本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤靶向絲膠蛋白膠束及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

絲膠蛋白作為一種水溶性糖蛋白，是蠶絲蛋白的重要組成之一，起粘結(jié)絲素蛋白纖維的作用。傳統(tǒng)上絲膠蛋白經(jīng)常被視為蠶絲工業(yè)的廢物。近年來，隨著對絲膠蛋白研究工作的深入，這種曾經(jīng)的蠶絲工業(yè)廢料，因?yàn)榫哂锌寡趸?、?yōu)異的保濕性能、促哺乳動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂和低免疫原性等諸多生物活性，開始廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品、食品和生物科技領(lǐng)域(David L.Kaplan,et al,Progress in Polymer Science,2008,33,998-1012)。

絲膠蛋白分子結(jié)構(gòu)中含有極性側(cè)鏈和疏水區(qū)域，具有兩親性特質(zhì)，可以自組裝成納米膠束，用作藥物或活性物質(zhì)的遞送載體。單純的絲膠蛋白通過自組裝形成的粒子，粒徑大小在500～1000nm之間，體內(nèi)循環(huán)容易累積在肝臟和被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬。將合成高分子聚乙二醇和普朗尼克與絲膠蛋白自組裝可以使絲膠蛋白納米粒子的大小壓縮至藥物納米載體的最佳尺寸之內(nèi)(K.Y.Cho et al,International Journal of Biological Macromolecules,2003,32,36-42；S C Kundu,et al,Nanotechnology,2009,20,355101)。華中科技大學(xué)王琳課題組將腫瘤靶向配體分子葉酸和疏水性藥物阿霉素偶聯(lián)到絲膠蛋白上構(gòu)建酸敏感的腫瘤靶向納米載體，用于宮頸癌治療(Wang Lin,et al,ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8,6577-6585)。目前的國內(nèi)外研究存在許多不足和改善空間，比如用到的聚乙二醇和普朗尼在體內(nèi)不可降解，并且膠束在體內(nèi)循環(huán)的穩(wěn)定性不夠好，比如阿霉素作為一種廣譜抗癌藥物，對胃癌、胰腺癌等療效不佳，增加絲膠納米載體在體內(nèi)的循環(huán)、提高載藥量和療效、擴(kuò)大載體的應(yīng)用范圍，等等。

IR780(2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氫-3,3-二甲基-1-丙基-2H-吲哚-2-亞基)亞乙基]-1-環(huán)己烯-1-基]乙烯基]-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓碘化物)是一種有機(jī)小分子近紅外染料，具有優(yōu)良的光學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)。作為一種親脂性陽離子化合物，IR780可以優(yōu)先聚集在細(xì)胞膜電位更高的癌細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)被腫瘤細(xì)胞選擇性攝取。此外，IR780在近紅外區(qū)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，吸收特定波長的近紅外光會(huì)產(chǎn)生熒光、高熱和活性氧，產(chǎn)生的近紅外熒光具有很好的穿透性，能夠穿透組織成像，產(chǎn)生的高熱破壞腫瘤組織內(nèi)部的血管，活性氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死，用作腫瘤成像、光動(dòng)力學(xué)和光熱聯(lián)合治療，有望實(shí)現(xiàn)診療一體化(Zhang C,et al,Biomaterials,2010,31,6612-6617；Yue C,et al,Biomaterials,2013,34,6853-6861)。

但I(xiàn)R780在應(yīng)用上也存在很多缺陷，比如親水性差，在水溶液中容易聚集猝滅，導(dǎo)致量子產(chǎn)率低，而且光穩(wěn)定性差，游離的IR780容易發(fā)生光褪色(Jiang C,Acta Biomaterialia,2015,14,61-69)。生物大分子納米載體具有良好的生物相容性、體內(nèi)可降解、在體內(nèi)具有較長的循環(huán)時(shí)間、可靶向富集到腫瘤組織等優(yōu)越性能，是改善IR780局限性的理想載體系統(tǒng)之一(Wang Q,et al,Biotechnology Advances,2015,33,1855-1867)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過上述方法制備得到的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述腫瘤靶向絲膠蛋白膠束在制備腫瘤診斷制劑或治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的制備方法，包括如下制備步驟：

(1)絲膠蛋白的提?。簩⑿Q繭剪成碎片，滅菌后在堿溶液中煮沸，過濾除去絲素蛋白和其他不溶物得到絲膠蛋白溶液，透析除鹽，冷凍干燥得到絲膠蛋白干粉；

(2)絲膠蛋白-膽固醇衍生物的制備：將步驟(1)得到的絲膠蛋白干粉溶解于有機(jī)溶劑中，再加入膽固醇甲酰氯溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，得到絲膠蛋白-膽固醇衍生物；

(3)靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物的制備：將葉酸溶于二甲基亞砜中，加入活化劑避光活化，然后加入步驟(2)得到的絲膠蛋白-膽固醇衍生物的二甲基亞砜溶液，避光反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純水中透析純化，冷凍干燥得到靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物；

(4)靶向絲膠蛋白膠束的制備：將步驟(3)得到的靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物與IR780溶于有機(jī)溶劑，超聲輔助下分散于去離子水中，將所得混合液在去離子水中透析除去有機(jī)溶劑，得到腫瘤靶向絲膠蛋白膠束。

優(yōu)選地，步驟(1)中所述的滅菌是指用紫外光或乙醇進(jìn)行滅菌；所述的堿溶液為濃度為0.01～0.05M的碳酸氫鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸鉀溶液或碳酸氫鉀溶液；所述煮沸的時(shí)間為0.5～1.5h。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述的有機(jī)溶劑是指二甲基亞砜，所述的膽固醇甲酰氯溶液是指膽固醇甲酰氯的二氯甲烷溶液；所述的分離純化步驟為：蒸發(fā)除去二氯甲烷，然后通過乙醇沉淀，將所得產(chǎn)物重新分散于無水乙醚中，離心分離，棄去上清液，干燥得到絲膠蛋白-膽固醇衍生物。

優(yōu)選地，步驟(2)中所述膽固醇甲酰氯與絲膠蛋白的投料質(zhì)量比為1:(2～10)。

優(yōu)選地，步驟(3)中所述的活化劑為摩爾比為(1～2):1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)；所述葉酸與活化劑中NHS的摩爾比為1:(1～3)。

優(yōu)選地，步驟(3)中所述避光活化的時(shí)間為4～12h；所述避光反應(yīng)的時(shí)間為12～36h。

優(yōu)選地，步驟(4)中所述的有機(jī)溶劑是指DMSO；所述IR780與靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物的質(zhì)量比為1:(5～10)。

優(yōu)選地，步驟(4)中所述的透析是指用截留分子量為8000～14000Da的纖維素透析袋進(jìn)行透析。

一種腫瘤靶向絲膠蛋白膠束，通過上述方法制備得到。所述腫瘤靶向絲膠蛋白膠束為球形，直徑大小為50～150nm。

進(jìn)一步地，所述腫瘤靶向絲膠蛋白膠束由具有核殼結(jié)構(gòu)的絲膠蛋白-膽固醇衍生物組成，膠束外殼親水部分接有靶向配體分子葉酸，內(nèi)核的疏水部分負(fù)載疏水性抗癌藥物IR780。

上述腫瘤靶向絲膠蛋白膠束在制備腫瘤診斷制劑或治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的制備方法及所得到的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)本發(fā)明所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束由親水的絲膠蛋白和疏水的膽固醇組成，并偶聯(lián)了靶向配體分子葉酸，通過自組裝得到的膠束納米粒子具有優(yōu)良生物相容性，可體內(nèi)降解，降解產(chǎn)物無毒并具備腫瘤靶向的優(yōu)點(diǎn)；

(2)本發(fā)明利用靶向兩親性絲膠蛋白聚合物在水溶液中自組裝形成納米膠束，并負(fù)載疏水的近紅外染料IR780，具有良好的腫瘤成像效果和光熱治療效果，可望用作一種性能優(yōu)良的診療一體化的納米藥物載體。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例步驟(2)中絲膠蛋白-膽固醇衍生物的制備反應(yīng)機(jī)理與反應(yīng)過程示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例步驟(3)中靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物的制備反應(yīng)機(jī)理與反應(yīng)過程示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中所得絲膠蛋白和靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物的¹HNMR譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中最終所得負(fù)載IR780的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的透射電鏡圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束溶液的升溫曲線圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的細(xì)胞毒性分析的細(xì)胞存活率圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的體內(nèi)腫瘤靶向效果圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例中所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的體內(nèi)腫瘤治療效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

(1)絲膠蛋白的提?。簩⒓羲榈男Q繭通過紫外光滅菌后加入到0.02M的碳酸氫鈉溶液中煮沸30min，過濾除去不溶的絲素蛋白和其他不溶物，將濾液裝入截留分子量為8000～14000Da的纖維素透析袋，純水中透析三天除去離子鹽，冷凍干燥得到絲膠蛋白。

(2)絲膠蛋白-膽固醇衍生物的制備：將1.5g絲膠蛋白溶于20mL干燥的DMSO中，50℃溶解2h，冷卻至25℃；將0.3g膽固醇甲酰氯溶于5mL二氯甲烷，滴加至絲膠蛋白的DMSO溶液中，0.3mL的無水三乙胺作為縛酸劑，在氬氣保護(hù)下，30℃下反應(yīng)24h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，先用500mL乙醇沉淀得到絲膠蛋白-膽固醇衍生物，將其重新分散在200mL無水乙醚，離心分離，重復(fù)兩遍，干燥得到純化后的絲膠蛋白-膽固醇衍生物。該步驟反應(yīng)機(jī)理與反應(yīng)過程示意圖如圖1所示。

(3)靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物的制備：先將150mg葉酸溶于20mL干燥的二甲基亞砜中，加入90mgEDC和60mg NHS，30℃下避光活化6h，然后加入20mL的絲膠蛋白-膽固醇衍生物(1.5g)的二甲基亞砜溶液，繼續(xù)避光反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束，純水中透析，冷凍干燥得到靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物。該步驟反應(yīng)機(jī)理與反應(yīng)過程示意圖如圖2所示。

將步驟(1)得到的絲膠蛋白(Sericin)和本步驟得到的靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物(FA-Sericin-Chol)溶于DMSO-d6，樣品濃度為10mg/mL，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)，利用400兆超導(dǎo)核磁共振譜儀Bruker AVANCE 400(Bruker Co.,Switzerland)對樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行¹H NMR表征，結(jié)果如圖3所示。從圖3的核磁譜圖中可以看出，與絲膠蛋白相比，靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物的核磁譜圖在0.6-2.5ppm處出現(xiàn)了膽固醇質(zhì)子的核磁共振峰，在2.82和8.65ppm處出現(xiàn)了葉酸質(zhì)子的核磁共振峰，說明成功合成靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物。

(4)靶向絲膠蛋白膠束的制備：將10mg靶向絲膠蛋白-膽固醇衍生物和1.5mg IR780溶解在1mL的DMSO中，然后在超聲作用下將其滴入4mL的去離子水中，將所得混合溶液裝入截留分子量為3500的透析袋中，在25℃下用去離子水透析24h除去有機(jī)溶劑，得到腫瘤靶向絲膠蛋白膠束。

將本實(shí)施例所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束稀釋至10mL，經(jīng)孔徑為0.45μm和0.22μm的針式過濾器過濾，然后取10μL靶向絲膠蛋白膠束溶液，滴于200目表面鍍有碳膜的銅網(wǎng)上，自然干燥60s，然后將銅網(wǎng)浸泡在2％(w/v)磷鎢酸溶液中，染色60s，利用120kV透射電鏡FEI Tecnai G2Spirit(FEI Co.Netherlands)對納米粒子的形貌進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。從圖4的透射電鏡圖中可以看出，本實(shí)施例所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束，粒子呈圓形，大小為80～120nm。

本實(shí)施例所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的光熱效應(yīng)測試：

將濃度為1mg/mL的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束溶液稀釋至250μg/mL，取2mL溶液，用VD-IIA DPSS型808nm近紅外激光發(fā)生器(SintecOptronics Technology Pte.Ltd.,Singapore)照射不同時(shí)間，光強(qiáng)為2W·cm^-2，SC325型熱成像儀(FLIR，USA)記錄水溶液溫度的變化并拍照，設(shè)置蒸餾水組作對比。以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，溶液升高溫度為縱坐標(biāo)，作升溫曲線圖，考察腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)，結(jié)果如圖5所示。圖5的升溫曲線圖顯示，在近紅外光的照射下，負(fù)載IR780的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束溶液發(fā)生明顯的升溫現(xiàn)象，150s溫度升高了近16℃，完全能滿足臨床上腫瘤熱力學(xué)治療的要求。

本實(shí)施例所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束的細(xì)胞毒性分析：

將胃癌細(xì)胞(AGS)消化重懸，細(xì)胞密度調(diào)整為2×10⁴/L，在96孔培養(yǎng)板加入培養(yǎng)液為200μL/孔。細(xì)胞貼壁生長后，分別加入不同濃度梯度的負(fù)載IR780的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束，37℃孵育4h，吸出培養(yǎng)基，每孔加入200μL DMEM培養(yǎng)基；用VD-IIA DPSS型808nm近紅外激光發(fā)生器(SintecOptronics Technology Pte.Ltd.,Singapore)照射3min，光強(qiáng)為2W·cm^-2。每孔加入20μL MTT工作液(5g/L)，37℃孵育2h。吸去上清液，每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)，置平板搖床震蕩至結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀測定490nm波長各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果如圖6所示。在圖6的細(xì)胞存活率圖中，可以看出隨著IR780濃度上升，細(xì)胞存活率越低，對胃癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷效果。

本實(shí)施例所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束在體內(nèi)對腫瘤成像效果的考察：

在BALB/c雄性小鼠的右側(cè)大腿皮下接種0.1mL胃癌細(xì)胞(AGS)懸液，接種細(xì)胞濃度為1×10⁷個(gè)/mL，待腫瘤生長至100-200mm²時(shí)，尾靜脈注射負(fù)載IR780的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束溶液，其中IR 780劑量為0.1mg/kg。在注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h用小動(dòng)物活體成像儀In Vivo fx Pro(Carestream.Ltd,USA)拍攝裸鼠的熒光圖像，激發(fā)波長為720nm，曝光時(shí)間為30s。圖7是裸鼠靜脈注射24h后的活體熒光圖片，中間虛線框是腫瘤部位，結(jié)果顯示，腫瘤區(qū)域檢測到很強(qiáng)的熒光，其他位置的熒光很弱，說明負(fù)載IR780的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束體內(nèi)循環(huán)過程在腫瘤部位發(fā)生了聚集效應(yīng)，證明腫瘤靶向的有效性。

本實(shí)施例所得腫瘤靶向絲膠蛋白膠束在體內(nèi)對腫瘤治療效果的考察：

選取腫瘤形態(tài)較圓、體積相差較小的AGS荷瘤裸鼠，尾靜脈注射負(fù)載IR780的腫瘤靶向絲膠蛋白膠束溶液，其中IR 780劑量為0.1mg/kg，注射24h后，用VD-IIA DPSS型808nm近紅外激光發(fā)生器(SintecOptronics Technology Pte.Ltd.,Singapore)照射小鼠的腫瘤部位3min，光強(qiáng)為2W·cm^-2，每天固定時(shí)間照射一次，持續(xù)三天。圖8為荷瘤裸鼠治療三天后的照片圖，結(jié)果顯示，在近紅外光激發(fā)下，瘤體發(fā)生消融并萎縮，證明了良好的腫瘤治療效果。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。