本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體涉及一種多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨組織工程在損傷及病變骨的修復(fù)中是受到廣泛應(yīng)用與關(guān)注的途徑之一。在體內(nèi)植入進(jìn)行修復(fù)之前，干細(xì)胞通常被接種在具有3d連通孔結(jié)構(gòu)且在生物體內(nèi)可自行降解的具有良好生物相容性的支架上。在應(yīng)用中，由于3d生物支架將充當(dāng)人造細(xì)胞外基質(zhì)，因此制備得到的3d生物支架應(yīng)與天然細(xì)胞外基質(zhì)相仿。首先，用于制備3d生物支架的原料需具有良好生物相容性，并且能于體內(nèi)以適當(dāng)?shù)乃俣茸孕薪到?。第二，產(chǎn)物支架在結(jié)構(gòu)上需具備連通的多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，其中包括維持支架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖，運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大孔(直徑幾百微米)；促進(jìn)血管化，促進(jìn)代謝廢物的運(yùn)輸?shù)闹锌?直徑幾十微米)以及影響細(xì)胞基因表達(dá)等行為的小孔(直徑幾微米及以下)。另外，合格的生物支架還必須具備足夠支撐細(xì)胞培養(yǎng)過程中的物理負(fù)荷的力學(xué)性能。此外，由于在細(xì)胞接種以及支架植入初期經(jīng)常會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)。因此，3d生物支架還應(yīng)該具備藥物載體的功能。

由于其良好的生物相容性和易加工性能，合成生物可降解聚酯，尤其是左旋聚乳酸(plla)和聚己內(nèi)酯(pcl)被廣泛用于3d生物支架的制備。然而，純plla與純pcl體系的機(jī)械性能較差，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。通過將pcl，plla以及具有生物活性的無機(jī)納米粒子進(jìn)行結(jié)合，可有效提高體系的力學(xué)性能。

pickering高內(nèi)相乳液模板法與3d打印技術(shù)是近年來受到廣泛關(guān)注的制備3d生物支架的簡(jiǎn)易方法。其中，pickering高內(nèi)相乳液模板法是指：以內(nèi)相體積高于74%的固體粒子為穩(wěn)定劑的乳液為模板，通過溶劑揮發(fā)制備得到3d生物多孔支架的方法。pickering高內(nèi)相乳液模板法簡(jiǎn)單易操作，但是通常制備得到的支架只具有中孔及小孔結(jié)構(gòu)(acsappl.mater.interfaces,2014,19:17166-17175;j.control.release2015,e127-e127)，因此不能為細(xì)胞黏附提供充足的空間。3d打印技術(shù)作為新興的制備生物支架的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)支架孔結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)調(diào)控，但制備微米(及以下)級(jí)的孔結(jié)構(gòu)對(duì)機(jī)械的精密度以及編程的難度提出了更高的要求，因此大大提高制備了成本。不難看出，pickering高內(nèi)相乳液模板法與3d打印技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，為3d生物支架的制備提供了一種行之有效且經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法。

然而，3d打印對(duì)pickering乳液的粘度有較高的要求，而大部分固體粒子穩(wěn)定的pickering乳液粘度均較小，如疏水改性羥基磷灰石納米粒子穩(wěn)定的pickering高內(nèi)相乳液，由于其粘度達(dá)不到3d打印的要求(j.mech.behav.biomed.,2014,88-99)，因而限制了其進(jìn)一步的發(fā)展。疏水改性二氧化硅粒子由于其良好的機(jī)械性能及良好的生物相容性也受到了廣泛關(guān)注。并且，由疏水改性二氧化硅粒子穩(wěn)定的pickering高內(nèi)相乳液粘度較高，可以達(dá)到3d打印技術(shù)的要求，因此為pickering高內(nèi)相乳液模板法與3d打印技術(shù)的結(jié)合奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架，該類納米復(fù)合生物支架可用作組織工程支架，用于組織的修復(fù)和再生。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述一種多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，該制備方法基于油包水pickering高內(nèi)向乳液模版法與3d打印技術(shù)，工藝簡(jiǎn)單，材料來源廣泛、安全無毒，制備條件溫和，結(jié)構(gòu)可控，重復(fù)性好，適于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的還在于提供所述一種多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的應(yīng)用。

一種多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，包括如下步驟：

（1）將生物可降解聚酯加入有機(jī)溶劑中，超聲作用下充分溶解；

（2）將二氧化硅粒子加入步驟（1）得到的溶液中，超聲作用下分散均勻，配制得到油相；

（3）將蒸餾水加入步驟（2）得到的油相中，乳化，得到油包水（w/o）型乳液；

（4）將步驟（3）得到的乳液通過3d打印技術(shù)進(jìn)行打印，得到具備規(guī)則孔結(jié)構(gòu)的多孔支架，室溫放置，使溶劑和水相蒸發(fā)，得到所述多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架。

進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述生物可降解聚酯為人工合成的生物可降解聚酯，包括聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚羥基乙酸、聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物、聚羥基丁酸戊酯和聚β-羥基丁酸酯中一種以上。

進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述生物可降解聚酯相對(duì)于油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~8%，優(yōu)選為4~6%。

進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷。

進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述二氧化硅粒子為疏水改性二氧化硅粒子，粒徑分布為20nm～30nm。

進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述二氧化硅粒子相對(duì)于油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5~4%，優(yōu)選為2~2.5%。

進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述蒸餾水與油相的體積比為3~5:1。

進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述乳化是通過渦旋混合器在100～2800r/min下渦旋振蕩混合15～30min。

進(jìn)一步地，步驟（4）中，所述3d打印選用300cc的美式針筒，并組裝配套的美式活塞與內(nèi)徑為0.9mm的平頭針頭進(jìn)行打印。

進(jìn)一步地，步驟（4）中，所述具備規(guī)則孔結(jié)構(gòu)的多孔支架為規(guī)整的立方體結(jié)構(gòu)，其中長(zhǎng)、寬為35～40mm，高為7~12mm，共6~10層，每層平行均勻分布13~15條圓柱狀乳液，其中，奇數(shù)層呈橫向分布，偶數(shù)層呈縱向分布。

進(jìn)一步地，步驟（4）中，所述放置的時(shí)間為48~72h。

由上述任一項(xiàng)所述的制備方法制得的一種多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架，具備規(guī)則的大孔、中孔和小孔結(jié)構(gòu)，大孔直徑分布在300～700um，中孔直徑分布在10～100um，小孔直徑分布在1～10um，且支架孔結(jié)構(gòu)相互連通，疏水改性二氧化硅粒子附著或鑲嵌在孔壁表面，使得多孔支架孔壁表面粗糙。

多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架中，大孔結(jié)構(gòu)由3d打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)調(diào)控，中孔與小孔結(jié)構(gòu)由pickering乳液模板法實(shí)現(xiàn)控制，

所述的一種多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的應(yīng)用，用作組織工程支架或藥物載體。

進(jìn)一步地，所述組織工程支架包括骨組織工程支架。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

（1）本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高，重復(fù)性好，實(shí)現(xiàn)了pickering乳液模版法與3d打印技術(shù)的結(jié)合，生產(chǎn)成本低，適宜工業(yè)化生產(chǎn)；

（2）本發(fā)明制備方法條件溫和，不涉及任何化學(xué)反應(yīng)，原料簡(jiǎn)單，制備條件可控，可通過改變?nèi)橐褐苽錀l件方便快捷地調(diào)節(jié)多孔支架的孔結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)孔結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)的統(tǒng)一；

（3）本發(fā)明制備的具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架，可通過編寫不同的打印程序，對(duì)支架結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，便利地按照需求制備不同形狀的支架，使其更好的滿足實(shí)際應(yīng)用中的需求；

（4）本發(fā)明制備的具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架，可用作組織工程支架或藥物載體，所用材料生物可降解聚酯和疏水改姓二氧化硅納米粒子，為常用的多孔支架制備原料，來源豐富，安全無毒，具有良好的生物相容性；其中生物可降解聚酯還具可生物降解性，在應(yīng)用過程中可隨著細(xì)胞的繁殖逐漸降解，為細(xì)胞的生長(zhǎng)創(chuàng)造新空間，最終引導(dǎo)組織生長(zhǎng)成為特定的形狀；二氧化硅納米粒子還具良好的生物活性和機(jī)械強(qiáng)度。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中制備的多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的掃描電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此；其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

一種具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）將240mg聚乳酸和240mg聚己內(nèi)酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超聲10min，使聚乳酸和聚己內(nèi)酯完全溶解；

（2）將16mg疏水改性二氧化硅納米粒子（粒徑為20～30nm）加入步驟(1)得到的溶液中，在冰水浴中超聲5min，分散均勻，配制得到油相；

（3）將24ml蒸餾水分6批加入油相，油水混合體系經(jīng)渦旋混合器2800r/min渦旋混合乳化30min得到；

（4）將步驟（3）得到的乳液裝入300cc的美式針筒中，并組裝配套的美式活塞與內(nèi)徑為0.9mm的平頭針頭，在點(diǎn)膠機(jī)的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行程序編輯，并通過點(diǎn)膠機(jī)將乳液打印為規(guī)整的立方體結(jié)構(gòu)(35*35*7mm)，共6層，每層平行均勻分布13條圓柱狀乳液，其中，奇數(shù)層呈橫向分布，偶數(shù)層呈縱向分布；

（5）將步驟（4）得到的支架在室溫下于通風(fēng)櫥中放置48小時(shí)，自然干燥，得到具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架。

制備的多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架具備多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，其中包括大孔（500～700um），中孔（38～73um）以及小孔（1～10um），其掃描電鏡圖（如圖1）所顯示，制備得到的納米復(fù)合生物支架具備連通孔結(jié)構(gòu)，各孔之間由不同尺寸的孔喉進(jìn)行連通。

實(shí)施例2

一種具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）將320mg聚乳酸和320mg聚己內(nèi)酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超聲10min，使聚乳酸和聚己內(nèi)酯完全溶解；

（2）將20mg疏水改性二氧化硅納米粒子（粒徑為20～30nm）加入步驟(1)得到的溶液中，在冰水浴中超聲5min，分散均勻，配制得到油相；

（3）將24ml蒸餾水分6批加入油相，油水混合體系經(jīng)渦旋混合器2800r/min渦旋混合乳化30min得到；

（4）將步驟（3）得到的乳液裝入300cc的美式針筒中，并組裝配套的美式活塞與內(nèi)徑為0.9mm的平頭針頭，在點(diǎn)膠機(jī)的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行程序編輯，并通過點(diǎn)膠機(jī)將乳液打印為規(guī)整的立方體結(jié)構(gòu)(35*35*9mm)，共8層，每層平行均勻分布13條圓柱狀乳液，其中，奇數(shù)層呈橫向分布，偶數(shù)層呈縱向分布；

（5）將步驟（4）得到的支架在室溫下于通風(fēng)櫥中放置72小時(shí)，自然干燥，得到具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架。

制備的多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架具備多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，其中包括大孔（500～700um），中孔（30～75um）以及小孔（1～7um），其掃描電鏡圖（參見圖1）所顯示，制備得到的納米復(fù)合生物支架具備連通孔結(jié)構(gòu)，各孔之間由不同尺寸的孔喉進(jìn)行連通。

實(shí)施例3

一種具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）將40mg聚乳酸和40mg聚己內(nèi)酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超聲10min，使聚乳酸和聚己內(nèi)酯完全溶解；

（2）將3mg疏水改性二氧化硅納米粒子（粒徑為20～30nm）加入步驟(1)得到的溶液中，在冰水浴中超聲5min，分散均勻，配制得到油相；

（3）將32ml蒸餾水分5批加入油相，油水混合體系經(jīng)渦旋混合器1000r/min渦旋混合乳化15min得到；

（4）將步驟（3）得到的乳液裝入300cc的美式針筒中，并組裝配套的美式活塞與內(nèi)徑為0.9mm的平頭針頭，在點(diǎn)膠機(jī)的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行程序編輯，并通過點(diǎn)膠機(jī)將乳液打印為規(guī)整的立方體結(jié)構(gòu)(40*40*7mm)，共6層，每層平行均勻分布15條圓柱狀乳液，其中，奇數(shù)層呈橫向分布，偶數(shù)層呈縱向分布；

（5）將步驟（4）得到的支架在室溫下于通風(fēng)櫥中放置48小時(shí)，自然干燥，得到具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架。

制備的多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架具備多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，其中包括大孔（300～600um），中孔（30～88um）以及小孔（4～10um），其掃描電鏡圖（參見圖1）所顯示，制備得到的納米復(fù)合生物支架具備連通孔結(jié)構(gòu)，各孔之間由不同尺寸的孔喉進(jìn)行連通。

實(shí)施例4

一種具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）將280mg聚乳酸和280mg聚己內(nèi)酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超聲10min，使聚乳酸和聚己內(nèi)酯完全溶解；

（2）將20mg疏水改性二氧化硅納米粒子（粒徑為20～30nm）加入步驟(1)得到的溶液中，在冰水浴中超聲5min，分散均勻，配制得到油相；

（3）將40ml蒸餾水分4批加入油相，油水混合體系經(jīng)渦旋混合器2800r/min渦旋混合乳化30min得到；

（4）將步驟（3）得到的乳液裝入300cc的美式針筒中，并組裝配套的美式活塞與內(nèi)徑為0.9mm的平頭針頭，在點(diǎn)膠機(jī)的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行程序編輯，并通過點(diǎn)膠機(jī)將乳液打印為規(guī)整的立方體結(jié)構(gòu)(38*38*7mm)，共6層，每層平行均勻分布14條圓柱狀乳液，其中，奇數(shù)層呈橫向分布，偶數(shù)層呈縱向分布；（5）將步驟（4）得到的支架在室溫下于通風(fēng)櫥中放置64小時(shí)，自然干燥，得到具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架。

制備的多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架具備多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，其中包括大孔（300～600um），中孔（41～100um）以及小孔（4～10um），其掃描電鏡圖（參見圖1）所顯示，制備得到的納米復(fù)合生物支架具備連通孔結(jié)構(gòu)，各孔之間由不同尺寸的孔喉進(jìn)行連通。

實(shí)施例5

一種具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）將280mg聚乳酸和280mg聚己內(nèi)酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超聲10min，使聚乳酸和聚己內(nèi)酯完全溶解；

（2）將32mg疏水改性二氧化硅納米粒子（粒徑為20～30nm）加入步驟(1)得到的溶液中，在冰水浴中超聲5min，分散均勻，配制得到油相。

（3）將32ml蒸餾水分7批加入油相，油水混合體系經(jīng)渦旋混合器2000r/min渦旋混合乳化20min得到；

（4）將步驟（3）得到的乳液裝入300cc的美式針筒中，并組裝配套的美式活塞與內(nèi)徑為0.9mm的平頭針頭，在點(diǎn)膠機(jī)的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行程序編輯，并通過點(diǎn)膠機(jī)將乳液打印為規(guī)整的立方體結(jié)構(gòu)(35*35*9mm)，共8層，每層平行均勻分布13條圓柱狀乳液，其中，奇數(shù)層呈橫向分布，偶數(shù)層呈縱向分布；

（5）將步驟（4）得到的支架在室溫下于通風(fēng)櫥中放置48小時(shí)，自然干燥，得到具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架。

制備的多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架具備多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，其中包括大孔（300～700um），中孔（30～68um）以及小孔（4～7um），其掃描電鏡圖（參見圖1）所顯示，制備得到的納米復(fù)合生物支架具備連通孔結(jié)構(gòu)，各孔之間由不同尺寸的孔喉進(jìn)行連通。

實(shí)施例6

一種具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）將240mg聚乳酸和240mg聚己內(nèi)酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超聲10min，使聚乳酸和聚己內(nèi)酯完全溶解；

（2）將16mg疏水改性二氧化硅納米粒子（粒徑為20～30nm）加入步驟(1)得到的溶液中，在冰水浴中超聲5min，分散均勻，配制得到油相；

（3）將24ml蒸餾水分5批加入油相，油水混合體系經(jīng)渦旋混合器2000r/min渦旋混合乳化30min得到；

（4）將步驟（3）得到的乳液裝入300cc的美式針筒中，并組裝配套的美式活塞與內(nèi)徑為0.9mm的平頭針頭，在點(diǎn)膠機(jī)的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行程序編輯，并通過點(diǎn)膠機(jī)將乳液打印為規(guī)整的立方體結(jié)構(gòu)(35*35*12mm)，共10層，每層平行均勻分布13條圓柱狀乳液，其中，奇數(shù)層呈橫向分布，偶數(shù)層呈縱向分布；

（5）將步驟（4）得到的支架在室溫下于通風(fēng)櫥中放置48小時(shí)，自然干燥得到具備多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架

制備的多級(jí)可控通孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合生物支架具備多級(jí)孔結(jié)構(gòu)，其中包括大孔（300～500um），中孔（34～85um）以及小孔（5～10um），其掃描電鏡圖（參見圖1）所顯示，制備得到的納米復(fù)合生物支架具備連通孔結(jié)構(gòu)，各孔之間由不同尺寸的孔喉進(jìn)行連通。