本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種brd4抑制劑jq1在角膜瘢痕抑制中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

角膜瘢痕是繼發(fā)于多種角膜疾病的病理性改變，是許多角膜疾病造成視力不同程度損害甚至喪失的直接原因。角膜組織中含有角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，角膜的上皮細(xì)胞層受損后可迅速再生，而基質(zhì)層和內(nèi)皮細(xì)胞層在損傷后不可再生，角膜在外傷、炎癥瘢痕愈合后引起角膜混濁、屈光力改變等。角膜損傷后，角膜基質(zhì)細(xì)胞會死亡或者轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)表型，而修復(fù)表型可以使角膜基質(zhì)細(xì)胞再生或?qū)е吕w維化瘢痕形成。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，受傷部位周圍的角膜基質(zhì)細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，它們介導(dǎo)了細(xì)胞遷移、傷口收縮以及ecm重塑堆積，這些都嚴(yán)重影響了角膜的透明性及屈光性。

角膜瘢痕是個較難治愈的頑癥，目前針對角膜瘢痕尚無有效治療方法，臨床上嘗試過多種治療方法，如雷帕霉素、氟米龍眼液治療，或手術(shù)治療，如采用激光、冷凍、手術(shù)切除(植皮)、放療或用激素局部封閉等方法，但療效預(yù)后均不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種brd4抑制劑jq1在角膜瘢痕抑制中的應(yīng)用，該用途是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

當(dāng)角膜損傷時，tgfβ被激活，促使角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞，并同時增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，刺激膠原蛋白大量增多，引起ecm堆積，最終角膜瘢痕形成，平滑肌肌動蛋白α-sma是肌成纖維細(xì)胞合成的標(biāo)志，其水平的高低代表成纖維細(xì)胞活化的程度。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在人角膜基質(zhì)細(xì)胞hcf的分離培養(yǎng)過程中，于培養(yǎng)基中加入一定劑量的tgfβ能誘導(dǎo)hcf向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在誘導(dǎo)的過程中加入不同濃度的jq1(50-500nm)，jq1呈濃度梯度抑制hcf向肌成纖維細(xì)胞分化，另外與對照相比，tgfβ能提高brd4表達(dá)，而jq1呈梯度依賴作用抑制brd4的表達(dá)，表明表觀調(diào)控蛋白brd4與成纖維細(xì)胞分化密切相關(guān)。以正常c57小鼠建立角膜瘢痕模型，采用3mm環(huán)鉆作痕，上皮刮刀刮除角膜上皮后，用刮胡刀片刮除淺基質(zhì)層建立角膜瘢痕模型，成模后結(jié)膜下注射7μljq1(濃度為500nm，小鼠體重為25g/只)作為治療組(pbs為對照組)，治療后1,3,5天照相觀察瘢痕治療情況，結(jié)果表明建模后7天小鼠角膜出現(xiàn)顯著瘢痕，jq1結(jié)膜下注射后5天治療組與對照組相比瘢痕顯著改善，免疫熒光、westernblot結(jié)果都顯示治療后α-sma表達(dá)量降低，表明jq1能部分反轉(zhuǎn)、治療角膜瘢痕。以上發(fā)現(xiàn)促成了本發(fā)明。

其中，本發(fā)明術(shù)語為以下含義：

tgf-β轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactor-β，tgf-β)；

brd4，bet家族的一個成員，能夠特異性識別并結(jié)合染色質(zhì)組蛋白h3/h4乙酰化賴氨酸殘基，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，是細(xì)胞生長所必需，與細(xì)胞周期調(diào)控、dna復(fù)制及基因重排等密切相關(guān)，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

jq1作為一種小分子化合物，是bet蛋白家族的抑制劑，作用于brd4。ecm，細(xì)胞外基質(zhì)；hcf，人角膜基質(zhì)細(xì)胞；α-sma，α平滑肌肌動蛋白。

即本發(fā)明的第一目的在于提供一種制備治療或預(yù)防角膜瘢痕形成的藥物中的應(yīng)用，包括將角膜基質(zhì)細(xì)胞與一種有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物進(jìn)行接觸。

優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的制備治療或預(yù)防角膜瘢痕形成的藥物中的應(yīng)用中，所述應(yīng)用為使角膜基質(zhì)細(xì)胞，接觸有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物，由此減少角膜瘢痕形成、或反轉(zhuǎn)、改善或治療角膜瘢痕。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的制備治療或預(yù)防角膜瘢痕形成的藥物中的應(yīng)用中，所述角膜基質(zhì)細(xì)胞為人角膜基質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的制備治療或預(yù)防角膜瘢痕形成的藥物中的應(yīng)用中，所述抑制brd4表達(dá)的試劑為jq1或其衍生物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的制備治療或預(yù)防角膜瘢痕形成的藥物中的應(yīng)用中，所述jq1的濃度為50-500nm。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于制備預(yù)防或治療受試者中的角膜瘢痕的藥物中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括給予受試者一種有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明用于制備預(yù)防或治療受試者中的角膜瘢痕的藥物中的應(yīng)用中，所述應(yīng)用包括使角膜基質(zhì)細(xì)胞，接觸有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物，由此減少角膜瘢痕形成、或反轉(zhuǎn)、改善或治療角膜瘢痕。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明用于制備預(yù)防或治療受試者中的角膜瘢痕的藥物中的應(yīng)用中，所述受試者為哺乳動物；更優(yōu)選地，所述受試者為小鼠；最優(yōu)選地，所述受試者為人。

優(yōu)選地，在本發(fā)明用于制備預(yù)防或治療受試者中的角膜瘢痕的藥物中的應(yīng)用中，所述抑制brd4表達(dá)的試劑為jq1或其衍生物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明用于制備預(yù)防或治療受試者中的角膜瘢痕的藥物中的應(yīng)用中，所述jq1的濃度為50nm～500nm。

由上可見，本發(fā)明至少有以下優(yōu)點(diǎn)，即：

現(xiàn)有技術(shù)中jq1是一種bet蛋白家族抑制劑，可抑制多發(fā)性骨髓瘤、腦膠質(zhì)瘤、卵巢癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、中線癌等多種腫瘤的生長。

而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)tgfβ由角膜上皮細(xì)胞釋放，在正常角膜中處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)角膜損傷時，tgfβ被激活，促使基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞，并同時增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，刺激膠原蛋白大量增多，引起ecm堆積，最終角膜瘢痕形成。平滑肌肌動蛋白α-sma是一種新陳代謝活躍和具有高度收縮性的細(xì)胞，是肌成纖維細(xì)胞合成的標(biāo)志，其水平的高低代表成纖維細(xì)胞活化的程度。組蛋白乙?；潜碛^遺傳研究的重要組成部分，brd4通過與乙?；嚢彼峤Y(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，是慢性纖維化的驅(qū)動因子，而小分子化合物jq1則是其抑制劑，本發(fā)明以brd4為靶點(diǎn)，提供一種預(yù)防或治療角膜瘢痕的藥物小分子化合物jq1，可用于該病的早期干預(yù)治療。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一個實(shí)施例中的α-sma表達(dá)水平的免疫熒光檢測圖；

圖2為本發(fā)明的一個實(shí)施例中的α-sma表達(dá)水平的westernblot檢測圖；

圖3為本發(fā)明的一個實(shí)施例中的結(jié)膜注射jq1治療角膜瘢痕對照圖；

圖4為本發(fā)明的一個實(shí)施例中的jq1對α-sma表達(dá)水平的免疫熒光檢測圖；

圖5為本發(fā)明的一個實(shí)施例中的jq1對α-sma表達(dá)水平的westernblot檢測圖。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，給出了治療或預(yù)防角膜瘢痕形成的方法，該方法包括將角膜基質(zhì)細(xì)胞與一種有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物進(jìn)行接觸。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述方法為使角膜基質(zhì)細(xì)胞，接觸有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物，由此減少角膜瘢痕形成、或反轉(zhuǎn)、改善或治療角膜瘢痕。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述角膜基質(zhì)細(xì)胞為人角膜基質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述抑制brd4表達(dá)的試劑為jq1或其衍生物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述jq1的濃度為50nm～500nm。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，還提供了一種預(yù)防或治療受試者中的角膜瘢痕的方法，所述方法包括給予受試者一種有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述方法包括使角膜基質(zhì)細(xì)胞，接觸有效量的抑制brd4表達(dá)的試劑或其衍生物，由此減少角膜瘢痕形成、或反轉(zhuǎn)、改善或治療角膜瘢痕。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述受試者為哺乳動物；更優(yōu)選地，所述受試者為小鼠；最優(yōu)選地，所述受試者為人。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述抑制brd4表達(dá)的試劑為jq1或其衍生物。

更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，所述jq1的濃度為50nm～500nm。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，在人角膜基質(zhì)細(xì)胞hcf的分離培養(yǎng)過程中，于培養(yǎng)基d/f12中加入一定劑量的tgfβ能誘導(dǎo)hcf向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在誘導(dǎo)的過程中加入不同濃度的jq1(50-500nm)，jq1呈濃度梯度抑制hcf向肌成纖維細(xì)胞分化，另外與對照相比，tgfβ能提高brd4表達(dá)，而jq1呈梯度依賴作用抑制brd4的表達(dá)，表明表觀調(diào)控蛋白brd4與成纖維細(xì)胞分化密切相關(guān)。以正常c57小鼠建立角膜瘢痕模型，采用3mm環(huán)鉆作痕，上皮刮刀刮除角膜上皮后，用刮胡刀片刮除淺基質(zhì)層建立角膜瘢痕模型，成模后結(jié)膜下注射500nm的jq17μl(小鼠體重為25g/只)作為治療組(pbs為對照組)，治療后1,3,5天照相觀察瘢痕治療情況，結(jié)果表明建模后7天小鼠角膜出現(xiàn)顯著瘢痕，jq1結(jié)膜下注射后5天治療組與對照組相比瘢痕顯著改善，免疫熒光、westernblot結(jié)果都顯示治療后α-sma表達(dá)量降低，表明jq1能部分反轉(zhuǎn)、治療角膜瘢痕。

以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說明，應(yīng)理解以下僅為本發(fā)明的示例性說明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：研究添加jq1(abcam,美國)對tgfβ誘導(dǎo)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞hcf分化的影響。

采用2.4u/mldispaseii(roche,美國)4℃消化正常人角膜環(huán)(山東省眼科研究所眼庫提供，人角膜片中央角膜應(yīng)用于臨床手術(shù)后剩余的角膜環(huán)應(yīng)用于本研究)過夜，顯微鏡下撕去上皮層和內(nèi)皮，去掉多余的鞏膜組織，將角膜組織剪成6-8小塊，于1.25mg/ml膠原酶中37℃消化1小時，收集消化后的組織塊，用d/f12+10％fbs(gibco,美國)培養(yǎng)液重懸離心，接種培養(yǎng)皿中，為人角膜基質(zhì)細(xì)胞(hcf)p0代細(xì)胞，將p2-p4代hcf細(xì)胞2000個接種于96孔板中，選擇其中1孔作為對照，其余5孔加入2ng/mltgfβ，并在其中四孔tgfβ處理孔內(nèi)同時加入50-500nmjq1,然后于5％co2和37攝氏度的條件下培養(yǎng)，3天后免疫熒光檢測α-sma表達(dá)水平結(jié)果見圖1。

如圖1所示，免疫熒光結(jié)果顯示，在人角膜基質(zhì)細(xì)胞hcf的分離培養(yǎng)過程中，2ng/mltgfβ處理3天顯著提高了hcfα-sma表達(dá)水平，而jq1呈梯度依賴作用抑制α-sma的表達(dá)。即tgfβ處理3天顯著提高了hcfα-sma表達(dá)水平，而jq1呈梯度依賴作用抑制α-sma的表達(dá)。

接種于6孔板且分別加入jq1(50nm-500nm)、2ng/mltgfβ處理的一批細(xì)胞用westernblot定量檢測α-sma、brd4(gapdh是通用內(nèi)參，不是檢測對象，只是參照物)；tgfβ提高α-sma的同時也能提高brd4表達(dá)，并且jq1抑制α-sma的作用與其抑制brd4正相關(guān)，表明brd4在成纖維細(xì)胞分化過程中起重要作用，選擇jq1治療瘢痕其根源是以brd4為治療靶點(diǎn)。gapdh廣泛用作westernblot蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參，即將每個樣品測得的目的蛋白含量與本樣品的gapdh含量相除，得到每個樣品目的蛋白的相對含量，然后才進(jìn)行樣品與樣品之間的比較。

得到同樣的結(jié)果見圖2，其中，-表示陰性對照未加入相應(yīng)試劑；+表示加入2ng/mltgfβ實(shí)驗(yàn)組。westernblot結(jié)果表明，2ng/mltgfβ處理3天顯著提高了hcfα-sma表達(dá)水平，而jq1呈梯度依賴作用抑制α-sma的表達(dá)，其中100nmjq1抑制作用已足夠顯著，其抑制作用與brd4表達(dá)正相關(guān)，證實(shí)了表觀遺傳調(diào)控蛋白brd4在成纖維細(xì)胞分化過程中的作用。

實(shí)施例2：研究外源性添加jq1對角膜瘢痕的影響。

1.小鼠角膜瘢痕模型的建立及jq1對角膜瘢痕的影響。

將12只成年c57bl/6小鼠分別用3mm環(huán)鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區(qū)域內(nèi)的上皮，并用刮胡刀片刮除淺基質(zhì)層建立角膜瘢痕模型，7天后小鼠角膜出現(xiàn)顯著瘢痕，將成模小鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，結(jié)膜下注射7μljq1(濃度500nm，小鼠體重為25g/只)作為治療組(pbs為對照組)，治療后照相觀察瘢痕治療情況結(jié)果見圖3，如圖3所示建模后7天小鼠角膜出現(xiàn)顯著瘢痕(左上、右上圖)，jq1結(jié)膜下注射后5天治療組(右下圖)與對照組(左下圖)相比瘢痕顯著改善。

2.jq1對小鼠角膜瘢痕模型α-sma表達(dá)的影響

取治療后的c57bl/6小鼠眼球，置于oct冷凍包埋劑中制作冰凍樣本。用冰凍切片機(jī)制作8μm厚度冰凍切片,通過免疫熒光方法檢測jq1對α-sma的影響。如圖4所示，jq1治療組能明顯減少角膜基質(zhì)細(xì)胞中α-sma的表達(dá)(左圖為治療后對照組，即圖3左下眼球組織，右圖為治療后jq1處理組，即圖3右下眼球組織)，結(jié)果顯示治療后α-sma表達(dá)量降低。

另外收集上述處理的小鼠角膜用ripa蛋白裂解液(碧云天，中國)提取蛋白，采用westernblot方法定量分析α-sma表達(dá)情況，結(jié)果如圖5，jq1治療組能明顯減少α-sma蛋白的表達(dá),表明jq1能部分反轉(zhuǎn)、治療角膜瘢痕。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。