本發(fā)明涉及藥物制劑領域，具體涉及砂仁揮發(fā)油在制備治療克羅恩病的藥物中的應用。

背景技術：

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)作為一種病因不明的慢性復發(fā)性非特異性腸道疾病，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重為主要表現(xiàn)，臨床將其劃分為潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn'S disease，CD)兩種類型。隨著人們生活方式的改變和診斷水平的提高，其發(fā)病率逐年上升，給人們的生活質量帶來了極大的影響。同時，發(fā)病機制的復雜性和易感基因的發(fā)現(xiàn)使得炎癥性腸病逐漸成為消化疾病領域的研究熱點。IBD西醫(yī)治療藥物主要包括氨基水楊酸類、皮質激素類、免疫抑制劑和抗生素等，雖一定程度上可緩解癥狀，但藥物不良反應嚴重制約藥效的發(fā)揮，且價格昂貴。因此，尋找安全有效的中醫(yī)藥治療方法成為一種新的趨勢。

砂仁是我國四大南藥之一，也是著名的云藥品種，為歷代常用中藥，始載于《本草拾遺》。以其藥效可靠而著稱，也是我國南方常用的調味香辛料，為藥食兩用植物。《中國藥典》2015版[1]記載砂仁來源于姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.、綠殼砂Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen、海南砂Amomum longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果實或種子。本研究主要針對云南引種陽春砂，因其療效顯著、來源廣、產(chǎn)量宏豐，具有廣泛的臨床應用價值和良好的開發(fā)前景。

砂仁性辛、溫，歸脾、胃、腎經(jīng)，有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎之功，常用于濕濁中阻，脘痞不饑，脾胃虛寒，嘔吐泄瀉，妊娠惡阻，胎動不安?，F(xiàn)代研究顯示砂仁具有抗?jié)?、抗腹瀉、促進胃排空和胃腸推進運動、抗菌、利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血小板聚集和延長凝血時間等藥理作用，其中關于砂仁治療胃腸道疾病的作用較為集中，如理腸方中的參苓白術散、資生丸、溫腎扶脾湯等都用到了砂仁。

綜上可知，砂仁具有胃腸道疾病治療作用，但是現(xiàn)有技術中并未有將砂仁用于治療克羅恩病的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題即是提供砂仁揮發(fā)油在制備治療克羅恩病的藥物中的應用。

優(yōu)選的，所述藥物包括砂仁揮發(fā)油和醫(yī)學可接受的輔料，所述藥物可制成常見的藥物制劑，包括芳香水劑，合劑，軟膏劑，醑劑，滴丸，軟膠囊劑。

所述砂仁揮發(fā)油的制備方法為：精密稱取云南引種陽春砂仁400g，粉碎，置于圓底燒瓶中，10倍量蒸餾水，浸泡半小時，采用水蒸氣蒸餾法提取，蒸餾5h至流出液無明顯油珠為宜。無水硫酸鈉干燥收集揮發(fā)油，保存在-20℃冰箱，臨用前配制成所需濃度。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的砂仁揮發(fā)油對TNBS誘導的炎癥性腸病大鼠體重、食量、疾病活動度、結腸長度、結腸重量及組織病理情況有一定的調節(jié)作用，砂仁揮發(fā)油還可通過增加CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞表達比例，促進抗炎細胞因子TGF-β、IL-10的分泌，抑制促炎細胞因子IL-17、IFN-γ的釋放，進而抑制天然或獲得性免疫反應誘發(fā)的腸道炎癥。

附圖說明

圖1顯示砂仁揮發(fā)油對大鼠體重及食量的影響。

圖2顯示砂仁揮發(fā)油對大鼠結腸長度及重量的影響(注：與模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與正常組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)。

圖3顯示砂仁揮發(fā)油對大鼠疾病活動度指數(shù)(DAI)的影響。

圖4顯示砂仁揮發(fā)油對大鼠結腸大體損傷的影響(注：與模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與正常組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，(A)CON，(B)MOD，(C)VOA.H，(D)VOA.M，(E)VOA.L，(F)MES)。

圖5顯示砂仁揮發(fā)油對大鼠結腸組織病理的影響(注：與模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與正常組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，(A)CON，(B)MOD，(C)VOA.H，(D)VOA.M，(E)VOA.L，(F)MES)。

圖6顯示砂仁揮發(fā)油對T細胞相關因子的影響(注：與模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與正常組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)。

圖7顯示砂仁揮發(fā)油對大鼠脾臟中CD4+CD25+/CD4+表達的影響(注：與模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與正常組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，(A)CON，(B)MOD，(C)VOA.H，(D)VOA.M，(E)VOA.L，(F)MES)。

圖8顯示砂仁揮發(fā)油對大鼠脾臟中Foxp3+/CD4+CD25+表達的影響(注：與模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與正常組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，(A)CON，(B)MOD，(C)VOA.H，(D)VOA.M，(E)VOA.L，(F)MES)。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數(shù)、比率、比例或份數(shù)按重量計。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1砂仁揮發(fā)油的制備

精密稱取云南引種陽春砂仁400g，粉碎，置于圓底燒瓶中，10倍量蒸餾水，浸泡半小時，采用水蒸氣蒸餾法提取，蒸餾5h至流出液無明顯油珠為宜。無水硫酸鈉干燥收集揮發(fā)油，保存在-20℃冰箱，臨用前配制成所需濃度。

實施例2砂仁揮發(fā)油治療克羅恩病的效果

1.1炎癥性腸病大鼠模型的建立

原理：以乙醇作為腸粘膜屏障破壞物，溶解腸粘膜表面的黏液。TNBS作為一種半抗原物質，與腸粘膜角蛋白結合后成為一種抗原物質，激發(fā)局部免疫反應，造成與人類克羅恩病在發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)、病理學和免疫學改變等方面均相似的實驗性克羅恩病大鼠模型。

方法：SD大鼠，體重180±20g，禁食48h，3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，用改良后的兔灌胃針，由肛門輕緩插入結腸，深約8cm，注入100mg/kg的TNBS(200g大鼠20mg，相當于原液0.4ml)及0.25ml的50％乙醇溶液混合，然后注入約0.3ml空氣，以排空管中藥液，捏緊肛門，提起大鼠尾部，保持倒立1min，讓動物保持平躺自然清醒，常規(guī)飼養(yǎng)。正常對照組給予同體積生理鹽水灌腸。

1.2實驗動物分組和給藥劑量

炎癥性腸病模型復制成功后，隨機分組：正常對照組(CON)，模型組(MOD)、美沙拉嗪組(MES)、砂仁揮發(fā)油高劑量組(VOA.H)、砂仁揮發(fā)油中劑量組(VOA.M)、砂仁揮發(fā)油低劑量組(VOA.L)。正常對照組和模型組均給予飲用水灌胃，陽性對照組灌胃美沙拉嗪腸溶片；實驗組均以相應提取物灌胃。

SD雄性大鼠60只，適應性喂養(yǎng)一周，稱重，隨機分組?！吨袊幍洹?2015版)規(guī)定砂仁的用量為3-6g，選取中劑量4.5g。根據(jù)人與大鼠體表面積的等效劑量折算，得出大鼠的給藥劑量為0.014g/kg，作為砂仁揮發(fā)油中劑量，則砂仁揮發(fā)油高、低劑量分別為：0.028g/kg、0.007g/kg。陽性藥美沙拉嗪腸溶片給藥劑量為0.36g/kg，造模成功后開始給予藥物干預，按照1ml/100g的體積。正常對照組及模型組給予飲用水，給藥療程為9天。

1.3實驗動物血液及組織樣本采集

實驗結束前一天，禁食不禁水，對各實驗組大鼠進行眼內(nèi)眥取血，每次每只大鼠取血量為1.5-2.0ml。以上所取血液均以10000r/min的轉速4℃離心10min，分別取上層血清，分裝，采用ELISA試劑盒檢測上層血清中IL-17、TGF-β、IL-10的含量。

實驗結束當天，大鼠禁食不禁水，3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，迅速剖腹，摘取肛門以上7-8cm結腸，測量結腸長度，沿腸系膜緣剪開腸腔，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱重，肉眼觀察結腸組織病理評分，取病變明顯處組織，置于10％福爾馬林溶液中，留作病理切片。再取結腸組織若干液氮凍存，然后移至-80℃冰箱備用，臨用前制備結腸組織勻漿，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測結腸組織中MPO、IFN-γ、TNF-α的含量。

1.4實驗結果

1.4.1砂仁揮發(fā)油對大鼠體重及食量的影響

TNBS灌腸會使大鼠出現(xiàn)嚴重的腹瀉，導致體重下降。造模前，大鼠體重無顯著性差異，造模后7天內(nèi)，各給藥組大鼠能不同程度的改善大鼠腹瀉情況。如圖1所示，砂仁揮發(fā)油中劑量能顯著改善TNBS導致的大鼠體重及食量的降低。

1.4.2砂仁揮發(fā)油對大鼠結腸長度及重量的影響

TNBS灌注致炎后，大鼠的結腸腸壁增厚，結腸的長度會有不同程度的縮短，結腸重量也會有所增加。與正常對照組相比，模型組大鼠結腸與周圍組織出現(xiàn)粘連且腸壁明顯增厚，結腸長度及腸重均有顯著性差異(P<0.001)。砂仁揮發(fā)油能不同程度的改善大鼠結腸與周圍組織的粘連，以揮發(fā)油高劑量效果最為明顯(見圖2)。

1.4.3砂仁揮發(fā)油對大鼠疾病活動度指數(shù)(DAI)的影響

正常對照組大鼠，體重增加明顯，大便硬度適中，黑褐色，橢圓狀，無稀便及粘液血便，故其DAI評分為0。綜合大鼠體重變化，大便性狀及有無血便對各實驗組大鼠進行DAI評分，結果如圖3所示，模型組大鼠腹瀉嚴重，偶見黏液血便。揮發(fā)油各劑量組大鼠糞便逐漸成型，少有稀便，DAI評分均低于模型組。

1.4.4砂仁揮發(fā)油對大鼠結腸大體損傷的影響

正常對照組大鼠結腸黏膜厚薄均勻，未見粘連，無充血水腫、潰瘍等表現(xiàn)。模型組大鼠結腸腸壁增厚，與周圍組織粘連嚴重，結腸黏膜充血水腫，潰瘍糜爛，與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.001)。砂仁揮發(fā)油高、中劑量能有效改善結腸表現(xiàn)，黏膜充血水腫及潰瘍程度減輕，效果同陽性藥美沙拉嗪(見圖4)。

1.4.5砂仁揮發(fā)油對大鼠結腸組織病理的影響

正常對照組大鼠結腸組織黏膜上皮完整且連續(xù)，粘膜絨毛及腺體排列整齊，固有層少量淋巴細胞表達，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠結腸黏膜上皮細胞連續(xù)性消失，黏膜下層大量炎癥細胞浸潤，與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.001)。砂仁揮發(fā)油治療組大鼠結腸組織病理變化較模型組有明顯改善，粘膜絨毛及腺體排列紊亂程度減輕，且炎性細胞浸潤現(xiàn)象明顯減少(見圖5)。

1.4.6砂仁揮發(fā)油對T細胞相關因子的影響

與正常對照組相比，模型組結腸組織中MPO、TNF-а含量顯著增加(P<0.001或P<0.05)，提示模型組結腸組織中有大量中性粒細胞浸潤，給藥組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義。IL-17作為Th17細胞主要效應細胞，能有效介導前炎癥反應。砂仁揮發(fā)油高劑量能顯著降低大鼠血清中促炎因子IL-17的表達(P<0.01)，進而改善炎癥癥狀。砂仁揮發(fā)油高中低劑量均能顯著降低結腸組織IFN-γ的表達，改善腸道炎癥反應，與模型組相比有顯著性差異(P<0.01或P<0.001)。血清細胞因子TGF-β及IL-10分別具有調節(jié)上皮細胞再生，穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境的作用。與模型組相比，砂仁揮發(fā)油各劑量組TGF-β含量均顯著升高(P<0.001)，提示砂仁對TNBS誘導的結腸炎有一定的改善作用，效果優(yōu)于美沙拉嗪。與模型組相比，砂仁揮發(fā)油高、中劑量組大鼠IL-10含量顯著升高(P<0.001)，提示砂仁對腸道內(nèi)環(huán)境有一定的調節(jié)作用(見圖6)。

1.4.7砂仁對大鼠脾臟調節(jié)性T細胞亞群的影響

調節(jié)性T細胞(Treg cell)是一組具有免疫負調節(jié)的T細胞亞群，具有抑制自身反應性T細胞，維持機體免疫平衡等功能，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞是調節(jié)性T細胞亞群之一。如圖7所示，模型組大鼠脾臟中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的表達低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；砂仁揮發(fā)油低劑量能提高CD4+CD25+T細胞的表達，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Foxp3是初始T細胞向Treg細胞分化的關鍵轉錄因子，為Treg細胞分化和功能發(fā)揮所必須。Foxp3+分子表達不穩(wěn)定階段的調節(jié)性T細胞可以向Th1細胞、Th2細胞及Th17細胞等炎性細胞轉化。如圖8所示，模型組大鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞表達比例明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；砂仁揮發(fā)油能不同程度的提高大鼠脾臟中Foxp3+的表達比例(P<0.01或P<0.05)，提示砂仁揮發(fā)油具有調節(jié)T細胞表達，維持機體免疫平衡的作用。

1.4.8砂仁對大鼠腸道微生物調節(jié)作用

腸道菌群結構的改變是炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，菌群失調可造成腸粘膜的屏障功能減退，機體免疫防御能力降低，進而引發(fā)腸道炎癥。大量文獻表明砂仁可有效幫助機體腸道菌群多樣性的恢復，減少服用抗生素給腸道菌群帶來的不良影響；抑制金黃色葡萄球菌和糞腸球菌活性；抑制與腹瀉相關的結腸類耶爾森菌和摩根變形桿菌的生長繁殖，且對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、葡萄球菌及肺炎克雷伯菌也有明顯的抑制作用。

由此，我們推測砂仁對炎癥性腸病大鼠腸道生態(tài)系統(tǒng)多樣性有一定調節(jié)作用，可能與其維持腸道固有菌厚壁菌門、擬桿菌門的正常生理功能，抑制變形菌門數(shù)量有關。

實施例3砂仁揮發(fā)油芳香水劑的制備

取實施例1制備的砂仁揮發(fā)油2ml，加滑石粉10g，置于研缽中研勻，移至細口瓶中，加入蒸餾水，使其混合均勻，濾過至澄明，再由濾器上添加適量蒸餾水，即得。

實施例4砂仁揮發(fā)油合劑的制備

取實施例1制備的砂仁揮發(fā)油5ml，加飴糖50g，加入苯甲酸鈉適量，再加入蒸餾水，攪勻，即得。

實施例5砂仁揮發(fā)油軟膠囊劑的制備

取實施例1制備的砂仁揮發(fā)油80ml，加入1.5倍量的玉米油，將其攪拌均勻，過膠體磨，壓制成軟膠囊，即得。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質技術內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實質技術內(nèi)容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。