(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及絞股藍總黃酮的新用途，具體涉及一種絞股藍總黃酮在制備防治心肌肥厚的藥物中的應用。

(二)

背景技術(shù)：

絞股藍也被叫做烏七葉膽，主要為葫蘆科絞股藍屬植物。具有著性寒、味甘、安神、有益氣、降血壓的功效，所以在民間，作為神奇的“不老長壽藥草”，而且處于名貴中藥材的首位?；A(chǔ)藥效學研究結(jié)果表明，它具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、降血脂、抗心律失常、促白細胞升高等藥理作用。

絞股藍總黃酮對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷具有保護作用，與減少腫瘤壞死因子(tnf-a)生成，下調(diào)fas/fasl蛋白表達，抑制凋亡有關(guān)(李樂,高曉利,丁寶興，袁秉祥.絞股藍總黃酮對缺氧/復氧心肌細胞tnf-a濃度，fas_fasl蛋白表達的影響中國中藥雜志,2007,32(18):1925-1927.)；絞股藍總黃酮抗心肌缺血作用可能與下調(diào)心肌細胞p38mapk的表達，抑制tnf-α的產(chǎn)生、減輕心肌自由基損傷程度等有關(guān)(李樂,高小利,袁秉祥.絞股藍總黃酮對大鼠異丙腎上腺素誘導心肌缺血的對抗作用及其機制研究.中國應用生理雜志,2008,24(3):289-290)。氧化應激、心肌細胞凋亡、細胞因子觸發(fā)炎癥反應、p38mapk過度表達等可能與心肌肥厚的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。但將絞股藍總黃酮應用于治療以心肌肥厚為基礎(chǔ)的相關(guān)疾病國內(nèi)外未見研究報道。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一在于提供絞股藍總黃酮提取物在制備防治心肌肥厚或以心肌肥厚為基礎(chǔ)的相關(guān)疾病的藥物中的應用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種絞股藍總黃酮提取物在制備防治心肌肥厚或以心肌肥厚為基礎(chǔ)的疾病藥物中的應用,其特征在于，所述的絞股藍總黃酮提取物從絞股藍莖葉碎片中利用乙醇為提取溶劑提取獲得。

進一步，所述的絞股藍總黃酮提取物的提取方法為：

(1)將絞股藍莖葉洗凈,干燥，粉碎過篩,經(jīng)石油醚脫脂，干燥得到絞股藍藥渣，將所述絞股藍藥渣置于在65％乙醇溶劑中超聲提取,減壓濃縮至浸膏狀,真空干燥得絞股藍總黃酮提取物粗品；所述的乙醇溶劑的加入量以絞股藍顆粒的質(zhì)量計為25～40ml/g；

(2)將步驟(1)所述絞股藍總黃酮提取物粗品加水溶解,濾液先經(jīng)ab-8型大孔吸附樹脂分離,乙醇洗脫,減壓蒸餾得濃縮液a；

(3)步驟(2)所得濃縮液a經(jīng)聚酰胺樹脂分離,乙醇洗脫,減壓蒸餾得濃縮液b，所述濃縮液b冷凍干燥后即得絞股藍總黃酮提取物。

再進一步，所述的以心肌肥厚為基礎(chǔ)的疾病為高血壓、風濕性心臟病、肺心病、甲亢、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、冠心病或貧血。

進一步，所述絞股藍總黃酮提取物以絞股藍總黃酮計的用量為100～400mg/kg/d，優(yōu)選150～300mg/kg/d，更加優(yōu)選100～200mg/kg/d，最優(yōu)選150mg/kg/d。

再進一步，所述絞股藍總黃酮提取物可制成絞股藍總黃酮片、絞股藍總黃酮膠囊、絞股藍總黃酮緩釋片、或絞股藍總黃酮注射液的藥物制劑。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種中藥絞股藍黃酮的可藥用鹽在制備防治心肌肥厚或以心肌肥厚為基礎(chǔ)的疾病藥物中的應用。

進一步，所述的絞股藍總黃酮可藥用鹽為鹽酸絞股藍總黃酮。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種中藥絞股藍黃酮和/或中藥絞股藍黃酮可藥用鹽與人體可接受的藥用輔料組成的中藥絞股藍藥物組合物制備防治心肌肥厚或以心肌肥厚為基礎(chǔ)的疾病藥物中的應用。

進一步，所述中藥絞股藍藥物組合物的用藥量以絞股藍總黃酮計為100～400mg/kg/d，優(yōu)選為150～300mg/kg/d，更加優(yōu)選為100～200mg/kg/d，最優(yōu)選為150mg/kg/d。

推薦所述絞股藍總黃酮的藥物制劑為絞股藍總黃酮片、絞股藍總黃酮緩釋片或絞股藍總黃酮膠囊時，所述絞股藍總黃酮的藥物制劑以絞股藍總黃酮為100～300mg/片；所述絞股藍總黃酮緩釋片或絞股藍總黃酮的藥物制劑為膠囊劑時，所述絞股藍總黃酮的藥物制劑以絞股藍總黃酮計為25～50mg/膠囊。

本發(fā)明利用自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚模型,β受體激動劑異丙腎上腺素刺激誘導小鼠心肌，復制小鼠心肌肥厚模型；利用腹主動脈縮窄誘導大鼠心肌肥厚，復制大鼠心肌肥厚模型，應用不同劑量的中藥絞股藍總黃酮，經(jīng)藥效學整體動物實驗研究，取得了肯定的治療效果。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了絞股藍總黃酮(totalflaveosofgynostemmpentaphyllum(thunb)makinor,tfg)在制備防治心肌肥厚或以心肌肥厚為基礎(chǔ)的相關(guān)疾病的藥物中的應用，為新藥篩選提供了基礎(chǔ)。

(四)附圖說明

圖1為實施例1中,tfg對shr心肌組織病理組織學的作用.(n＝8；he,×400)a:wky；b:shr；c:shr+cap；d:shr+tfg-l；e:shr+tfg-h

圖2各組大鼠心肌組織ace和at1的蛋白表達(,n＝8)

a:wky；b:shr；c:shr+cap；d:shr+tfg-h；e:shr+tfg-l(p<0.01或p<0.05)。

圖3為實施例2中各組小鼠血清ldh活性、心肌組織sod活性、mda含量的變化；

n＝15，與對照組比較，^**p<0.01；與iso模型組比較，^#p<0.05，^##p<0.01。

圖4-i為實施例2各組小鼠心肌細胞病理切片(n＝15,he染色，×400)；

a：對照組；b：iso模型組；c：iso+tfg100mg/kg/d治療組；d：iso+tfg300mg/kg/d治療組。

圖4-ii為實施例2各組小鼠心肌細胞病理切片(n＝15,masson染色，×400)

a：對照組；b：iso模型組；c：iso+tfg100mg/kg/d治療組；d：iso+tfg300mg/kg/d治療組。

圖5為實施例2各組小鼠心肌間質(zhì)纖維化定量分析(n＝15)，與對照組比較，^**p<0.01；與iso模型組比較，^#p<0.05，^##p<0.01。

圖6-i為實施例2各組小鼠心肌細胞erk1蛋白表達變化(erk1，×400)；

a：對照組；b：iso模型組；c：iso+tfg100mg/kg/d治療組；d：iso+tfg300mg/kg/d治療組。

圖6-ii為實施例2各組小鼠心肌細胞erk2蛋白表達變化(erk2，×400)；

a：對照組；b：iso模型組；c：iso+tfg100mg/kg/d治療組；d：iso+tfg300mg/kg/d治療組。

圖7為實施例2各組小鼠心肌細胞erk1/2定量蛋白表達變化((n＝15).與對照組比較，^**p<0.01；與iso模型組比較，^#p<0.05，^##p<0.01。

圖8為實施例3各組大鼠心肌組織學改變(n＝8)(he染色，×400)；

a：對照組；b：aac模型組；c：aac+tfg100mg/kg/d治療組；d：aac+tfg300mg/kg/d治療組；e：aac+纈沙坦10mg/kg/d治療組。

圖9為實施例3各組腹主動脈縮窄高血壓大鼠心肌組織anp，β-mhc表達的變化(n＝8；),

a：對照組；b：aac模型組；c：aac+tfg100mg/kg/d治療組；d：aac+tfg300mg/kg/d治療組；e：aac+纈沙坦10mg/kg/d治療組。與對照組比較：^*p<0.05，^**p<0.01；與aac模型組比較：^#p<0.05,^##p<0.01.

(五)具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。

實施例1：絞股藍總黃酮減緩自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚及機理初步研究

1材料

1.1原材料及藥品絞股藍總黃酮(totalflaveosofgynostemmpentaphyllum(thunb)

makinor,tfg)；卡托普利(captopril,cap),規(guī)格:25mg/片,批號20151214,廣東汕頭金石制藥總廠。

1.2試劑與儀器

1.2.1主要試劑碘[¹²⁵i]血管緊張素ⅱ(¹²⁵i-angiotensinⅱ,¹²⁵i-angⅱ)放射免疫試劑盒，批號:150132；碘[¹²⁵i]醛固酮¹²⁵ⅰ-aldosterone,¹²⁵i-ald)放射免疫試劑盒，批號:150084；均購自北京北方生物技術(shù)研究所；trizol:invitrogen,批號:15596018；總rna提取試劑盒及cdna第一鏈合成試劑盒(杭州博日科技有限公司)；熒光pcr試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)，批號:c28025-032；sybr選擇性混合劑:abi,批號:4472920；bca蛋白分析試劑盒:南京建成生物公司,批號:3445667，山羊抗兔igg,(h+l)，抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抗體(兔):abcam,批號:ab108252；抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶angiotensinconvertingenzyme,ace1抗體(鼠):abcam,批號:ab11734；抗血管緊張素ii型2抗體(兔):abcam,批號:ab18801。腫瘤壞死因子(tnf-a，批號:150213)及白細胞介素6(il-6，批號:150121)elisa檢測試劑盒(晶美生物工程有限公司)。

1.2.2主要儀器設(shè)備

mpa心功能分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，nis-elements尼康圖像處理軟件(日本尼康公司)，ge多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)，熒光定量pcr分析儀(美國abi公司)，化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)chemiscope3000(上海勤翔科學儀器有限公司)；電泳儀dycz-24dn(北京六一儀器廠)，imagelab5.0成像分析系統(tǒng)(美國伯樂bio-rad公司)。

1.3動物shr大鼠48只,wky大鼠8只,♂,12周齡,體重254±18g,spf級,購于上海斯萊克實驗動物有限公司,許可證號:scxk(滬)2015-013。所有動物均飼養(yǎng)于浙江工業(yè)大學動物實驗室spf級屏障系統(tǒng)內(nèi),4只/籠,恒溫(24±2)℃,恒濕(60±5)％,每天人工照明16h,自由取食和飲水。

2方法

2.1tfg的制備取絞股藍莖葉洗凈,50℃鼓風干燥48h,粉碎過篩,石油醚脫脂2h,藥渣揮干溶劑,真空干燥。取干燥藥渣200g65％乙醇3000ml超聲提取3次,每次30min,合并濾液,減壓濃縮至浸膏狀,真空干燥得tfg粗品。后加水溶解,過濾,濾液先經(jīng)ab-8型大孔吸附樹脂分離,乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓蒸餾得濃縮液a。再經(jīng)聚酰胺樹脂分離,乙醇洗脫,收集洗脫液,減壓蒸餾得濃縮液b,冷凍干燥后即得tfg精制品,測定其中總黃酮含量為56.73％,備用。

2.2實驗動物分組及給藥wky(高血壓大鼠對照品系)組:wky大鼠8只,灌胃給予蒸餾水10ml/kg；shr大鼠32只,隨機分為4組,每組8只:模型組(shr):灌胃給予10ml/kg；tfg低劑量組(shr+tfg-l,100mg/kg；tfg高劑量組(shr+tfg-h,300mg/kg；卡托普利組(shr+cap):灌胃給予卡托普利50mg/kg。各組大鼠每日1次灌胃給藥,灌胃持續(xù)4周,灌胃容積為10ml/kg。每周測體重1次,并調(diào)整給藥劑量。

2.3標本收集與指標測定

2.3.1血漿或血清制備末次給藥后,戊巴比妥鈉溶液ip麻醉大鼠(30mg/kg),立即腹主動脈取血2ml，至采血管內(nèi)(含0.1g/l肝素抗凝),3000r/min離心10min。分別吸取上清液,分裝至1.5mlep管中,置-70℃超低溫冰箱內(nèi)凍存待測。另大鼠采血后，靜置15min，離心后(3000r/min，10min)分離血清，elisa法檢測血清ifn-a、il-6的水平。

2.3.2左室肥厚指數(shù)測定取血后,開胸取心臟,生理鹽水沖洗,濾紙吸干稱重,計算心臟指數(shù)(心臟重量/體重×100％)。心臟沿室間隔剪開,并分離左、右心室,以濾紙吸干水分，分別稱重,計算心臟重量和體重比(hw/bw)、左室重量和體重比(lvm/bw),分析左室肥厚程度。

2.3.3組織病理學檢查稱重后,取部分心臟組織固定于100mg/g中性福爾馬林溶液,石蠟包埋,5μm厚度切片,he染色,觀察心肌組織病理學改變。在400倍光鏡下,通過hmias-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析軟件,測量左心室心肌細胞直徑(cardiacmyocyte

-diameter,cd)及心肌細胞橫截面積(cross-sectionalareaofcardiacmyocyte,csa)。每張切片隨機選取3個視野,每次計數(shù)20個細胞,取均值。

2.3.4制備組織勻漿取部分心臟組織,在冰冷生理鹽水中反復漂洗,濾紙拭干,稱重,按1∶10的比例加入0.9％冷生理鹽水作為勻漿介質(zhì),用眼科剪剪碎組織,倒入玻璃勻漿器中,用組織勻漿機勻漿,10s/次,間隙30s,勻漿4-6次(所有操作在冰水浴中進行),然后置4℃低溫離心機內(nèi),3000r/min離心10min,取上清液分裝至1.5mlep管,-70℃冰箱冷凍待測。

2.3.5血漿或組織angⅱ和ald含量及血清ifn-a、il-6水平測定：嚴格按試劑盒說明書操作，測定血漿或組織勻漿液中angⅱ和ald含量；嚴格按elisa試劑盒說明書步驟進行，檢測血清ifn-a、il-6水平。

2.3.6rt-pcr法檢測ace、at1(血管緊張素受體1)mrna的表達量：

總rna的提取采用trizol法,酶標儀測量其濃度并檢測其純度(均在1.8～2.2之間)?？俽na，利用cdna第一鏈合成試劑盒合成cdna，primer5.0軟件輔助設(shè)計引物.內(nèi)參β-actin引物:上游:5-cccatctat-gagggttacgc-3,下游:5-tttaatgtcacg-cacgatttc-3，擴增產(chǎn)物長度165bp；ace引物:上游:5-attgcagccgggcaactt-3,下游:5-ctccgtgatgttggtgtcgt-3′,產(chǎn)物長度147bp；at1引物:上游:5′-ctctgccaattccct-gagtt-3′,下游:5′-ttggggcagtcatcttg-ga-3′,產(chǎn)物長度231bp。rt-pct循環(huán)條件：95℃預變性30s；95℃5s，60℃30s，循環(huán)40次；95℃15s，60℃1min，95℃15s形成熔點曲線。取各擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,imagelab成像分析系統(tǒng)對目的基因進行分析,以平均灰度值代表相應基因的表達量,并除以β-actin的平均灰度值,所得數(shù)值作為各擴增產(chǎn)物mrna的相對表達量。

2.3.7westernblot法檢測shr大鼠心肌組織ace、at1蛋白表達將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸后，進行10％sds-page電泳，采用半干轉(zhuǎn)進行蛋白轉(zhuǎn)膜，根據(jù)要求染色、封閉后一抗(β-actin、ace、at1)4℃孵育24h,二抗(piercegoatanti-mouseigg,piercegoatanti-rabbitigg)室溫孵育1h。待完成二抗孵育后進行ecl顯示處理，應用化學發(fā)光法在暗室中用膠片曝光，拍照,計算目的蛋白的積分光密度值,并與β-actin比較,計算目的蛋白的表達水平。

2.4統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)計量資料以,表示,統(tǒng)計分析采用spss17.0軟件one-wayanova方法進行多組樣本均數(shù)的比較,兩組間比較采用lsd檢驗。p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

3.1左室肥厚指數(shù)與wky組比較,shr組大鼠hw、hw/bw、lvm、lvm/bw均明顯增加(p<0.01)；與shr組比較,shr+tfg-l和shr+tfg-h組hw、hw/bw、lvm、lvm/bw均不同程度下降(p<0.01或p<0.05),shr+tfg-h組變化更為顯著(p<0.01)。結(jié)果見表1。

表1tfg對shr心肌肥厚參數(shù)的影響(,n＝8)

#p<0.05,##p<0.01vswky組；*p<0.05,**p<0.01vsshr組

3.2tfg對shr左室心肌組織病理學改變的影響he染色顯示,wky組心肌細胞肌纖維排列整齊、胞核明顯；與wky組相比,shr心肌細胞肥大,間隙增寬,細胞核增多且排列不規(guī)則,心肌纖維直徑變大,心肌細胞橫截面積增大，部分心肌細胞核肥大。各藥物治療組心肌病變有不同程度緩解,局部心肌排列紊亂,心肌細胞肥大程度較shr組減輕。結(jié)果見圖1，表2。

表2tfg對shr心肌細胞cd和csa的影響(,n＝8)

##p<0.01vswky組；p<0.05,**p<0.01vsshr組

3.3tfg對shr心臟和血液中angⅱ、ald含量及血清中ifn-a、il-6的影響實驗結(jié)果顯示,與wky組比較,shr組心臟和血液中angⅱ、ald含量均顯著升高(p<0.01)。與shr組相比,各給藥組angⅱ、ald含量均不同程度下降,其中shr+cap組、shr+tfg-h組變化差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01或p<0.05)，結(jié)果見表3。另外，與wky組相比，shr組ifn-a、il-6明顯升高(p<0.01)；與shr組相比，shr+tfg-h組明顯降低(p<0.01)。見表4

表3tfg對shr心臟和血液中angⅱald含量的(,n＝8)

##p<0.01vswky組；*p<0.05,**p<0.01vsshr組

表4tfg對shr血清中ifn-a、il-6水平的作用(,n＝8)

##p<0.01vswky組；*p<0.05,**p<0.01vsshr組

3.4tfg對shr心肌組織ace及at1的mrna表達量的影響與wky組比較,shr組心肌組織ace和at1的mrna表達量明顯上調(diào)；與shr組相比較,各給藥組心肌組織ace和at1的mrna表達量有不同程度下調(diào),結(jié)果見表5。

3.5tfg對shr心肌組織ace及at1蛋白表達的影響與wky組相比較,shr組心肌組織ace和at1的蛋白表達明顯增加(p<0.01)；shr組相比較,各給藥組心肌組織ace和at1的蛋白表達均有不同程度減少。結(jié)果見圖2。

表5各組大鼠心肌組織ace和at1mrna的相對表達量(,n＝8)

##p<0.01vswky組；*p<0.05,**p<0.01vsshr組

結(jié)論：

1.本研究結(jié)果顯示，tfg可降低心臟指數(shù)和左室肥厚指數(shù)，組織病理學研究顯示，tfg可減輕心肌細胞肥大程度，表明其有抑制高血壓大鼠心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展的作用。

2.實驗結(jié)果顯示,tfg可降低血清中tnf-a和il-6的含量，提示可能tfg通過抑制tnf-a和il-6，對心肌肥厚有保護作用。

3.實驗結(jié)果進一步顯示，tfg不僅可降低血漿中angii和ald的含量，同時也降低心肌組織中angii和ald的含量，表明tfg可抑制循環(huán)和心臟局部腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(raas)活性。

4.rt-pcr和westernblot結(jié)果顯示，tfg可減少的ace和at1mrna和蛋白的相對表達量，表明tfg可能在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上發(fā)揮作用，從而抑制raas活性.推測tfg可通過抑制ace而使angii合成減少，并通過降低at1的表達，減少與angii結(jié)合的水平.

實施例2：tfg抑制異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚作用及其機理研究

1材料與方法

1.1實驗動物：

清潔級昆明種小鼠，雌雄兼有，體重(20±2)g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號：scxk(浙)2016-0013，在浙江省實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室喂養(yǎng)和實驗。

1.2藥品與試劑：

絞股藍總黃酮((totalflaveosofgymostemmapentaphyllum(thunb)mak,tfg)，自制(方法見實施例1)；鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline，iso)注射液(上海禾木制藥有限公司，批號160008)；乳酸脫氫酶(ldh)、丙二醛(mda)及總超氧化歧化酶(t-sod)測試盒、蛋白定量測試盒均購自南京建成生物工程有限公司。兔抗erk1/2抗體購于美國santacruz有限公司，辣根過氧化物酶山羊抗小鼠抗體igg購于美國cellsignaling有限公司。

1.3主要儀器：

美國millipore公司產(chǎn)超純水系統(tǒng)；低溫離心機及低溫冰箱(德國heraeus產(chǎn)品)；-70℃低溫冰箱(美國forma公司產(chǎn)品)；紫外成像掃描儀(美國bio-rad公司產(chǎn)品)；美國foeodyne公司產(chǎn)影像分析儀；pcy儀9600(美國perkinelmer公司)；酶標儀(美國bio-rad550)；穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(上海精密儀器廠)；qwin圖象分析軟件(德國leica有限公司)；722n可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；mp200a型電子天平(上海第二天平儀器廠)。

1.4動物分組及造模：

取健康昆明種小鼠48只，雌雄各半，隨機分為：空白(對照)組、模型組、模型+tfg低劑量治療組、模型+tfg高劑量治療組4組，每組12只。除空白組外，其他各組小鼠均皮下注射iso，每天一次，第一天劑量為40mg/kg，第二天為20mg/kg，第三天為10mg/kg，第四天開始保持10mg/kg，連續(xù)14天。自由進食，給水，建立心肌肥厚模型，空白組每天皮下注射等量的生理鹽水作為對照。

1.5給藥：

給藥和造模同時進行，每日上午注射iso4h后，分別給予低、高劑量tfg100mg/kg和300mg/kg灌胃治療，每天一次?？瞻捉M和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天一次，連續(xù)4周。

1.6心臟重量指數(shù)測定：

小鼠末次給藥后禁食不禁水12h，稱小鼠體重(bodyweight,bw)，眼球取血處死，迅速打開胸腔取出心臟，用預冷的生理鹽水洗盡殘血，濾紙吸干后稱量全心重(heartweight,hw)，再分離出左心室，稱左心室重量(lvw)，分別計算心重指數(shù)(hw/bw)和左心室重量指數(shù)(lvwi＝lvw/bw)。另取心肌組織制作組織病理切片，沿房室環(huán)剪去大血管、心房以及右心室游離壁，將余下的室間隔、左心室游離壁置于10％福爾馬林溶液中固定24h。取出固定液中的左心室標本，經(jīng)流水沖洗，梯度乙醇脫水，透明，常規(guī)石蠟包埋，沿左心室長軸線每隔1mm橫斷面連續(xù)切取5μm厚切片，進行he及masson染色光學顯微鏡下觀察，拍照。觀察心肌肥厚、纖維化程度，用qwin圖象分析軟件分析心肌纖維化程度，分析比較各組心肌組織病理學變化。

1.7血清ldh活性、心肌組織sod活性和mda含量測定：

小鼠眼球取血后于4℃，3000r/min，離心10分鐘，分離血清，嚴格按照ldh試劑盒說明操作，測定ldh活性。取小鼠心肌組織，手工制備組織勻漿，于4℃，3000r/min，離心10分鐘，取上清液進行測定sod活性和mda含量，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.8免疫組化檢測小鼠心肌細胞erk1/2蛋白表達

免疫組化染色，erk1/2蛋白表達采用sp法，其主要步驟：石蠟切片脫蠟水化，3％雙氧水浸泡20min，羊血清孵育10min，依次加erk1/2抗體一抗室溫下60min，山羊抗小鼠igg二抗室溫30min，鏈親和素-過氧化物酶溶液室溫10min，dab顯色，蘇木素復染，脫水封片，顯微鏡下觀察。用qwin圖象分析軟件，對組織切片免疫組化染色胞漿中陽性表達進行定量分析，計算鏡下光密度值。

1.9統(tǒng)計學分析：

所有數(shù)據(jù)用spss17.0統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，以p＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1tfg對iso所致小鼠心臟質(zhì)量參數(shù)的影響：

與空白組比較，連續(xù)皮下注射iso后，模型組小鼠的全心和左心室重量指數(shù)有明顯增加(p＜0.01)，符合《藥理實驗方法學》第二版中的心肌肥厚模型標準，說明心肌肥厚模型制備成功。用tfg100、300mg/kg治療后，hwi和lvwi都較模型組有所減小，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，而300mg/kgsin組變化更為明顯。結(jié)果見表1。

表1各組小鼠全心和左心室重量指數(shù)比較(mg/g，)

與空白組比較，^*p＜0.01；與模型組比較，^#p＜0.05，^##p＜0.01

2.2tfg對iso所致小鼠心肌肥厚組織中氧化損傷指標的影響：

連續(xù)皮下注射iso后，模型組小鼠血清ldh、心肌組織中mda含量明顯升高，sod活性明顯降低，與空白組比較有顯著差異性(p＜0.01)；用tfg100、300mg/kg治療后，各治療組的ldh、mda值對比模型組明顯下降，sod明顯上升，具有顯著差異性(p＜0.05)；300mg/kgtfg組效果更加明顯，結(jié)果見圖3。

2.3心肌組織病理切片觀察

各組小鼠心肌組織光鏡下切片顯示，正常對照組心肌細胞紅色，排列整齊、致密，胞質(zhì)著色均勻，間質(zhì)細胞無增生。iso模型組細胞呈心肌肥厚改變，心肌細胞體積增大，呈圓形或類圓形，細胞核體積增大染色加深，血管和心肌細胞之間可見藍色纖維化增多和炎性細胞浸潤。高劑量tfg治療后，心肌損害的情況較模型組減輕，細胞排列較整齊，肥厚不明顯，炎性細胞浸潤減輕，胞質(zhì)著色明顯，間質(zhì)纖維化明顯減輕。見圖4-i，圖4-ii,圖5。

2.4各組小鼠心肌細胞erk1/2蛋白表達變化

圖7，圖6-i，圖6-ii顯示，與空白對照組比較，模型組心肌組織中總erk1/2蛋白相對表達量明顯增加，與空白對照組比較差異顯著(均p<0.05)。tfg治療后，心肌組織中總erk1/2的蛋白表達明顯降低，與模型組比較差異顯著(均p<0.05)。

結(jié)論：

1、iso誘導的心肌肥厚模型組小鼠心肌細胞體積增大，呈圓形或類圓形，細胞核體積增大染色加深，血管和心肌細胞之間可見藍色纖維化增多和炎性細胞浸潤；模型組中血清ldh水平、心肌mda含量升高及心肌sod活性下降，同時erk1/2蛋白的表達升高，與對照組相比差異顯著；

2、應用tfg治療，可明顯改善iso誘導的小鼠心肌肥厚的纖維化改變，降低iso誘導的小鼠心肌肥厚模型血清ldh水平、心肌mda含量、升高心肌sod活性，抑制其erk1/2蛋白的表達，顯示良好的心肌保護作用，其中大劑量tfg的作用較強。

3、tfg對iso誘導的小鼠心肌肥厚有保護作用，其發(fā)生機制可能與抑制erk1/2蛋白的表達、降低血清ldh水平、心肌mda含量、升高心肌sod活性的水平有關(guān)，tfg能清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用，提高機體的抗氧化能力。

實施例3：tfg對腹主動脈縮窄誘導的大鼠心肌肥厚的保護作用及其機理研究。

l材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器

絞股藍總黃酮((totalflaveosofgymostemmapentaphyllum(thunb)mak,tfg)，自制(方法見實施例1)；纈沙坦，華潤賽科藥業(yè)有限責任公司，批號：201512008；胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒(fura-3/am)，上海寶曼生物科技有限公司；山羊抗鼠的心房利鈉肽(atrialnatriureticpeptide,anp)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosinheavychain,β-mhc)多克隆抗體、辣根酶標記兔抗羊igg，武漢博士德生物技術(shù)有限公司；hpsonos5500彩色超聲診斷儀，美國惠普公司；大鼠血壓計，上海玉研科學儀器有限公司；熒光顯微鏡，ptll048，日本；紫外分光光度計，ultmspec-2000型，pharmacia；電泳數(shù)據(jù)處理與分析系統(tǒng)，kodak公司。

1.1.2實驗動物

健康sd大鼠50只，雌雄兼有，體重(212±19)g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號：scxk(浙)2016-0009，在浙江省實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室喂養(yǎng)和實驗。

1.2實驗方法

1.2.1心肌肥厚模型制備及實驗分組

50只大鼠行腹主動脈縮窄術(shù)(abdominalaortacoarctation，aac)，術(shù)前禁食12h，自由飲水。用3％戊巴比妥鈉按30mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位四肢固定。無菌條件下于左肋緣下0.5cm、腹正中線旁0.5cm處，縱切口2.5cm，逐層分離組織，進入腹腔。鈍性分離腹主動脈鞘，剝離腹主動脈。在左右腎動脈分支下方穿1.0號手術(shù)縫線，沿血管走行方向放置7號針頭與腹主動脈一起結(jié)扎(其中8只僅穿線不結(jié)扎作為假手術(shù)對照組)，隨后抽出針頭。腹腔內(nèi)滴入青霉素(40萬u/ml)適量，然后關(guān)腹。關(guān)籠飼養(yǎng)，正常飲食。腹主動脈縮窄手術(shù)大鼠存活37只，假手術(shù)對照組大鼠存活8只；死因主要與術(shù)中損傷下腔靜脈導致出血及麻醉有關(guān)。術(shù)后4周測定腹主動脈縮窄手術(shù)大鼠尾動脈血壓，33只大鼠血壓(systolicbloodpressure,sbp)≥140mmhg，作為成功復制高血壓模型，并隨機抽取32只分為：心肌肥厚組(生理鹽水lml/d，ig)、tfg組(100mg/kg/d/，ig)、tfg組(300mg/kg/d，ig)和纈沙坦組(10mg/kg/d，ig)，每組8只。假手術(shù)對照組大鼠8只(生理鹽水1ml/d，ip)。

1.2.2動物模型的處理

藥物治療8周后，再次測量體重、尾動脈壓；心臟彩超測量舒張末期左心室后壁和室間隔厚度；然后處死大鼠，稱左心室濕質(zhì)量(含室間隔)，檢測左心室質(zhì)量指數(shù)(lvmi)。左心室組織一部分置人10％甲醛緩沖液中固定12～24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后行切片處理，在400倍光鏡下,通過hmias-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析軟件,測量左心室心肌細胞直徑(cardiacmyocyte-diameter,cd)，分析心肌組織的病理形態(tài)學改變并照相。

1.3心肌細胞內(nèi)游離鈣離子([ca²⁺]i)濃度的測定

參照相關(guān)文獻(例如：柯俊,陳鋒,肖幸,戴木森,王曉萍,陳兵,陳敏,張存泰.鈣調(diào)蛋白激酶ⅱ抑制劑對肥厚心肌細胞的影響.中華急診醫(yī)學雜志,2012,doi：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.02.011)方法分離左室心肌細胞，將負載fura-3的心肌細胞置于熒光顯微鏡下(ptll048，日本)，鈣熒光的激發(fā)波長為340/380nm，發(fā)射波長為510nm。熒光信號經(jīng)felix專用軟件處理。

1.4免疫印跡法(westernblot)檢測anp、β-mhc的蛋白表達

取大鼠心肌組織，用trizol試劑提取組織蛋白質(zhì)，并用bradford方法測定蛋白質(zhì)的含量。將提取的等量蛋白質(zhì)加入3×加樣緩沖液，煮沸3min后上樣，在制備好的sds聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素濾膜上，按照標準的westernblot方法分別與anp、β-mhc抗體共同孵育2h，然后洗脫，封閉漂洗后加入稀釋的二抗。室溫下雜交1h，化學發(fā)光劑溫浴1min后曝光、顯影和定影，最后對結(jié)果進行吸光度掃描分析。

1.5統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差來表示，采用spssl7.0統(tǒng)計軟件進行分析。多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，以p＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1對大鼠sbp的影響

與心肌肥厚組比較，100mg/kgtfg組sbp沒有顯著降低[(25.49±1.86)kpavs(24.99±1.68)kpa，p>0.05]，但是300mg/kgtfg組，纈沙坦組sbp降低明顯[(18.54±1.52)kpa，(19.04±1.45)kpavs(24.99±1.68)kpa，p<0.01]，說明大劑量tfg具有降低sbp的作用，大劑量300mg/kgtfg與纈沙坦組相似。

2.2對室間隔、左室后壁厚度、心肌細胞直徑(cd)、左心室質(zhì)量指數(shù)(lvmi)的影響

tfg組和纈沙坦組的室間隔、左室后壁厚度高于對照組(p<0.05)，但低于心肌肥厚組(p<0.01)；tfg組的室間隔厚度高于纈沙坦組(p<0.05)，而二組的左室后壁厚度間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)，見表1。

tfg組和纈沙坦組的cd均顯著低于心肌肥厚組(p<0.01)，高于對照組(p<0.05)。提示tfg和纈沙坦有抑制左室肥厚的作用。而tfg組cd又高于纈沙坦組(p<0.05)，說明tfg組的作用不如纈沙坦組明顯，見表1。

tfg組的lvmi明顯低于心肌肥厚組(p<0.05)，提示tfg有抑制左心室肥厚的作用。但與纈沙坦組比較，tfg組的lvmi相對較高，顯示其作用弱于纈沙坦，見表1。

表1大鼠各實驗組室間隔、左室后壁厚度和心肌組織病理學的變化(n＝8；)

與對照組比較：^ap<0.05，^bp<0.01；與心肌肥厚組比較：^cp<0.05。

2.3心肌組織形態(tài)學改變

he染色顯示，對照組心肌細胞直徑無明顯增大，心肌細胞排列規(guī)整；心肌肥厚組可見心肌細胞直徑明顯增大，體積肥大，心肌細胞排列紊亂。tfg組和纈沙坦組心肌細胞較心肌肥厚組心肌細胞病理組織學改變減輕，見圖8。

2.4心肌細胞[ca²⁺]i的變化

心肌肥厚組細胞內(nèi)[[ca²⁺]i[(161.08±13.42)nmol/l]明顯高于對照組、100mg/kgtfg組、300mg/kgtfg組和纈沙坦組[(100.12±10.23，137.23±13.23，114.15±10.12，122.89±10.41)nmol/l，p<0.01]；tfg組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；纈沙坦組仍高于300mg/kgtfg組與對照組(p<0.05)?？梢姡?00mg/kgtfg降低心肌細胞[ca²⁺]i濃度的作用強于纈沙坦(p<0.05)。

2.5tfg對腹主動脈縮窄高血壓大鼠心肌組織anp、β-mhc的影響

anp、β-mhc的免疫印跡結(jié)果顯示(見圖9)：與對照組相比，心肌肥厚組的anp、β-mhc蛋白表達明顯增高(p<0.01)，提示在心肌肥厚時anp、β-mhc參與了心肌肥厚的病理過程，anp、β-mhc在心肌肥厚的發(fā)病機制中扮演著一定的角色。tfg組和纈沙坦組的anp、β-mhc表達均顯著低于心肌肥厚組(p<0.01)，tfg對anp、β-mhc蛋白表達的下調(diào)作用弱于纈沙坦。因此，tfg有可能是通過作用anp、β-mhc減緩和阻止心肌的肥厚。

結(jié)論：

1、大劑量tfg具有降低sbp的作用；

2、aac誘導大鼠心肌肥厚，心肌細胞直徑明顯增大，細胞排列紊亂；tfg和纈沙坦治療后，可以緩解心肌病理組織學改變，tfg對aac術(shù)后心肌肥厚大鼠有心肌保護作用；

3、tfg對抗aac術(shù)后大鼠心肌肥厚，可能與抑制心肌細胞[ca²⁺]i，抑制心肌細胞anp，β-mhc蛋白表達有關(guān)。