guān)系最密切(scriver等編著，hyperphenylalaninemia:phenylalaninehydroxylasedeficiency(《高苯丙氨酸血癥：苯丙氨酸羥化酶缺陷》)，第8版，第77章中donlon等,metabolicandmolecularbasisofinheriteddisease(遺傳病的代謝和分子基礎(chǔ))，紐約：麥格勞-希爾教育出版集團；2007)。喂食gmp的pku小鼠腦中phe濃度降低最可能的解釋是由于攝取gmp上升的血漿lnaa水平通過lnaa載體蛋白競爭性抑制通過血腦屏障的phe運輸，所述載體蛋白在腦中的km比腸中低很多。較高的血漿蘇氨酸、異亮氨酸及纈氨酸濃度和較低的腦phe濃度之間顯著的逆相關(guān)支持這一結(jié)論。有趣的是，先前的研究表明是異亮氨酸而不是蘇氨酸競爭抑制大鼠腦中phe運輸(tovar等,jneurochem.1988；51:1285–93)。

總體來說，我們證明喂食含20％補充有iaa的gmp的pku小鼠與氨基酸飲食的相比具有相似的生長和較低濃度的血漿和腦phe濃度。這些數(shù)據(jù)證明gmp可配置成營養(yǎng)充足的完備蛋白用于生長小鼠，且表明長期飼養(yǎng)研究可提供gmp代謝的進一步認識。我們的發(fā)現(xiàn)支持繼續(xù)研究以證明用gmp制備的食物和飲品在人pku的營養(yǎng)控制中的功效。

實施例2：用gmp和補充aa所制備食物的可口度

在本實施例中，申請人用gmp制備了各種可口的、低phe食物和飲品并通過在pku個體中進行消費者感官研究評估其可接受度。結(jié)果證明了用gmp所制備產(chǎn)品的可接受度。

材料和方法

食物和飲品。在威斯康星大學(xué)麥迪遜分校(universityofwisconsin-madison，uw)的威斯康星乳品研究中心(wisconsincenterfordairyresearch，cdr)的食品應(yīng)用實驗室(foodapplicationslaboratory)開發(fā)含gmp的草莓布丁、草莓果泥干、巧克力飲品、點心餅干和橙子運動飲品用于本研究。用biopuregmp(達維思科食品國際有限公司，明尼蘇達州勒蘇爾)配制gmp產(chǎn)品。圖4顯示biopure-gmp與酪蛋白的氨基酸分布對比。

味道測試中包括基于氨基酸的市售巧克力飲品和低蛋白餅干以提供gmp產(chǎn)品和pku飲食中當(dāng)前所用產(chǎn)品之間的對比。gmp和氨基酸飲品中的氮濃度相似。所有檢測食品的能量和蛋白含量如表6所示。

表6：pku個體中測試用gmp制備的食物和飲品的平均可接受度評分

所測試的食物的能量和蛋白含量為：gmp草莓布丁，213千卡和5.7g蛋白/1/2杯食物(113g)；gmp果泥干，60干卡和0.7g蛋白/15g；gmp橙子運動飲品

67千卡和7.9g蛋白/8盎司(234g)；gmp巧克力飲品，148千卡和10.2g蛋白/8盎司(236g)；氨基酸巧克力飲品，187千卡和11.4g蛋白/8盎司(202g)；

gmp點心餅干，110千卡和1.3g蛋白/30g；低蛋白餅干，135千卡和0.1g蛋白/30g。

均值±標(biāo)準(zhǔn)差(分數(shù)參考：1非常討厭；2討厭；3既不喜歡也不討厭；4喜歡；5非常喜歡)。

b或c的同一列中有不同上標(biāo)字符(a或b)的均值有顯著差異，ps0.05。

評估食物和飲品可接受度的感官研究。感官研究的實驗方案經(jīng)uw社會和行為科學(xué)審查委員會(socialandbehavioralsciencesinstitutionalreviewboard，uw)批準(zhǔn)。參加2004年和2005年pku夏令營以及2005年pku家庭會議的pku對象進行3項感官研究(n＝49；年齡范圍12-42歲)。該研究在uw食品科學(xué)系的感官分析實驗室(sensoryanalysislaboratory，departmentoffoodscience，uw)或威斯曼中心(waismancenter)進行。

將20-30g測試樣品以平衡隨機順序用三位盲碼給予對象。用5點嗜好程度(1＝非常討厭，2＝討厭，3＝既不討厭也不喜歡，4＝喜歡，5＝非常喜歡)對食品和飲品評分以評價5種感官類別，包括外觀、氣味、味道、口感、總體可接受度。

統(tǒng)計學(xué)分析。進行非獨立t檢驗以分析gmp巧克力飲品和氨基酸巧克力飲品的平均可接受度評分。組均值在p60.05時視為顯著差異，p值用統(tǒng)計分析軟件包(statisticalanalysissoftwarepackage)(sas研究院有限公司，9.1.3版，美國北卡羅來納州卡雷)通過雙尾t檢驗確定。用普通線性模型過程(procglm)然后用費氏最小二乘法進行均值分離來對比gmp點心餅干和低蛋白餅干的可接受度評分，。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

結(jié)果

2004和2005年的pku活動期間，pku對象品嘗了總計7種產(chǎn)品(表6)。這些食物和飲品中，gmp草莓布丁是最可接受的(總分4.2±0.9)，其他食品以總可接受度排序為gmp點心餅干(3.6±1.4)、gmp草莓果泥干(3.4±1.0)、gmp巧克力飲品(3.3±1.0)、gmp橙子運動飲品(3.3±1.1)和低蛋白餅干(2.9±1.3)。氨基酸巧克力飲品最不可接受(2.5±1.4)。小于3的評分表明食物或飲品就某一具體種類而言不能被接受，而3分表明中性的接受度。

pku對象將gmp巧克力飲品的外觀、氣味、味道和總體可接受度評為比基于氨基酸的飲品顯著地更可被接受(p≤0.05,表6b)。gmp點心餅干的外觀、氣味和味道被評為比低蛋白餅干顯著地更可被接受(p≤0.05)，但在兩種餅干之間總體可接受度沒有顯著差異(表6c)。

討論

這些數(shù)據(jù)證明gmp的功能特性特別適合用在飲品和半固體食品如布丁中。例如，gmp溶于等電點低于3.8的酸中，形成凝膠或泡沫，并具有良好的熱穩(wěn)定性。gmp確實提高了飲品中的巧克力風(fēng)味，該巧克力風(fēng)味還有助于掩蓋gmp的乳味。這些數(shù)據(jù)表明gmp可用于制備比當(dāng)前需要作為pku飲食中主要蛋白源的氨基酸制劑更可口的飲品。

實施例3：10周gnp飲食后的pku成人案例研究

本實施例為29歲pku男性的案例報告，該男性在十周內(nèi)用gmp基食品作為單一蛋白來源。該測試對象報告說gmp基食品比標(biāo)準(zhǔn)氨基酸制劑味道更好，且進食該gmp基飲食的十周內(nèi)其血漿phe水平總體較低。

獲得威斯康星大學(xué)麥迪遜分校健康科學(xué)審查委員會批準(zhǔn)以進行pku對象的門診患者研究來評估膳食gmp的安全性和可接受度。研究了基因型為r261q和r408w的29歲男性pku對象。該對象從出生到12歲堅持低phe飲食但青少年時期未控制飲食，這導(dǎo)致痙攣性四肢輕癱和癲癇病發(fā)作，其用標(biāo)準(zhǔn)抗痙攣的治療法治療。該對象完成了15周的研究，比較gmp和其常用的處方氨基酸制劑(芬來得(phenylade)和氨基酸混劑；應(yīng)用營養(yǎng)公司(appliednutrition)，美國新澤西州錫達諾爾斯)作為其膳食蛋白主要來源。

所述實驗方案包括研究的前3周和后2周進食他常用的氨基酸制劑。研究的中間10周期間，用對象所選gmp食物產(chǎn)品替代所有氨基酸制劑，所選產(chǎn)品包括：gmp橙子運動飲品(28盎司/天；28克蛋白)，gmp布丁(1.5杯/天；15克蛋白)和gmp點心棒(1棒/天；5克蛋白)。所述gmp食品的營養(yǎng)組成見表7。

研究中有6周將含精確控制phe含量的稱重食物份額送到對象家中。所述飲食的phe含量通過分析所選食品的氨基酸含量并計算兩種飲食中數(shù)量和包裝批次相匹配的剩余食品中的phe含量來確定(美國農(nóng)業(yè)部ars(2005)美國農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)參比營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫，第18次發(fā)布)。本研究余下9周內(nèi)，該對象使用代謝營養(yǎng)師所計劃的菜單，購買并稱重其自己的食品。盡管phe攝取在15周內(nèi)得到良好控制，但本文提供的血液和血漿中phe濃度的結(jié)果是基于提供食品給對象的那6周。

表7：gmp食物產(chǎn)品的營養(yǎng)組成^a

^agmp食物產(chǎn)品在威斯康星乳品研究中心開發(fā)，但除了牧園色拉醬和肉桂松脆棒在波斯頓堪布魯克(cambrooke)食品公司開發(fā)。

氨基酸和gmp飲食提供的主要營養(yǎng)素分布恒定且包括：10880–11300kj/天(2600–2700千卡/天)，10–11％能量來自蛋白(0.84克蛋白/千克)，24–26％能量來自脂肪，且63–66％能量來自碳水化合物。研究期間對象體重保持在87kg。每日phe含量為4周1100mgphe和2周1180mgphe，這提供約13mgphe/kg體重。所述氨基酸制劑和gmp食物產(chǎn)品各提供0.6g蛋白/kg體重。補充所述gmp食物產(chǎn)品以完備蛋白的氨基酸評分模式的130％，或?qū)τ诶野彼釣?50％，提供下述限制氨基酸，表示為毫克氨基酸/克gmp蛋白：組氨酸，23；亮氨酸，72；色氨酸，9；和酪氨酸，71。一天兩次的多種維生素/礦物質(zhì)補充物、鈣/磷補充物和50mgl-酪氨酸與所述gmp飲食一起攝取以確保與氨基酸制劑所提供的攝取相似。

過夜禁食后和早餐前獲取血液樣品用于使用兩種已知分析方法之一檢測phe濃度以提供不同數(shù)值(gregory等(2007)genetmed9:761-765)。串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)用于分析對象在09:00到09:30之間收集在濾紙上的血液斑點中的phe濃度(rashed等.(1995)pediatrres38:324-331)，beckman6300氨基酸分析儀用于分析12:00到12:30之間在當(dāng)?shù)卦\所通過靜脈穿刺獲得的血漿的氨基酸分布(hommes,fa,編著的techniquesindiagnostichumanbiochemicalgenetics:alaboratorymanual(《診斷性人生化遺傳中的技術(shù)：實驗室手冊》)中的slocum和cummings(1991),aminoacidanaylsisofphysiologicalsamples(生理樣品的氨基酸分析)，紐約：威利斯公司(wiley-liss)，87-126)。

氨基酸和gmp膳食期間血液和血漿氨基酸濃度的統(tǒng)計學(xué)差異通過假定氨基酸測量對時間獨立的t檢驗評估；p<0.05視為顯著。當(dāng)基于提供已知phe含量的飲食用相對于100mgphe攝取來表達時，消耗gmp飲食的平均禁食血漿和血液phe濃度與氨基酸飲食相比顯著降低13–14％(圖5)。消耗gmp飲食的血漿phe的絕對濃度比氨基酸飲食的降低約10％(從736降至667mmol/l，見表8)。gmp和氨基酸飲食的血漿酪氨酸濃度沒有顯著差異。基于身體檢查和包括電解質(zhì)、白蛋白、前白蛋白和肝功能測試的生化組分析的結(jié)果，進食gmp飲食未見不良影響。

與gmp的氨基酸分布和pku小鼠中的研究(見實施例1)一致，攝取gmp飲食的血漿lnaa濃度比氨基酸飲食顯著增長(表8)。gmp飲食的蘇氨酸增至2.6倍，異亮氨酸增至1.7倍，支鏈氨基酸總計增長了16％。有趣的是，該對象先前曾給予必須lnaa混合物(prekunil；丹麥科瑟的尼萊公司(nilab))的補充實驗，但由于其癲癇加劇而終止。lnaa制劑的氨基酸比gmp含更多來自酪氨酸和色氨酸的部分并相應(yīng)含更少的來自蘇氨酸和支鏈氨基酸的部分，gmp所含必需氨基酸約80％來自蘇氨酸和支鏈氨基酸的組合。因此，gmp看來為該對象提供安全的lnaa膳食來源。gmp飲食的血漿脯氨酸的濃度增長了40％，這與攝取gmp的脯氨酸是氨基酸制劑的2倍有關(guān)。gmp飲食的血漿谷氨酰胺和瓜氨酸濃度與氨基酸飲食相比小有增長，其與肝功能測試變化無關(guān)。

表8：單個pku對象攝取氨基酸飲食和gmp飲食的禁食血漿氨基酸濃度對比^a

*,**與aa飲食的差異，*p<0.05，**p<0.01。

a數(shù)值為均值±tse，n＝4；分散在氨基酸飲食的5周和gmp飲食的10周中內(nèi)的不同日子里于12:00-12:30之間獲取過夜禁食和早餐前的血液樣品。

bp＝0.073。

cbcaa＝亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸之和。

總體上，該對象喜歡gmp飲食并報道說該飲食比其常用氨基酸飲食使其感覺更活躍。由于喜歡gmp食物產(chǎn)品，該對象更傾向于將所述產(chǎn)品全天分配。他每天進食gmp食物產(chǎn)品約3次，而氨基酸制劑為每天一次。眾所周知，把pku的氨基酸藥用食物分隔在全天中能降低血液phe水平，這是由于其改善了用于蛋白合成的氨基酸的利用。因此，進食gmp能降低血液phe水平的一種解釋是由于全天進食了足量高品質(zhì)蛋白，蛋白合成得到改善?；蛘?，與gmp一起攝取的更多l(xiāng)naa，特別是攝取大量蘇氨酸(每天約70mg/kg)，有助于降低血漿phe水平。

總之，pku控制所需的對高度約束性、低phe飲食的遵守性在青少年和成年期仍然較差，引起血液phe水平升高、神經(jīng)心理惡化和母性pku的可悲后果。phe含量天然較低的豐富的食品成分膳食gmp，提供創(chuàng)新方法以改善pku營養(yǎng)控制。本實施例表明將用gmp制備的低phe食品和飲品納入pku飲食能改善飲食的味道、品種和方便性。更可口和多能的低phe飲食可導(dǎo)致pku個體的膳食遵守性、代謝控制和根本上生活質(zhì)量的改善。

實施例4：比較補充有限制氨基酸的gmp和氨基酸制劑作為pku營養(yǎng)控制主要蛋白源的11個對象的臨床試驗

本實施例表明pku營養(yǎng)控制中用補充有限制氨基酸的gmp作為蛋白源替代合成aa制劑安全且高度可接受。作為完備蛋白源，gmp相比aa能提高蛋白存留和苯丙氨酸利用。

為了進一步評估gmp在pku飲食中的潛在益處，在pku個體中進行8天的臨床研究。目的是研究用gmp食物產(chǎn)品替代aa制劑在pku對象中對可接受度、安全性、血漿aa濃度和蛋白利用測定方面的影響。

對象和方法

對象。在威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的威斯曼中心生化遺傳組常規(guī)監(jiān)控的12個pku對象于2006年3月-2008年6月間參與本研究。一名對象(年齡：10歲)由于不能完成實驗方案退出本研究。因此，報道來自11個對象(年齡11-31歲；7個男性和4個女性)的數(shù)據(jù)(見表9)。威斯康星大學(xué)麥迪遜分校健康科學(xué)審查委員會批準(zhǔn)本研究。

參與標(biāo)準(zhǔn)包括診斷為典型或變異pku和自愿進食≥50％處方體積的aa制劑。然而，血漿苯丙氨酸濃度的最佳控制不是參與的前提。最佳控制包括苯丙氨酸濃度維持到新生兒至12歲在120-360μmol/l之間，青少年在120-600μmol/l之間，和成人<900μmol/l。pku診斷基于膳食治療開始前嬰兒期測量的苯丙氨酸濃度；典型pku患者的苯丙氨酸濃度≥1200μmol/l(見表9)。本研究中的所有對象診斷為典型pku，除了一個對象檢測出為pku變型(對象1)。

用guldberg等設(shè)計的引物(hummolgenet1993；2:1703-7)通過pah基因的dna序列(德克薩斯州奧斯丁的德克薩斯州立健康服務(wù)部實驗室服務(wù)部門)完成各對象的突變分析。所有對象為pah突變的復(fù)合雜合體(表9)。5個對象為主要表現(xiàn)典型表型的2拷貝突變，6個對象為典型突變和pku患者中觀察到的變異突變和/或非pku的高苯丙氨酸血癥突變。

由于2年的研究征集內(nèi)沒有完成各對象膳食處方的正式評價，所以研究開始前檢測所有對象的苯丙氨酸裕度。對于本研究，苯丙氨酸裕度定義為使血漿苯丙氨酸濃度恒定(±5％變化)的膳食苯丙氨酸攝入量，其由苯丙氨酸攝入依序升高和頻繁監(jiān)控血液斑點內(nèi)的血液苯丙氨酸濃度檢測。通過完成一次或多次“空運行(dryrun)”來證實各對象的膳食苯丙氨酸裕度，空運行中提供5天的所有食品、飲品和制劑并在各空運行前和結(jié)束時測量血液斑點中苯丙氨酸濃度。研究開始時血漿苯丙氨酸濃度為192μmol/l(對象10)-1011μmol/l(對象2；表9)。為了維持這些血漿苯丙氨酸濃度，對象的膳食苯丙氨酸裕度為5.8mg/kg(對象10)-26.7mg/kg(對象2)。

表9：11個苯丙酮尿癥對象的個體特征

¹診斷時年齡和苯丙氨酸濃度表示嬰兒期開始的飲食治療時的數(shù)值。

²數(shù)值表示進食指定氨基酸飲食時第3天早餐后2.5小時血漿中苯丙氨酸濃度。

研究方案。本代謝研究中各對象作為他或她自己的對照，各包括2項4天的膳食治療：aa飲食(1-4天)和gmp飲食(5-8天)。設(shè)計了一份aa飲食的和另一份gmp飲食的24小時菜單；各飲食治療每天重復(fù)相同菜單(表10)。在各飲食中，將aa制劑或gmp產(chǎn)品各自平均分配在全天的3餐中。蛋白等價物分至全天改善了蛋白利用并能較低血漿苯丙氨酸濃度。研究中，由威斯曼中心或威斯康星大學(xué)臨床和轉(zhuǎn)化型研究中心(uw-ctrc)的受訓(xùn)膳食人員以克稱重所有食品、飲品、點心、制劑和gmp產(chǎn)品。為了保證研究每天攝入相同，鼓勵對象進食所有食品和飲品。沒有對象未能做到這點。

表10：氨基酸(aa)和糖巨肽(gmp)飲食的典型菜單比較

¹所有食物由受訓(xùn)人員在克量級上測量。本研究結(jié)束后，已開發(fā)改善的配方以進一步降低本典型菜單中所示的所有g(shù)mp產(chǎn)品的苯丙氨酸含量(12)。例如，相比33mg苯丙氨酸，gmp棒現(xiàn)在僅用14mg苯丙氨酸制得，相比本研究所用的原始制劑中的38mg苯丙氨酸，gmp巧克力布丁現(xiàn)在含21mg苯丙氨酸。pku，苯丙酮尿癥。

²本菜單中所用的pku制劑為40gphenex2(俄亥俄州哥倫布市的雅培公司)。

給每個對象提供本研究開始前和aa飲食第1天與第2天的居家進食的所有食品和制劑。第2天晚飯前，各對象進入uw-ctrc繼續(xù)aa飲食(第3和4天)和4天gmp飲食(第5-8天)。uw-ctrc接收期間每天完成身體檢查。所有對象需每天行走或完成身體活動2-3次以使活動水平與其日常一致。正餐和點心的時間也和各對象日常相似。

在第1和第2天，各對象在濾紙上收集血液斑點用于苯丙氨酸和酪氨酸分析。uw-ctrc接收期間，每日提取血液用于血漿aa和自動化學(xué)組分析以測量前白蛋白、白蛋白、總蛋白、電解質(zhì)、葡萄糖、血液尿素氮(bun)、肌酸酐、鈣、鎂、磷酸鹽、尿酸、總膽紅素與直接膽紅素、堿性磷酸酶和肝臟酶(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶)的血清濃度。所有餐后血液樣品在每天早餐開始3小時后或早餐后2.5小時提取(第3-8天)。

前5個對象完成實驗方案后，數(shù)據(jù)安全和監(jiān)控委員會評價該實驗方案并研究過程。由于委員會的建議，對于剩下的6個對象，取消gmp飲食的前2天(第5和6天)用于化學(xué)組的血液提取，并在aa飲食的后2天(第3和4天)和gmp飲食的后2天(第7和8天)的早餐前添加額外的禁食血液樣品。對所有禁食樣品分析血漿aa。禁食和餐后血液樣品均獲得的6個對象的平均年齡為26±2歲且包括4女2男(對象6-11；表9)。

由于gmp食物產(chǎn)品沒有補充維生素和礦物質(zhì)，所以在gmp飲食期間給予所有對象完備的多種維生素和礦物質(zhì)補充(phlexy-vits；北美營養(yǎng)公司(nutritianorthamerica)，馬里蘭州蓋瑟斯堡)或theragranm(沃爾格林公司(walgreenco)，伊利諾伊州德爾菲爾德)和target-mins(鄉(xiāng)村生活公司(countrylife)，紐約州霍波格)的組合。aa飲食期間，將提供給gmp飲食的相同補充物給予進食不含微生物和礦物質(zhì)的制劑或多種制劑的任何對象。若需要，給予額外的鈣以滿足根據(jù)年齡的膳食參考攝取量(dri)推薦(藥物研究院，dietaryreferenceintakesforenergy,carbohydrates,fiber,fat,proteinandaminoacids(《能量、碳水化合物、纖維、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食參考攝取量》)，華盛頓特區(qū)：國家科學(xué)出版，2002)。

研究飲食。在密蘇里大學(xué)實驗中心化學(xué)實驗室分析gmp(bio-puregmp；明尼蘇達州勒蘇爾的達維思科公司)的aa含量。市售gmp的苯丙氨酸含量為0.4g苯丙氨酸/100ggmp和蛋白含量為86.0g/100ggmp。該gmp用于具有較高苯丙氨酸耐受的3個對象。對于具有較低苯丙氨酸耐受的9個對象，gmp原始物料經(jīng)進一步純化以將苯丙氨酸含量降到平均0.21±0.01g苯丙氨酸/100ggmp和平均蛋白含量75.0±0.7g/100ggmp。gmp純化僅降低苯丙氨酸含量；與市售gmp相比，純化的gmp中其他aa比例保持不變。

所述gmp補充4種限制aa，以毫克aa/克gmp蛋白表示終濃度：組氨酸，23；亮氨酸，72；甲硫氨酸，28；和色氨酸，9。這相對于基于2002dri(藥物研究院，dietaryreferenceintakesforenergy,carbohydrates,fiber,fat,proteinandaminoacids(《能量、碳水化合物、纖維、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食參考攝取量》)，華盛頓特區(qū)：國家科學(xué)出版，2002)所預(yù)測需求的130％。由于pku中酪氨酸為必須aa，因此以預(yù)測需求的150％補充酪氨酸以達到終濃度71mg/ggmp蛋白。對于gmp飲食，沒有試圖復(fù)制各對象進食的各種制劑中的補充酪氨酸濃度，因為大多數(shù)情況下，制劑的酪氨酸含量顯著高于預(yù)測需求。因此，對于所有對象，aa飲食中的酪氨酸攝取高于替代gmp產(chǎn)品時的酪氨酸攝入。

威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的威斯康星乳品研究中心為本研究開發(fā)了用gmp為蛋白源制作的低苯丙氨酸食物產(chǎn)品。開始研究前，各對象品嘗用gmp制作的各種食物產(chǎn)品并選擇2-3種產(chǎn)品包括在所述gmp飲食菜單中。gmp飲品和食品包括橙子風(fēng)味的運動飲品、巧克力風(fēng)味或焦糖風(fēng)味的飲品、巧克力或草莓布丁和肉桂松脆棒(如實施例3；見表7)。所述gmp食物產(chǎn)品中苯丙氨酸含量范圍根據(jù)gmp純度和用于生產(chǎn)這些食物和飲品的額外成分而不同，但通常一份gmp食物產(chǎn)品提供5-10g蛋白和15-30mg苯丙氨酸。

飲食復(fù)合物。所述aa和gmp飲食基于各對象苯丙氨酸攝入的預(yù)研究評估來計算并根據(jù)能量、蛋白、苯丙氨酸和脂肪來控制(見表11)。所述aa飲食(第1-4天)包括對象常用的aa制劑，各對象有所不同。對于所述gmp飲食(第5-8天)，gmp產(chǎn)品替代對象全天攝取的aa制劑。通過aa分析所選食品和計算剩余食品的苯丙氨酸含量來確定計劃菜單所用食品的苯丙氨酸含量。兩種飲食中的未分析食品在數(shù)量、品牌和包裝批次上相匹配，而已分析苯丙氨酸含量的食品以不同量使用來產(chǎn)生所述gmp產(chǎn)品的苯丙氨酸含量。

由于用以定量食品的苯丙氨酸含量的數(shù)據(jù)的局限性，收集膳食組分用于分析苯丙氨酸以證實苯丙氨酸含量的計算。因此，所述aa飲食和所述gmp飲食期間收集2天各對象在24小時里進食的所有食物、制劑和gmp食物產(chǎn)品的副本。各副本經(jīng)研磨和凍干，將各復(fù)合物的等分樣送到密蘇里大學(xué)進行aa分析。對比各對象的復(fù)合物分析時，所述aa飲食和所述gmp飲食中的苯丙氨酸含量沒有顯著差異(p＝0.061)。

表11：氨基酸(aa)和糖巨肽(gmp)飲食的營養(yǎng)組分¹

¹數(shù)值為均值±sem并基于計算的膳食攝?。籲＝11。

²來自合成aa的蛋白占aa飲食中總蛋白的75％而僅占gmp飲食中總蛋白的10％(來自用限制性必須aa補充gmp)。所述aa和gmp飲食中所有其他蛋白來自完整蛋白的天然來源。

³總脂肪攝取為總能量的18％-31％。低脂肪攝取在苯丙酮尿癥患者中常見，因為他們選擇基于碳水化合物的食品且許多aa制劑的脂肪含量低，這些是為患該疾病的老年個體設(shè)計的(28)。

⁴與aa飲食有顯著差異，p<0.0001(成對t檢驗，對象配對)。

測定。各對象采集血點以確定其苯丙氨酸裕度，并在預(yù)研究第1和2天用串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)分析苯丙氨酸和酪氨酸(數(shù)據(jù)未顯示)。用裝有離子色譜系統(tǒng)的beckman6300氨基酸分析儀(貝克曼庫爾特公司(beckman-coulterinc)，加州富勒敦)使用茚三酮柱后衍生法完成第3-8天收集的所有禁食和餐后血漿樣品的aa分析。加入內(nèi)標(biāo)和注入柱中之前，用磺基水楊酸將樣品去蛋白化、離心(14000xg；5分鐘)并通過0.2-μm注射過濾器。

在威斯康星大學(xué)麥迪遜分校醫(yī)院的臨床實驗室通過用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析血清化學(xué)分布。通過使用人胰島素特異性放射性免疫試驗(林可研究公司(lincoresearch)，密蘇里州圣查爾斯)對按對象合并的第3+4天和第7+8天樣品測定餐后樣品的血漿胰島素。通過hplc移除igf結(jié)合蛋白后測量第4和8天餐后血漿樣品中的胰島素樣生長因子i(igf-i)；igf-1的回收率為85–90％。

統(tǒng)計學(xué)分析。所有統(tǒng)計分析由用于mac操作系統(tǒng)(macos)x版本1.12的統(tǒng)計學(xué)程序r(維也納經(jīng)濟與商業(yè)大學(xué)的統(tǒng)計計算r項目，奧地利維也納)進行。分析膳食組分后，各飲食內(nèi)的aa值根據(jù)各對象(n＝2)平均，然后通過成對t檢驗比較兩種飲食之間的數(shù)值。還進行對象配對的成對t檢驗以比較餐后和禁食樣品的所述aa飲食最后一天(第4天)到所述gmp飲食最后一天(第8天)的血漿aa數(shù)值?；瘜W(xué)組和肝臟功能測試中的變化用相同方法比較。此外，進行成對t檢驗以比較6個對象的亞組中各飲食內(nèi)禁食和餐后aa濃度，可從這些對象中獲得禁食血漿。所有比較在p≤0.05時認為是統(tǒng)計學(xué)顯著的?；诒容^所述aa飲食最后一天(第4天)和所述gmp飲食最后一天(第8天)苯丙氨酸濃度的主要終點，若血漿苯丙氨酸濃度的變化為150μmol/l，則所得樣本數(shù)(n＝11)足以在p＝0.05提供80％的檢定力。

結(jié)果

飲食可接受度和aa組合物。進食gmp飲食4天后，11個對象中10個聲稱該gmp產(chǎn)品在感官品質(zhì)上優(yōu)于其常用aa制劑。此外，研究結(jié)束時，7個成人對象中6個表示若gmp成為可用的膳食選擇時，他們強烈優(yōu)選進食gmp產(chǎn)品而不是其常用aa制劑。

與現(xiàn)有推薦相比，aa和gmp飲食的所有必須aa的分析攝取(毫克氨基酸/克膳食蛋白)滿足需求(世界衛(wèi)生組織，proteinandaminoacidrequirementsinhumannutrition(《人營養(yǎng)中的蛋白和氨基酸需求》)，瑞士日內(nèi)瓦：聯(lián)合國大學(xué)，2007)。然而，膳食復(fù)合物的aa分析表明所述aa飲食與所述gmp飲食相比aa攝取上有很多顯著差異(見表12)。由于gmp含高濃度的lnaa蘇氨酸和異亮氨酸，所以所述gmp飲食的這些aa的攝取均值顯著高于所述aa飲食。盡管補充gmp的酪氨酸為dri的150％且亮氨酸、組氨酸、色氨酸和甲硫氨酸為dri的130％，除甲硫氨酸外，所述gmp飲食的這些aa的攝取顯著低于所述aa飲食。與所述aa飲食相比，所述gmp飲食的包括必須aa賴氨酸和非必須aa精氨酸、丙氨酸、谷氨酸和牛磺酸在內(nèi)其他aa的攝取顯著較低。

表12：氨基酸(aa)和糖巨肽(gmp)飲食復(fù)合物的24小時aa分布分析¹

¹數(shù)值為均值±sem；n＝22。bcaa，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸之和。

²代表成對t檢驗所得aa和gmp飲食之間的差異.

身體檢查和血液化學(xué)。對象進食gmp為主要蛋白源的4天時間中沒有任何表明對身體狀況有負面影響的身體問題被檢測到或由任何對象表現(xiàn)出。所述aa飲食的最后一天(第4天)所測的和所述gmp飲食(第8天)相比，血清中作為蛋白狀態(tài)指標(biāo)的白蛋白、前白蛋白或總蛋白濃度之間或作為腎狀態(tài)指標(biāo)的肌酸酐濃度之間沒有顯著差異(表13)。然而，作為肝臟尿素生成指標(biāo)的bun在第7天和第8天所述gmp飲食時顯著低于所述aa飲食第4天(見圖6)。所述aa和gmp飲食的血漿igf-i濃度沒有顯著差異，這說明兩種飲食的蛋白營養(yǎng)充足。所述gmp飲食比所述aa飲食的血漿胰島素濃度較高且有邊際顯著性(p＝0.053)，而血清葡萄糖濃度沒有顯著差異。所述gmp飲食的血清二氧化碳(主要為碳酸氫鹽)含量顯著高于所述aa飲食，這與較低的全身酸含量相一致。兩種飲食中其他標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)包括電解質(zhì)的平均濃度和肝功能測試都維持在正常范圍(數(shù)據(jù)未顯示)。例外是正處于癲癇病抗痙攣治療中的對象2中測量的各種肝功能測試(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和υ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)的濃度上升。然而，與參加本研究時測量到的上升相比，進食所述gmp飲食沒有檢測到這些肝功能測試的進一步上升。

表13：氨基酸(aa)和糖巨肽(gmp)飲食對餐后蛋白和糖代謝指數(shù)的影響¹

¹數(shù)值為均值±sem；n＝11，除了總蛋白和胰島素為n＝10；所有數(shù)值都在正常范圍內(nèi)。數(shù)值為血清數(shù)據(jù)，除了胰島素樣生長因子i和胰島素為血漿數(shù)據(jù)。

²aa飲食最后一天(第4天)和gmp飲食最后一天(第8天)的差異，成對t檢驗，對象配對。

血漿aa濃度。早餐后2.5小時測量時，所述gmp飲食與所述aa飲食相比血漿中總aa濃度顯著較高，bun濃度顯著較低(見圖6)。這與從完備蛋白來源吸收aa比從合成aa吸收慢和gmp飲食的胰島素濃度較高相一致。

苯丙氨酸和酪氨酸。所述aa飲食(第4天)與所述gmp飲食(第8天)的餐后血漿平均苯丙氨酸濃度沒有顯著差異(p＝0.173，圖7)。血漿中苯丙氨酸濃度的變化均值為57±52μmol苯丙氨酸/l。各對象之間，血漿苯丙氨酸濃度對進食gmp飲食的響應(yīng)是不均勻的，從下降175μmol苯丙氨酸/l到上升257μmol苯丙氨酸/l。總體上，所述aa飲食相比所述gmp飲食的phe血漿濃度的變化與性別、基因型和年齡之間沒有一致關(guān)聯(lián)。

對6個成人對象的亞組可獲得第4天(aa飲食)和第8天(gmp飲食)的禁食和餐后血漿苯丙氨酸濃度。該亞組(n＝6)與前5個對象對所述gmp飲食的餐后響應(yīng)沒有顯著差異。進食所述aa飲食4天導(dǎo)致獲自過夜禁食的血漿苯丙氨酸濃度比獲自早餐后2.5小時的餐后血漿的苯丙氨酸濃度顯著上升10％(p＝0.048；見圖8)。相反，進食所述gmp飲食4天沒有導(dǎo)致禁食狀態(tài)獲得的血漿與餐后狀態(tài)獲得的血漿的苯丙氨酸濃度產(chǎn)生顯著變化。

酪氨酸是pku飲食中的重要aa，因為其為必須且是腎上腺素、去甲腎上腺素、黑色素、甲狀腺素的前體。進食所述gmp飲食或aa飲食的餐后或禁食樣品的血漿酪氨酸濃度沒有顯著變化(表14)。進食所述gmp飲食和aa飲食的過夜禁食后的血漿酪氨酸濃度與餐后濃度相比有所下降；然而，所述gmp飲食導(dǎo)致平均禁食酪氨酸濃度低于正常范圍。

附加aa。進食所述gmp與所述aa飲食相比血漿aa分布中最顯著的變化是無毒lnaa異亮氨酸和蘇氨酸的餐后濃度升至2.25-2.47倍，這使這些數(shù)值高于正常臨床范圍(見表14)。所述gmp飲食的血漿異亮氨酸和蘇氨酸濃度的顯著上升發(fā)生在進食所述gmp飲食的24小時內(nèi)且與gmp中的這些aa的高濃度一致(見圖9)。然而，異亮氨酸和蘇氨酸的血漿濃度分別在第5和7天后不再顯著增加。進食所述gmp與所述aa飲食相比，禁食過夜所得血漿的異亮氨酸濃度沒有差異，而前者的血漿蘇氨酸濃度維持在后者的約2倍。

與所述gmp和aa飲食復(fù)合物的aa分布相一致，gmp與aa飲食相比餐后血漿鳥氨酸和色氨酸濃度顯著較低，而血漿異亮氨酸和蘇氨酸濃度顯著較高。過夜禁食后，所述gmp與所述aa飲食相比血漿精氨酸濃度顯著較低而蘇氨酸濃度顯著較高(見表14)。

表14：氨基酸(aa)和糖巨肽(gmp)飲食對禁食和餐后(pp)血漿aa濃度的影響¹

¹數(shù)值為均值±sem；n＝6，除了胱氨酸為n＝5。bcaa，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸之和。

²進食gmp飲食和aa飲食相比，pp血漿鳥氨酸(p＝0.019)和色氨酸(p＝0.003)濃度顯著較低，但在正常范圍內(nèi)，而異亮氨酸(p＝0.003)和蘇氨酸(p＝0.004)顯著較高且高于正常范圍。進食gmp飲食和aa飲食相比的禁食aa濃度唯一顯著不同的是精氨酸下降(p＝0.008)和蘇氨酸上升(p＝0.001)。

³重復(fù)測量anova中時間有顯著效應(yīng)。對象配對的成對t檢驗的統(tǒng)計分析來自aa飲食的最后一天(第4天)和gmp飲食的最后一天(第8天)所采集的數(shù)據(jù)。

⁴通過先找到aa飲食和gmp飲食的各對象禁食和pp的aa濃度之間的差異，然后用對象配對的成對t檢驗比較該差異來計算對飲食的響應(yīng)。

這是研究用來自gmp食物產(chǎn)品的完備蛋白替代當(dāng)前pku營養(yǎng)控制所需合成aa制劑的功效的首次臨床試驗。在此受控代謝飲食研究中，pku對象進食gmp4天作為其主要蛋白源，沒有發(fā)現(xiàn)不良健康問題，血液化學(xué)物質(zhì)維持正常(表13)。此外，所述gmp產(chǎn)品被對象所優(yōu)選，這證實了pku對象中g(shù)mp與aa產(chǎn)品味道盲測對比的結(jié)果(見實施例2)。因此，用gmp制作的食物和飲品用在pku的苯丙氨酸受限飲食中安全且高度可接受。

4天后，進食gmp產(chǎn)品與aa制劑相比，血漿苯丙氨酸濃度沒有顯著變化(圖7)。與合成aa源相比，gmp作為完備蛋白源可延緩aa吸收并改善苯丙氨酸和其他aa用于蛋白合成。本研究中，所述aa飲食的禁食苯丙氨酸濃度顯著高于餐后苯丙氨酸濃度(圖8)，而gmp飲食的禁食和餐后苯丙氨酸濃度沒有表現(xiàn)出顯著差異(表14)。這表明所述gmp飲食在24小時內(nèi)誘發(fā)的變化較少且可能降低血漿苯丙氨酸平均濃度。相一致的是，與游離aa源如aa制劑相比，當(dāng)膳食蛋白源為完備蛋白如gmp時，與aa吸收速率較低相關(guān)聯(lián)，蛋白存留增加而aa氧化降低。

相比含aa的早餐，食用含gmp的早餐后2.5小時測量的血清bun較低和血漿胰島素和總aa濃度較高也證明gmp飲食改善蛋白存留(表13，圖6)。尿素響應(yīng)血漿aa濃度而線性生成，且氮平衡的控制主要由尿素生成調(diào)節(jié)。bun作為肝臟利用aa用于尿素生成的度量，預(yù)期在內(nèi)臟aa釋放較慢時維持較低水平。因此，用gmp代替合成aa用作主要蛋白源時，完備蛋白源下更慢、更平緩和持續(xù)的血漿aa濃度上升與更低的bun濃度一起表明有更少的aa降解用于尿素生成，而其被保留用于蛋白合成。

已知吸收后aa包括異亮氨酸和蘇氨酸(calbet等,jnutr2002；132:2174–82)能刺激胰島素釋放并隨后刺激蛋白合成和抑制蛋白降解(schmid等，pancreas1992；7:698–704)。由于gmp誘發(fā)的氨基酸釋放更慢時間更長，所以胰島素響應(yīng)和網(wǎng)絡(luò)蛋白合成的刺激可能增強。此外，乳清蛋白比其他乳蛋白組分或其他完備蛋白源能以更高程度增加胰島素濃度(nilsson等，amjclinnutr2004；80:1246–53)。因此，gmp降低aa代謝和尿素生成的能力可能表明作為胰島素分泌促進劑的蘇氨酸和異亮氨酸的餐后濃度增加和aa吸收減緩。

基于2002dri推薦，本研究的gmp補充有下述5種限制aa：組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸。血漿組氨酸、亮氨酸和色氨酸濃度維持在正常范圍內(nèi)，這表明gmp飲食中這些aa的補充足夠(表14)。相反，禁食狀態(tài)測量時血漿酪氨酸濃度低于正常水平(表14)，這表明gmp可能需要補充額外酪氨酸。事實上，持續(xù)10周給進食gmp作為主要蛋白源的對象提供1000mg/d補充的額外酪氨酸使血漿酪氨酸濃度維持在正常范圍內(nèi)(見實施例3)?？傊覀兊臄?shù)據(jù)表明gmp必須補充精氨酸、組氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸以在pku飲食中提供完備膳食蛋白源。

終生堅持pku飲食非常困難，常導(dǎo)致遵守較差和高苯丙氨酸血癥的神經(jīng)心理后果。本研究通過使用由完整、低苯丙氨酸的蛋白gmp替代合成aa制作的可口的食品和飲品展示了pku飲食的新的改善范例。當(dāng)補充限制性必須aa時，用gmp替代合成aa作為主要蛋白來源用于pku營養(yǎng)控制看起來是安全并可接受的。與由aa提供大部分氮的飲食相比，gmp作為完整蛋白能延緩aa吸收并改善蛋白存留和苯丙氨酸利用。

實施例5：增加gmp純度和將質(zhì)量衡算用于gmp基食品的氨基酸補充

本實施例描述提高制作gmp基食品所用gmp的純度的方法。此外，本實施例描述了使用質(zhì)量衡算來確定gmp基食品的必需氨基酸補充程度。介紹

大于1歲個體的必需氨基酸每日推薦攝取量(dri)已基于食品氮含量建立(見表15)。

表15：年齡≥1歲的兒童和所有其他年齡組的必需氨基酸每日推薦攝取量(dri)。(改編自醫(yī)藥研究院2005，dietaryreferenceintakesforenergy,carbohydrates,fiber,fat,proteinandaminoacids(《能量、糖、纖維、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食參考攝取量》)，華盛頓特區(qū)：國家科學(xué)出版)。

^ape＝n×6.25。

^b僅tyr用于補充gmp。

常以基于總氮(n)乘以轉(zhuǎn)化因子6.25所得蛋白當(dāng)量(pe)報道氨基酸的dri數(shù)值(醫(yī)藥研究院2005)。大多數(shù)蛋白含約16％的氮，從而轉(zhuǎn)化因子6.25(100g蛋白/16gn＝6.25g蛋白/gn)是適當(dāng)?shù)?nielsenss2003,foodanalysis(《食品分析》)，第3版.紐約:克魯學(xué)術(shù)/普林諾出版社(kluweracademic/plenumpublishers))。然而，氮對蛋白的轉(zhuǎn)化因子在食品間不同。例如，大多數(shù)乳蛋白的氮對蛋白的轉(zhuǎn)化因數(shù)為6.38(同上)。gmp為非均質(zhì)肽，一些gmp分子被糖基化而其他沒有。由于此，gmp分子的轉(zhuǎn)化因數(shù)可為6.70-9.55，取決于其糖基化程度(dziuba和minkiewicz1996,intdairyj6(11–2):1017–44)。某個gmp生廠商使用6.47的轉(zhuǎn)化因子報道蛋白，而用7.07報道gmp說明了蛋白質(zhì)量定義的模糊性(達維思科食品國際有限公司)。

氮對蛋白的確切轉(zhuǎn)化因子未知時，食品的實際蛋白含量難以測量。蛋白可能含非蛋白氮或基本氨基酸，其氮含量高于其他氨基酸。為使gmp在飲食中提供推薦水平的必需氨基酸，必須用什么構(gòu)成1g蛋白的明確定義了解進食食品的蛋白組分。在本實施例中，按照醫(yī)藥研究院(醫(yī)藥研究院2005)對用于建立大于1歲個體的必需氨基酸dri的定義使用6.25的轉(zhuǎn)化因子(見表15)。

從乳清中分離gmp的現(xiàn)行大規(guī)模技術(shù)使用離子交換色譜或超濾。gmp的等電點(pi)低于3.8，而其他主要乳清蛋白的pi值高于4.3。gmp和其他乳清蛋白的這種物理化學(xué)差異常用于分離方法以從乳清中分離gmp。市售可得的用離子交換色譜分離的gmp對pku食物來說通常不夠純，因為其含過多來自殘留乳清蛋白的phe(即5mgphe/g產(chǎn)物，生產(chǎn)商文獻，達維思科食品國際有限公司，美國明尼蘇達州勒蘇爾)。傳統(tǒng)氨基酸制劑不含phe，這使患有pku的個體能食用含phe的天然食物以滿足其每日裕度。為了使gmp成為替代pku飲食中氨基酸制劑的可行蛋白，需要改善的過程以提高gmp純度并降低phe含量。

為了進行人臨床試驗測試gmp食品對pku個體的安全性和可行性，開發(fā)小規(guī)模工藝以制備足以供15個對象進食4天的高度純化gmp。利用食品級材料和批準(zhǔn)用于食品的設(shè)施加工5kg純化gmp，按順序使用下述單元操作(1)陽離子交換色譜,(2)超濾和滲濾(uf/df),和(3)凍干。此外，開發(fā)質(zhì)量衡算以為氨基酸補充提供明確定義的基礎(chǔ)。純化的補充gmp用于制備在所述人臨床試驗中進食的gmp食品。

材料和方法

本部分分為3個小部分：(1)用食品級材料加工純化gmp所用的單元操作，(2)檢測gmp回收和用于補充純化gmp的氨基酸質(zhì)量所用的質(zhì)量衡算，和(3)在所述臨床試驗和1患者響應(yīng)中進食的gmp食品的制備和分析。

gmp純化過程

粗制gmp(biopuregmp，達維思科食品國際有限公司)中的污染乳清蛋白通過吸附到陽離子交換樹脂來捕獲，并收集流通物組分中的gmp。用超濾/滲濾(uf/df)濃縮所述gmp并洗去肽、鹽和非蛋白氮。用凍干法干燥所述純化的濃縮gmp。

陽離子交換色譜。直徑20厘米的色譜柱(index,新澤西州皮斯卡特維的ge醫(yī)療保健公司(gehealthcare))用sp瓊脂糖大珠(spsepharosebigbeads，ge醫(yī)療保健公司)填充。柱體積(cv)為5.34升，床程高為18厘米。

通過混合粗制gmp(biopuregmp，達維思科食品國際有限公司)和10mmph4的乳酸鈉，并通過0.45-μm孔徑濾器(sartobranp，美國紐約州艾哲伍德的薩托瑞斯公司(sartorius))過濾來制備進料溶液(75g/l)。平衡和洗脫緩沖液分別為食品級50mmph4的乳酸鈉和10mmph12的naoh。平衡緩沖液和gmp進料溶液保持于4℃以抑制微生物生長。洗脫緩沖液保持于22℃。流速950ml/分。各陽離子交換循環(huán)由4步組成：(1)用2cv平衡緩沖液將所述柱調(diào)為ph4，(2)將0.5cv進料溶液上樣至所述柱，(3)用平衡緩沖液淋洗所述柱，棄去其中前0.3cv洗脫液(柱死體積)并收集接下來的2cv純化gmp，和(4)用2.5cv洗脫液從柱中釋放結(jié)合蛋白。5次運行各由9-11個連續(xù)循環(huán)組成。各運行中產(chǎn)生約100l洗脫gmp蛋白溶液。所述陽離子交換柱通過泵入0.2mnaoh保持1小時來清洗，然后將該柱保存于10mmnaoh中。

超濾和滲濾。將來自所述陽離子交換柱的gmp洗脫液通過添加1mnaoh調(diào)節(jié)為ph7，并用中空纖維超濾膜(3kda,3.3m²,ufp-3-c-55,ge醫(yī)療健康公司)在60℃濃縮。施加的壓力為1.4巴。gmp溶液從100升濃縮為10升，然后加入20升蒸餾水并再將該溶液濃縮為10升。將所述濃縮液用0.45μm孔徑濾器(薩托瑞斯公司)過濾到消毒容器中并4℃保存。所述uf膜在每次使用之前和之后用含100ppmnaocl(漂白劑)的0.2mnaoh于50℃清洗。所述uf膜保存于10ppmnaocl中。

凍干。濃縮、無菌過濾的gmp溶液在1.2或2升玻璃凍干瓶上冷凍為薄層并干燥48h(lyphlock6，美國密蘇里州堪薩斯城的萊布康可公司(labconco))。回收gmp粉末、稱重并部分用于分析。

組分分析。粗蛋白分析(cp)和完全氨基酸分布(aap)在試驗中心化學(xué)實驗室(美國密蘇里州哥倫比亞的密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校)進行。aoac官方方法982.30用于app，aoac官方方法990.03用于cp([aoac]國際官方分析化學(xué)協(xié)會，2005，officialmethodsofanalysisofofficialanalyticalchemists(《官方分析化學(xué)家的官方分析方法》)，第18版，馬里蘭州蓋瑟斯堡：aoac)。結(jié)果報道為g/100g純化gmp干重。用轉(zhuǎn)化因子6.25乘以總氮表達pe基準(zhǔn)的結(jié)果。對所有樣品進行重復(fù)分析。

質(zhì)量衡算

質(zhì)量衡算用于描述(1)確定從加工過程中g(shù)mp收率所用的計算，(2)氨基酸補充所用的賴氨酸基礎(chǔ)，和(3)確定補充氨基酸需要量所用的方法。

gmp收率。以pe基準(zhǔn)計算回收。進料溶液中的pe克數(shù)(mpe,feed)用gmp進料濃度(75g/l)乘以pe克數(shù)/克粉末(cp分析所得)然后乘以加工的進料溶液總體積來確定。pe回收總克數(shù)(mpe,收回)用純化gmp粉末的質(zhì)量乘以pe克數(shù)/克純化gmp(cp分析所得)獲得。gmp收率(％)等于mpe,收回/mpe,進料×100。

氨基酸補充的賴氨酸基準(zhǔn)。純化gmp需要氨基酸補充以滿足dri和臨床試驗設(shè)定的營養(yǎng)目標(biāo)。選擇賴氨酸(lys)作為質(zhì)量平衡補充計算的基準(zhǔn)，因為其與目標(biāo)數(shù)值最接近(見表16，c列與d列比較)。pku僅需要補充5種必需氨基酸：his、leu、met、trp和tyr。不補充非必需和條件必須氨基酸。

游離氨基酸的吸收和降解比完整蛋白提供的氨基酸更快。因此，臨床試驗的目標(biāo)氨基酸組分設(shè)為高于dri水平。his、leu、met和trp的目標(biāo)設(shè)為dri水平的130％。tyr以dri水平的150％補充，這是因為氨基酸制劑通常富含高水平的tyr。在涉及滿足dri的gmp補充的表和圖中，phe和thr列在一起，met和cys也是，這是因為tyr和cys分別為能從phe和met合成的條件必需氨基酸。然而，在pku患者中，tyr不能從phe合成。

表16：補充氨基酸(aa)計算方法。

^a分析獲得的組分。數(shù)值為均值±sd。樣本數(shù)為n＝2。

f和h列中的相同字母表示沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。

氨基酸補充計算。補充的難題在于添加到純化gmp中的氨基酸通過同時改變分子(mg氨基酸)和分母(gpe)而改變了氨基酸目標(biāo)(mg氨基酸/gpe)。將描述兩種用于所述補充物計算的方法：一種涉及分母的變化，另一種不涉及。兩種方法都有分子的變化。用于計算氨基酸補充的步驟示于上表16。aap的實驗結(jié)果用于獲得各氨基酸的毫克/克純化gmp(a列)。cp的實驗結(jié)果(b列)除列a以獲得pe基準(zhǔn)的gmp氨基酸組分(c列)。需要轉(zhuǎn)化至pe基準(zhǔn)(c列)以比較所述純化gmp氨基酸組分與所述臨床試驗?zāi)繕?biāo)數(shù)值(d列)。各臨床試驗?zāi)繕?biāo)數(shù)值減去純化gmp的氨基酸數(shù)值產(chǎn)生各補充氨基酸的所需質(zhì)量(e列)。通過將需要的氨基酸數(shù)值(e列)添加到純化gmp氨基酸數(shù)值中(c列)，計算補充gmp的組分(f列)。本方法用于所述補充物計算忽略了添加氨基酸對氨基酸組分分母(mg/gpe)的影響。

為考慮分母的變化，必須考慮由于補充產(chǎn)生的pe克數(shù)/克純化gmp的增加(表16，g和h列)。為此，1g純化gmp中需要的補充氨基酸對總氮的貢獻由分子式確定并乘以6.25產(chǎn)生添加氨基酸對總pe克數(shù)的貢獻。來自補充氨基酸的pe克數(shù)加pe克數(shù)/1g純化gmp(b列)得到校正的pe克數(shù)/克純化gmp(g列)。所述補充組分(f列)乘以b列并除以g列得到分母的變化(h列)。

校正的補充gmp組分與未校正的組分沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(表16，h與f列比較)(p>0.05)。因此，本研究補充純化gmp所用的計算方法假定添加的氨基酸對分母的影響可以忽略。

gmp食品的制備和分析。gmp草莓布丁的配方見表17。純化的gmp、補充的氨基酸和非乳奶精(supervalu風(fēng)味非乳奶精，美國明尼蘇達州伊登普雷里的超值公司(supervalu))為該gmp草莓布丁提供氨基酸。用來自純化gmp、非乳奶精和附加氨基酸的氨基酸貢獻使用前文表16所示方法計算pe基準(zhǔn)的該布丁氨基酸組成。

表17：gmp草莓布丁配方

^a純化gmp，補充氨基酸和非乳奶精對最終產(chǎn)物貢獻氨基酸。

統(tǒng)計學(xué)分析。用單向方差分析法(anova)進行統(tǒng)計學(xué)分析(minitab統(tǒng)計分析軟件，13.32版,美國賓夕法尼亞州州立學(xué)院)以比較考慮和不考慮分母的補充gmp的組成(表16)建立置信區(qū)間以進行g(shù)mp草莓布丁的計算組成與觀察到的組成和dri數(shù)值的對比。用95％置信度建立置信區(qū)間，α<0.05時統(tǒng)計學(xué)上顯著。

結(jié)果

本研究的目標(biāo)是生產(chǎn)足量含低phe的純化gmp以在對象參加的8天臨床實驗期間為15名pku對象提供gmp食品。純化的gmp需要補充必需的限制性氨基酸以提供營養(yǎng)完全的蛋白源用在gmp食品中。測試gmp食品作為pku飲食蛋白的可口來源的安全性和功效。以下部分討論了如何實現(xiàn)這些目標(biāo)，所述部分分為所述試驗場工藝(pilotplantprocess)對純化gmp的收率和phe含量的影響，gmp草莓布丁中的氨基酸質(zhì)量平衡和該gmp草莓布丁的氨基酸組成與dri和氨基酸制劑的對比的影響，以及所述純化的補充gmp食品對pku對象的血漿氨基酸水平的影響。

純化工藝對phe含量和gmp收率的影響。表18包括各次運行中的phe含量、收率和陽離子交換循環(huán)數(shù)。粗gmp中的phe通過純化工藝降低了47％，從4.7±0.5mg/gpe降至2.7±0.4mg/gpe。平均gmp收率為52±4％。gmp收率較低主要是由于部分gmp結(jié)合陽離子交換柱而未在流通物組分中回收。用于提高市售gmp純度的純化工藝產(chǎn)生穩(wěn)定的可重復(fù)phe濃度，并且5次運行生產(chǎn)的純化gmp中phe濃度之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。

表18：純化和市售gmp的phe含量

^a分析獲得的組成。數(shù)值為均值±sd。樣本數(shù)為n＝2。

各運行中通過uf膜的gmp穿透率見表19。總體上，通過uf膜的gmp持留為96±2％。盡管gmp的分子重量為約7kda，其在ph4及以上時的表觀分子重量為45kda。將uf/df步驟中g(shù)mp溶液的ph升至7以使通過3kda膜的gmp穿透率最小化。這可能解釋了uf步驟所見的高回收率。

表19：通過uf膜的gmp穿透率

氨基酸補充計算和gmp食品組成的比較。分析所述gmp草莓布丁并將組成與計算的氨基酸組成比較(表20)。純化的gmp(表20，a列)用氨基酸補充(b列)，補充量用忽略了添加氨基酸造成的分母變化的質(zhì)量平衡方法確定；所添加來自非乳奶精的氨基酸類似確定(c列)。a、b和c列之和為所述gmp布丁忽略分母變化的計算組成(d列)。

表20：gmp草莓布丁氨基酸(aa)組成的計算和分析

^a分析獲得的組成。數(shù)值為均值±sd。樣本數(shù)為n＝2。

^b計算時分母中不包括添加氨基酸(表2的方法，f列)。

^c計算時分母中包括添加氨基酸(表2的方法，h列)。

d、e和f列之間的相同字母表明均值之間沒有檢測到差異(p>0.05)。

e和f列之間在α<0.05時檢測到tyr+phe有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，但α<0.01時沒有。

為了比對，計算所述gmp草莓布丁的氨基酸組成以包括分母的變化(表20，e列)。忽略對分母的貢獻導(dǎo)致氨基酸的計算組成比觀察值平均高估30％(表20，d與f列相比)。包括對分母的貢獻后，除tyr(p<0.05)以外，校正的氨基酸計算組成與觀察的組成沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)(表20，e與f列比較)。所述gmp草莓布丁中觀察到的氨基酸組成(f列)達到或超出所有dri目標(biāo)數(shù)值(表15)。

將gmp草莓布丁的氨基酸組成與氨基酸制劑比較(見圖10)。所述氨基酸制劑所含的his、leu、met+cys、tyr和trp顯著多于所述gmp草莓布丁(p<0.05)。然而，氨基酸制劑和gmp草莓布丁的所有必需氨基酸都達到或超出dri目標(biāo)(p>0.05，表15)。

討論

純化gmp的加工。gmp總收率較低(52±4％)歸因于gmp和陽離子交換柱之間的相互作用并導(dǎo)致部分gmp與柱結(jié)合。gmp與柱的結(jié)合是由于gmp的非均質(zhì)性。操作ph為4時，一些gmp分子所帶負電荷比其他分子少并因此結(jié)合陽離子交換柱。在較高ph操作可通過增加gmp上的負電荷來將gmp與柱的結(jié)合最小化。這也導(dǎo)致殘留乳清蛋白由于所帶正電荷減少而和陽離子交換柱之間的靜電吸引降低。提高操作ph超過4會影響純度。生產(chǎn)臨床試驗使用的gmp中，純度優(yōu)先于回收率。

最終干燥步驟前，uf/df去除低分子量的溶質(zhì)并濃縮gmp。uf/df不能去除污染的乳清蛋白如ala和blg，這是因為這些蛋白太大而不能穿透3kda膜。另一方面，低分子量溶質(zhì)如乳清肽足夠小所以能通過uf/df去除且可能含phe。

凍干產(chǎn)生沒有風(fēng)味或氣味的細白粉末，其能清澈地溶于水(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，這種干燥方法的缺點是加工時間長。所述方法的其他各步可在1天內(nèi)完成，但凍干需要數(shù)天完成。盡管需要耗時，凍干仍是干燥本研究所用純化gmp的最實用選擇。不用噴霧干燥是因為可能的gmp損失以及該方法在干燥少量產(chǎn)品時的局限。在大規(guī)模生產(chǎn)中，噴霧干燥可以是首選方法。

已加工gmp的氨基酸補充。用于gmp補充物的計算方法忽略了分母中來自添加氨基酸的pe克數(shù)，但其易于執(zhí)行且所得gmp草莓布丁達到或超過所有必需氨基酸的dri目標(biāo)(表20)。對gmp本身，忽略添加氨基酸對分母的改變沒有導(dǎo)致gmp組成的統(tǒng)計學(xué)顯著差異(表16，f與h列比較)。

忽略添加非乳奶精和補充氨基酸對分母的改變導(dǎo)致氨基酸比觀察值高估30％且9種氨基酸中6種在統(tǒng)計學(xué)上顯著低于觀察值(表20，d與f列比較)。另一方面，當(dāng)分母內(nèi)考慮添加氨基酸對pe的貢獻時，除tyr(p<0.05)以外，校正的計算值與觀察值匹配(p>0.05)(表20，e與f列比較)。然而，α<0.01時tyr與觀察值沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(p>0.01)。tyr值低于預(yù)期是由于tyr補充物純度較低。tyr可發(fā)生光解且加工或儲存期間可能已經(jīng)發(fā)生，這會導(dǎo)致純度低于預(yù)期。盡管所述gmp食品中的tyr滿足dri，提高tyr補充會提供較高的tyr水平。

由于對氨基酸組成的影響可以忽略和容易執(zhí)行，在僅計算gmp的補充物中簡單化是合理的，但進行g(shù)mp食品的質(zhì)量衡算時則不合理。gmp和補充的氨基酸占gmp布丁的15％(w/w)，而所述非乳奶精占該布丁的近40％(w/w)，且對最終組成有顯著影響。

盡管氨基酸的營養(yǎng)需求不是靜態(tài)問題，但本研究的質(zhì)量衡算方法可通用于根據(jù)最近的科學(xué)研究來補充gmp食品以達到或超過人飲食的營養(yǎng)需求。

實施例6：本發(fā)明的gmp食品與aa基制劑可接受度比較

本實施例中，發(fā)明人進行感官研究以比較馬薩諸塞州艾爾的凱布魯克食品有限公司(cambrookefoods,llc)制作的本發(fā)明藥用食物)bettermilk^tm和俄亥俄州哥倫布的雅培營養(yǎng)公司生產(chǎn)的pku飲食的常規(guī)氨基酸制劑phenex-2^tm的可接受度。bettermilk含gmp和補充量的氨基酸精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸。兩種制劑都補充有維生素和礦物質(zhì)以提供營養(yǎng)完備的藥用食物。結(jié)果表明在成人pku和非pku對象中g(shù)mpbettermilk比aa基的phenex-2顯著更易接受。

在本研究中，27個非pku成人和4個pku成人品嘗bettermilk和phenex-2。然后參與者將各產(chǎn)品的可接受度按1-8級打分。1–極度討厭；2–非常討厭；3–討厭；4–有點討厭；5-有點喜歡；6-喜歡；7-非常喜歡和8-極度喜歡。結(jié)果見圖11。從所示數(shù)據(jù)中可見，參與者給所述gmp食品的打分在所有可接受度標(biāo)準(zhǔn)上(氣味、味道、余味和總體)都比所述aa制劑高很多，且對pku參與者的可接受度差異顯著大于非pku參與者。這為本發(fā)明gmp藥用食品相對傳統(tǒng)氨基酸制劑的優(yōu)勢提供了進一步證據(jù)。

實施例7：gmp食品與氨基酸相比對pku個體中生長素釋放肽水平的影響

由于gmp藥用食物可能改善飽腹感，本研究的目的是用直觀類比標(biāo)度(vas)評估和比較pku個體進食gmp藥用食物早餐和基于aa早餐的血漿生長素釋放肽濃度。

使用上述實施例4中報道研究的額外數(shù)據(jù)，該研究證明在pku對象中g(shù)mp食品的早餐與基于aa的早餐相比能改善飽腹感和影響血漿食欲刺激激素生長素釋放肽濃度。實施例4中分析的11個pku對象(8個成人和3個年齡11-14的男孩)作為其自身對照在住院代謝研究中進行2次4天的治療：基于aa的飲食，然后用gmp食品替代所有aa制劑。早餐前和早餐后180分鐘獲取血漿生長素釋放肽濃度。用直觀類比標(biāo)度在早餐前、早餐后立即和早餐150分鐘后評估飽腹感。與基于aa的早餐相比，gmp餐后生長素釋放肽濃度顯著較低(p＝0.03)，而禁食生長素釋放肽沒有差異。更低的餐后生長素釋放肽濃度與早餐后更高的飽食感有關(guān)，說明gmp比aa有更大的飽腹感。這些結(jié)果表明持續(xù)的生長素釋放肽抑制，并說明進食含gmp的飲食比aa有更大的飽腹感。

材料和方法

血漿生長素釋放肽測定

所有餐后血液樣品于早餐開始后180分鐘(結(jié)束后150分鐘)獲取。對后6個對象(對象6-11)，還在所述aa飲食最后2天(第3和4天)和所述gmp飲食最后2天(第7和8天)的早餐前獲取禁食血液樣品。用放射免疫試驗(林可研究公司，密蘇里州圣查爾斯)測量禁食(n＝6)和餐后(n＝11)樣品的總血漿生長素釋放肽；將各對象第3+4天(aa飲食)和第7+8天(gmp飲食)的等體積血漿合并，因為觀察到這些天的血漿aa情況穩(wěn)定。從分析中移除對象2的總生長素釋放肽，因為該內(nèi)插數(shù)值明顯為統(tǒng)計異常值，其大大超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度。

進食動機vas問答

各對象在早餐前、早餐后立即、和早餐結(jié)束后2小時完成3次4問題的進食動機vas問答以評估食欲和飽腹感的主觀測定。各問題由兩端為相反內(nèi)容的100mm線組成。要求對象用垂直標(biāo)記表示出該線上何處最好的描述了其當(dāng)時就以下問題的感覺：(1)進食欲望有多強烈？，(2)有多餓？，(3)有多飽？和(4)你覺得能吃掉多少食物？(預(yù)期食品消耗，pfc)。使用如下公式計算各問答在進食動機vas問答中反應(yīng)四個問題的食欲評分：食欲評分(mm)＝[進食欲望+饑餓+(100-飽食)+pfc]/4

統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析由用于mac操作系統(tǒng)(macos)x版本2.9的統(tǒng)計學(xué)程序r進行(維也納經(jīng)濟與商業(yè)大學(xué)的統(tǒng)計計算r項目，奧地利維也納)。用對象配對的雙尾成對t檢驗進行主要分析。p<0.05時檢驗視為顯著；數(shù)值為均值±sem。用對象配對的成對t檢驗在各飲食治療內(nèi)(如禁食aa與餐后aa)和飲食治療之間(如禁食aa與禁食gmp)比較禁食和餐后血漿生長素釋放肽值。所述aa飲食最后一天和所述gmp飲食最后一天的進食動機vas問答在飲食內(nèi)(如禁食aa與餐后aa)和飲食之間(如禁食aa與禁食gmp)作比較。次要分析用線性混合效應(yīng)模型檢測以下因素：bmi、飲食治療、年齡、早餐主要營養(yǎng)素攝取、血漿phe和血漿數(shù)值(生長素釋放肽、胰島素和/或總aa)對每日vas問答的答案和生長素釋放肽血漿值的影響，就隨機對象效應(yīng)作對照。若無對象效應(yīng)，使用固定效應(yīng)線性模型。用反向淘汰找到最佳模型，消除不顯著的變量。

結(jié)果

進食動機vas分布

所述aa飲食(第4天)和所述gmp飲食(第8天)之間進食動機的vas分布在任何時間都沒有顯著差異。然而正如預(yù)期，進食所述aa或gmp早餐前、之后立即和之后2小時的食欲分布顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示)。蛋白攝取由混合效應(yīng)統(tǒng)計模型鑒定為vas問答的最常見顯著變量。早餐的蛋白含量顯示與早餐后立即的食欲評分顯著負相關(guān)(p＝0.01)從而早餐蛋白攝取較多使食欲評分降低。早餐后立即的食欲評分的最終模型中，蛋白含量之外的其他顯著因子包括bmi、年齡和飲食治療與研究日間的相互作用?；旌闲?yīng)模型分析中，bmi在所有時間顯著影響vas的答案。更高的bmi與更大的飲食欲望、饑餓和食欲評分以及更低的飽腹感關(guān)聯(lián)。

血漿生長素釋放肽

過夜禁食后獲得的血漿生長素釋放肽濃度在所述aa和gmp飲食之間沒有顯著差異(見圖12)且禁食血漿生長素釋放肽濃度和各變量之間沒有顯著相關(guān)性。具體地，在此多種樣品群體中沒有發(fā)現(xiàn)禁食生長素釋放肽和bmi之間有直接關(guān)聯(lián)。兩種飲食之間的禁食血漿總aa濃度也沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。于所述aa早餐開始后180分鐘獲取的餐后血漿生長素釋放肽濃度與所述aa早餐前的禁食生長素釋放肽沒有差異(圖12)。相反，所述gmp早餐導(dǎo)致餐后血漿生長素釋放肽濃度顯著較低，這是預(yù)期的餐后響應(yīng)。此外，所述gmp早餐后的餐后生長素釋放肽顯著低于所述aa早餐后的餐后生長素釋放肽。餐后生長素釋放肽和bmi之間沒有顯著關(guān)聯(lián)。使用反向淘汰與線性混合效應(yīng)模型，預(yù)測餐后生長素釋放肽的唯一因子是飲食治療，因為所述gmp早餐的餐后血漿生長素釋放肽較低。餐后血漿生長素釋放肽濃度是預(yù)測早餐后2小時飽食度的顯著因子(見圖13)。更高的飽食評分與更低的餐后生長素釋放肽濃度、飲食治療和生長素釋放肽與飲食之間的相互作用顯著相關(guān)。

討論

飲食中缺失蛋白源可能導(dǎo)致全天饑餓感增加。味道和偏好的改善與用gmp制作各種美味食品的能力一同支持gmp能通過提供更容易全天分配的蛋白源來改善pku的膳食控制的觀點。此外，我們首次報道了進食來自gmp的完整蛋白與合成aa相比導(dǎo)致pku患者餐后生長素釋放肽持續(xù)抑制。

生長素釋放肽是唯一已知的刺激食欲激素，在禁食狀態(tài)和期望進食時濃度最高，而餐后濃度受到抑制。對比患pku的3個兒童(年齡11-14)和8個成人(其作為自身對照)的aa和gmp早餐時，我們未發(fā)現(xiàn)禁食生長素釋放肽濃度的差異。

所述數(shù)據(jù)為生長素釋放肽對進食的響應(yīng)提供了新的信息。我們證明含完整蛋白gmp的等熱量早餐治療與合成aa相比引起不同的生長素釋放肽響應(yīng)。在將來自蛋白或糖的20％或更多能量進行等熱量替代的研究中，餐后生長素釋放肽水平下降與卡路里含量成正比且蛋白和糖以相似程度抑制生長素釋放肽。因此，gmp早餐中糖提供的高比例能量(7.8％)不太可能解釋本研究觀察到的不同生長素釋放肽響應(yīng)。

僅在禁食和早餐開始后180分鐘這兩個時間點測定生長素釋放肽濃度，因此可能錯過最低點。然而，觀察到gmp早餐的這兩個時間點間生長素釋放肽濃度顯著下降，但aa的沒有，說明攝取aa早餐在早餐后180分鐘時沒有持續(xù)抑制生長素釋放肽。事實上，aa飲食3小時后的生長素釋放肽饑餓信號與禁食12小時后沒有差異。完整蛋白較aa的餐后生長素釋放肽抑制更高可能是由于合成aa與gmp的吸收速率不同。血漿中的aa在進食aa后1小時出現(xiàn)a，而在進食相當(dāng)?shù)耐暾鞍缀蠹s2小時出現(xiàn)。已顯示aa的快速吸收對大鼠和人中蛋白的存留和利用有負面影響。

盡管長期進食aa的最顯著結(jié)果可能是蛋白存留減少，但血漿aa的急速增加仍影響飽腹感的生理信號。恒氨基酸理論提出血漿aa濃度的增加伴隨著gi激素的更強刺激的加強和食欲降低，隨后當(dāng)血漿aa濃度下降時食欲恢復(fù)(s.m.mellinkoff,m.frankland,d.boyle,m.greipel,relationshipbetweenserumaminoacidconcentrationandfluctuationsinappetite(血清氨基酸濃度和食欲波動的關(guān)系),1956,obes.res.5(1997)381–384)。因此，乳清蛋白如gmp可由于血漿aa的快速吸收和持久水平而減低食欲，而合成aa造成血漿aa的急速增加，這一aa增加與完整蛋白所造成的相比更快從血漿中消失且程度更高，導(dǎo)致食欲在餐后很快上升。含gmp的早餐比合成aa誘發(fā)更高的餐后總血漿aa和更低的生長素釋放肽，支持這一假說。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示較低餐后生長素釋放肽濃度和較高飽食感之間的關(guān)系，說明gmp飲食比aa能維持飽腹感。

生長素釋放肽抑制受到胃后反饋的調(diào)節(jié)(d.l.williams,d.e.cummings,h.j.grill,j.m.kaplan,meal-relatedghrelinsuppressionrequirespostgastricfeedback(飲食相關(guān)的生長素釋放肽抑制需要胃后反饋)，(endocrinology144(2003)2765–2767)，需要腸道末端而不是胃或十二指腸中的管腔營養(yǎng)素。進食基于aa的制劑后血漿aa的快速上升表明管腔營養(yǎng)素存在時間較短，因此限制了其抑制生長素釋放肽的能力。

此外，生長素釋放肽和胰島素以交互方式起作用(d.e.cummings,j.q.purnell,r.s.frayo,k.schmidova,b.e.wisse,d.s.weigle,apreprandialriseinplasmaghrelinlevelssuggestsaroleinmealinitiationinhumans(餐前血漿生長素釋放肽水平上升在人進食開始中的作用),diabetes50(2001)1714–1719)。相似地，我們的結(jié)果顯示含gmp的早餐較基于aa的早餐后的餐后血漿胰島素濃度更高且生長素釋放肽更低。因此，與常規(guī)氨基酸飲食相比，gmp食品可改善pku個體的胰島素和生長素釋放肽調(diào)節(jié)、飽腹感信號傳導(dǎo)和蛋白存留。

結(jié)論

pku的營養(yǎng)控制需要除合成aa外的新膳食選擇以促進全天進食低phe蛋白源從而改善代謝控制并控制饑餓。這些結(jié)果證實了進食中蛋白攝入對改善飽腹感的重要性，并為gmp早餐較aa早餐能長期抑制血漿飽腹感激素生長素釋放肽水平提供了新證據(jù)。用完整的低phe蛋白gmp制作的食物產(chǎn)品是提供生理上更完整的飲食從而改善膳食選擇并促進pku的蛋白分布和代謝控制的第一步。

實施例8：推薦用于本發(fā)明的氨基酸補充

在本預(yù)示性實施例中，發(fā)明人介紹本發(fā)明推薦的氨基酸補充量。具體地，發(fā)明人提供了先前操作實施例中所用的補充量的推薦變化。

甲硫氨酸。發(fā)明人不推薦在本發(fā)明的藥用食物中添加甲硫氨酸。近期已確定學(xué)齡兒童和成人的甲硫氨酸和胱氨酸的最低需求顯著低于先前認定(turner,等,amjclinnutr2006；83:619–23；ball,等.,jnutr2006；136(增刊2):1682s–93s)。這表明gmp含足量的甲硫氨酸，不需要甲硫氨酸補充。由于甲硫氨酸為味道不好的含硫氨基酸，基于gmp的食品中不補充甲硫氨酸還會提高該食品的可口度。

精氨酸。與前述實施例不同，發(fā)明人推薦在本發(fā)明的藥用食物中的gmp中補充額外精氨酸。具體地，發(fā)明人提出在本發(fā)明的藥用食物中添加精氨酸使該食品中精氨酸與蛋白的總重量比優(yōu)選為約60-90毫克精氨酸/克總蛋白，更優(yōu)選約75毫克精氨酸/克總蛋白。

盡管本領(lǐng)域認為精氨酸是營養(yǎng)性非必須氨基酸(tharakan等.,clinnutr2008；27:513–22)，但精氨酸具有多種非營養(yǎng)功能，包括作為合成蛋白、尿素和一氧化氮的底物(pah的輔因子四氫生物蝶呤也是一氧化氮合成的輔因子)。精氨酸在腎中由源自谷氨酸的腸瓜氨酸合成，并在尿素循環(huán)中氧化為鳥氨酸。與gmp中的最低精氨酸一致，實施例4的臨床試驗中報道的進食所述gmp的血漿精氨酸和鳥氨酸濃度顯著低于所述aa飲食(見表14)。因此，發(fā)明人的結(jié)論是gmp需要補充精氨酸以用于pku飲食。

亮氨酸。發(fā)明人建議本發(fā)明的藥用食物補充的亮氨酸量要顯著超過任何已發(fā)表的推薦攝取需求或超過任何前述操作實施例中所用的量。具體地，發(fā)明人提出在本發(fā)明的藥用食物中添加亮氨酸使該食品中亮氨酸與蛋白的總重量比優(yōu)選為約100-200毫克亮氨酸/克總蛋白，更優(yōu)選約100毫克亮氨酸/克總蛋白。

發(fā)明人已確定血漿亮氨酸水平上升可甲狀腺抑制phe利用某種載體蛋白通過腸粘膜和血腦屏障的轉(zhuǎn)運。因此，超出營養(yǎng)需求水平的亮氨酸補充可驚人的降低血漿和腦中的phe水平，腦是phe行使其神經(jīng)毒性效應(yīng)的主要器官。然后，推薦較高亮氨酸水平可導(dǎo)致使用本發(fā)明gmp基食品的pku個體的血漿和腦中phe水平降低。

此外，近期有證據(jù)證明亮氨酸通過提高mrna翻譯起始率來刺激骨骼肌蛋白合成(nortonle等,jnutr2009；139:1103-1109和crozier,sj等,jnutr2005；135:376-382)。pku患者中骨骼肌蛋白合成的改善會降低血液phe水平并可增加瘦體重(leanbodymass)。

酪氨酸。治療酪氨酸代謝疾病如酪氨酸血癥的藥用食物中不添加補充量的酪氨酸。對于其他應(yīng)用，包括pku飲食，發(fā)明人推薦本發(fā)明的藥用食物補充的酪氨酸量略多于任何上述操作實施例中的量。具體地，發(fā)明人提出在本發(fā)明的非熱處理藥用食物中添加酪氨酸使該食品中酪氨酸與蛋白的起始總重量比優(yōu)選為約62-93毫克酪氨酸/克總蛋白，更優(yōu)選約85毫克酪氨酸/克總蛋白。

酪氨酸是pku飲食中的重要氨基酸，因為其為必需且為腎上腺素、去甲腎上腺素、黑色素和甲狀腺素的前體。在上述實施例4中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)進食所述gmp或aa飲食的餐后或禁食樣品中獲得的血漿酪氨酸濃度沒有顯著差異(見上表14)。進食所述gmp和所述aa飲食的過夜禁食后血漿酪氨酸濃度都比餐后濃度低。然而，所述gmp飲食導(dǎo)致平均禁食酪氨酸濃度低于正常范圍。因此，發(fā)明人推薦酪氨酸補充高于實施例4所測的食品dri補充水平的150％。

此外，在上述實施例5中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)考慮分母內(nèi)添加氨基酸對pe的貢獻時，除tyr(p<0.05)外，所有測定氨基酸的校正計算值都匹配觀察值(p>0.05)(見上表20，e與f列比較)。tyr數(shù)值低于預(yù)期說明tyr在加工或儲存過程中有所降解。盡管所述gmp食品中的tyr滿足dri(其補充為dri的150％)，提高tyr補充會提供更高水平的tyr。

色氨酸。治療色氨酸代謝疾病如高色氨酸血癥的藥用食物中不添加補充量的色氨酸。對于其他應(yīng)用，包括pku飲食，發(fā)明人提出在本發(fā)明的藥用食物中任選添加色氨酸使該食品中色氨酸與蛋白的總重量比優(yōu)選為約12-14毫克色氨酸/克總蛋白，更優(yōu)選約12毫克色氨酸/克總蛋白。

在實施例4中，發(fā)明人觀察到所述gmp的餐后血漿trp水平比aa飲食減少29％。所述gmp飲食中的trp水平遠低于aa制劑中的trp范圍(約15mgtrp/g蛋白)。也有證據(jù)證明trp在神經(jīng)遞質(zhì)、血清素合成中很重要(passcuchi等,intljneuropsychopharmacology(2009),12:1067-79)。因此，推薦水平顯著高于用who出版的推薦最低攝取指南(世界衛(wèi)生組織，proteinandaminoacidrequirementsinhumannutrition(《人體營養(yǎng)中蛋白和氨基酸的需求》)，瑞士日內(nèi)瓦：聯(lián)合國大學(xué),2007)的130-160％建立的范圍或基于2002dri(藥物研究院，《能量、碳水化合物、纖維、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食參考攝取》)，華盛頓特區(qū)：國家科學(xué)出版，2002)的130％的推薦量。

組氨酸。治療組氨酸代謝疾病如組氨酸血癥的藥用食物中不添加補充量的組氨酸。對于其他應(yīng)用，包括pku飲食，發(fā)明人提出在本發(fā)明的藥用食物中任選添加組氨酸使該食品中組氨酸與蛋白的總重量比優(yōu)選為約20-24毫克組氨酸/克總蛋白，更優(yōu)選約23毫克組氨酸/克總蛋白。優(yōu)選范圍基于who出版的推薦最低攝取指南(世界衛(wèi)生組織，《人體營養(yǎng)中蛋白和氨基酸的需求》，瑞士日內(nèi)瓦：聯(lián)合國大學(xué),2007)的130-160％。更優(yōu)選的數(shù)值基于2002dri(《藥物研究院，能量、碳水化合物、纖維、脂肪、蛋白和氨基酸的膳食參考攝取》)，華盛頓特區(qū)：國家科學(xué)出版，2002)的130％。不同于其他氨基酸的推薦，這些組氨酸推薦值與所述操作實施例中使用的gmp藥用食物中所含的沒有不同。

基于本實施例所示的氨基酸補充量，可生產(chǎn)改善的gmp基藥用食物以提供pku個體所需的蛋白，并起到使血漿和腦組織中phe水平最小化的功能。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解或能僅采用常規(guī)實驗來確定本文所述的具體材料和方法的許多等同形式。應(yīng)認為該等同形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)且被下述權(quán)利要求包括。