本發(fā)明涉及腫瘤光聲成像檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針及其制備。

背景技術(shù)：

光聲成像是一種新興的生物檢測(cè)技術(shù)，因其具有較高的空間分辨率和成像深度，能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)成像，且操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)，在臨床應(yīng)用方面擁有巨大潛力。在光聲成像測(cè)試中，光聲探針的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)成像質(zhì)量起關(guān)鍵性作用，因此對(duì)具有超強(qiáng)光聲信號(hào)的光聲探針的研發(fā)已得到廣泛關(guān)注。根據(jù)來源劃分，光聲探針分為內(nèi)生光聲探針和外生光聲探針，內(nèi)生光聲探針來源于生物體內(nèi)，具有較好的生物相容性和較小的生物毒性，外生光聲探針要求有高于內(nèi)生光聲探針的信號(hào)強(qiáng)度，以獲得較好的成像對(duì)比度。

中國專利201510884853.0公開了一種基于熒光淬滅效應(yīng)實(shí)現(xiàn)復(fù)合探針光聲信號(hào)增強(qiáng)的方法，并據(jù)此方法構(gòu)建了復(fù)合探針并實(shí)現(xiàn)了復(fù)合探針光聲信號(hào)的增強(qiáng)。該探針由氧化石墨烯和熒光染料構(gòu)成。氧化石墨烯作為基底材料既可用于負(fù)載染料，又可以通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)焠滅負(fù)載在其表面的染料的熒光。但是該復(fù)合探針的生物相容性較差，生物毒性較高，很容易在生物組織中積聚而造成損傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針及其制備。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針，由十二氨修飾的金納米球，和包裹所述金納米球的雞卵清蛋白分子復(fù)合而成，其中，金納米球和雞卵清蛋白分子的質(zhì)量比為0.1～10:1。

優(yōu)選的，該復(fù)合納米光聲探針呈球狀的復(fù)合納米顆粒，其粒徑為20-300nm。

優(yōu)選的，所述的金納米球的粒徑為2-10nm。更優(yōu)選的，金納米球的粒徑約為5nm左右。

優(yōu)選的，所述的金納米球通過以下步驟制成：

(a)取四辛基溴化氨和十二氨溶解于甲苯中，再加入氯金酸水溶液，混合均勻；

(b)繼續(xù)加入冰冷的硼氫化鈉，劇烈攪拌；

(c)最后加入不良溶劑乙醇，收集沉淀得到所述十二氨修飾的金納米球。

更優(yōu)選的，四辛基溴化氨、十二氨、甲苯、氯金酸、硼氫化鈉和乙醇的加入量之比為(0.02-0.03)mmol：(0.04-0.08)mmol：(0.3-0.8)ml：(0.04-0.06)mmol：(0.1-0.3)mmol：(2-5)ml。

優(yōu)選的，步驟(b)中：劇烈攪拌的時(shí)間為20-40min。

易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)取十二氨修飾的金納米球溶于四氫呋喃溶劑中，制得金納米球溶液；

(2)取雞卵清蛋白分子置于mes(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸)溶液中，配置成雞卵清蛋白分子溶液；

(3)將金納米球溶液逐滴加入雞卵清蛋白分子溶液中，攪拌，再進(jìn)行超聲反應(yīng)，即得到所述金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針。

優(yōu)選的，步驟(1)中，金納米球溶液的濃度為0.1-1mg/ml。

優(yōu)選的，步驟(2)中，雞卵清蛋白分子溶液的濃度為0.1-2mg/ml，其中，mes溶液的ph值為6。

優(yōu)選的，步驟(3)中，攪拌的時(shí)間為0.5-6h，攪拌速度為200-600rpm；

超聲反應(yīng)的工藝條件為：在冰水浴中反應(yīng)5-30min，其中，超聲功率100-600w，工作時(shí)間1-20s，超聲間隙3-10s。

本發(fā)明的復(fù)合納米光聲探針采用雞卵清蛋白分子和金納米球復(fù)合制得，其中，雞卵清蛋白是雞卵蛋白的主要成分，其安全無毒，來源簡(jiǎn)單易得，成本低，經(jīng)濟(jì)效益高，同時(shí)，雞卵清蛋白具有良好的水溶性與生物相容性，可作為治療性和檢測(cè)性納米藥物的良好載體。而本發(fā)明制得的金納米球在530nm波長(zhǎng)具有良好的光學(xué)吸收，吸收峰較寬，用短脈沖激光照射吸收體時(shí)，吸收體中的分子吸收光子后，其電子從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)而處于激發(fā)態(tài)，而處于激發(fā)態(tài)的極不穩(wěn)定的電子從高能級(jí)向低能級(jí)躍遷時(shí)，會(huì)以光或熱量的形式釋放能量，釋放的熱量導(dǎo)致吸收體局部溫度升高，溫度升高后導(dǎo)致熱膨脹從而產(chǎn)生壓力波，即光聲信號(hào)，可用于腫瘤的光聲檢測(cè)。金納米顆粒生物惰性高，形狀及尺寸可調(diào)，但是，較大尺寸的金納米球易在生物內(nèi)臟器官中堆積，產(chǎn)生生物毒性，而5nm左右小尺寸的金納米球可通過腎臟代謝，避免堆積造成的損傷。本發(fā)明通過使用雞卵清蛋白作為載體，包裹5nm的金納米球，制備得到一種易代謝的20-300nm的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲針。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明復(fù)合納米光聲探針在600-950nm脈沖光波輻照下，具有光聲效應(yīng)。雞卵清蛋白分子中含有巰基，易與金納米球表面的原子以au-s鍵緊密結(jié)合，形成20-300nm粒徑的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，有利于其在體內(nèi)循環(huán)，并安全有效到達(dá)腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)光聲成像功能。由于腫瘤微環(huán)境中谷胱甘肽的含量較高，該金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針可在腫瘤組織中被還原，釋放金納米球，而5nm級(jí)別的小尺寸金納米球可在體內(nèi)循環(huán)中通過腎臟代謝，避免在生物組織中積聚以及造成損傷。

附圖說明

圖1為金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的透射電子顯微鏡照片；

圖2為金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的水合粒徑分布圖；

圖3為濃度為1mg/ml、0.5mg/ml的復(fù)合光聲探針?biāo)芤哼M(jìn)行光聲成像測(cè)試結(jié)果，其中，左圖為不同的復(fù)合光聲探針?biāo)芤涸?80-960nm連續(xù)脈沖激光照射下光聲信號(hào)平均值的曲線，右圖為相應(yīng)的光聲成像照片；

圖4為納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的透射電子顯微鏡照片；

圖5為金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的水合粒徑分布圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施案例中所述的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)試劑，如無特別說明，均采用該領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)試劑均為常規(guī)試劑。

實(shí)施例1

一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的制備，包括以下步驟：

(1)使用ph為6的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(簡(jiǎn)稱mes)溶液，將雞卵清蛋白分子配制成0.5mg/ml的溶液，攪拌均勻。

(2)將1ml濃度為1mg/ml的金納米球溶液逐滴緩慢加入步驟(1)中2ml的雞卵清蛋白溶液中，攪拌1h，攪拌速度為450rpm。金納米球具體通過以下方法制成：將0.025mmol的四辛基溴化氨和0.06mmol的十二氨溶解于0.5ml的甲苯，再加入0.053mmol的氯金酸水溶液(濃度為0.5m)，混合均勻，然后加入0.2mmol冰冷的硼氫化鈉，劇烈攪拌半小時(shí)，最后加入4ml的不良溶劑乙醇，收集沉淀得到尺寸約為5nm的十二氨修飾的金納米球。金納米球溶解于水溶性和油溶性懼佳的四氫呋喃溶劑中，配制濃度為0.1-1mg/ml的金納米球溶液，溶液為酒紅色。

(3)將步驟(2)中的混合溶液放入探針式超聲儀，超聲反應(yīng)20min(超聲功率400w，工作時(shí)間10s，超聲間隙5s)，最終制得金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的混合體系。超聲過程中，溶液放置于冰水浴，以防超聲導(dǎo)致溶液升溫。

(4)將步驟(3)的混合體系經(jīng)8小時(shí)透析，得到純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針。

(5)冷凍干燥步驟(4)的純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針，得到粉末狀的金納米球/雞卵清蛋白的復(fù)合納米光聲探針。

所制備得到的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的測(cè)試和表征如下：圖1為金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的透射電子顯微鏡照片，結(jié)構(gòu)為5nm金納米球被緊湊的包裹在雞卵清蛋白中，形成球狀的復(fù)合納米顆粒，尺寸為20-100nm。圖2為為金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的水合粒徑分布圖，其水合粒徑約為30-100nm。由于不同測(cè)試制樣方法的差異，場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡照片顯示的干態(tài)的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針粒徑小于水合粒徑。

表一列出了不同納米粒子的電位值，具體為1mg/ml的5nm金納米球的四氫呋喃溶液溶于十倍的水中的電位值為44.7mv，雞卵清蛋白納米粒子的mes溶液(ph值為6)的電位值為-24.6mv，金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的電位值為-33.5mv。在2.4w的650nm光的照射下，1mg/ml金納米球/雞卵清蛋白納米光聲探針?biāo)芤簭?0℃升溫至38.8℃。

表一

對(duì)金納米球/雞卵清蛋白納米復(fù)合光聲探針?biāo)芤哼M(jìn)行光聲成像測(cè)試，圖3為濃度為1mg/ml和0.5mg/ml的復(fù)合光聲探針?biāo)芤哼M(jìn)行光聲成像測(cè)試結(jié)果，其中左圖分別為1mg/ml和0.5mg/ml的復(fù)合光聲探針?biāo)芤涸?80-960nm連續(xù)脈沖激光照射下光聲信號(hào)平均值的曲線，右圖為相應(yīng)的光聲成像照片，在選定的0.220mm²面積范圍內(nèi)，兩種濃度的復(fù)合光聲探針的平均光聲信號(hào)對(duì)比值分別為0.833和0.571。

實(shí)施例2

一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的制備，包括以下步驟：

(1)使用ph為6的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(簡(jiǎn)稱mes)溶液，將雞卵清蛋白分子配制成0.5mg/ml的溶液，攪拌均勻。

(2)將0.2ml濃度為0.5mg/ml的金納米球溶液(制備方法同實(shí)施例1)逐滴緩慢加入步驟(1)中2ml的雞卵清蛋白溶液中，攪拌2h，攪拌速度為450rpm。

(3)將步驟(2)中的混合溶液放入探針式超聲儀，超聲反應(yīng)20min(超聲功率400w，工作時(shí)間10s，超聲間隙5s)，最終制得金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的混合體系。超聲過程中，溶液放置于冰水浴，以防超聲導(dǎo)致溶液升溫。

(4)將步驟(3)的混合體系經(jīng)8小時(shí)透析，得到純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針。

(5)冷凍干燥步驟(4)的純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針，得到粉末狀的金納米球/雞卵清蛋白的復(fù)合納米光聲探針。

所制備得到的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的測(cè)試和表征如下：圖4為金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的透射電子顯微鏡照片，結(jié)構(gòu)為5nm金納米球被緊湊的包裹在雞卵清蛋白中，形成球狀的復(fù)合納米顆粒，尺寸為30-100nm。圖5為為金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的水合粒徑分布圖，其水合粒徑約為50-150nm。由于不同測(cè)試制樣方法的差異，場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡照片顯示的干態(tài)的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針粒徑小于水合粒徑。

實(shí)施例3

一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的制備，包括以下步驟：

(1)使用ph為6的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(簡(jiǎn)稱mes)溶液，將雞卵清蛋白分子配制成0.1mg/ml的溶液，攪拌均勻。

(2)將2ml濃度為1mg/ml的金納米球溶液(制備方法同實(shí)施例1)逐滴緩慢加入步驟(1)中2ml的雞卵清蛋白溶液中，攪拌0.5h，攪拌速度為200rpm。

(3)將步驟(2)中的混合溶液放入探針式超聲儀，超聲反應(yīng)5min(超聲功率100w，工作時(shí)間20s，超聲間隙3s)，最終制得金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的混合體系。超聲過程中，溶液放置于冰水浴，以防超聲導(dǎo)致溶液升溫。

(4)將步驟(3)的混合體系經(jīng)8小時(shí)透析，得到純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針。

(5)冷凍干燥步驟(4)的純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針，得到粉末狀的金納米球/雞卵清蛋白的復(fù)合納米光聲探針。

實(shí)施例4

一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的制備，包括以下步驟：

(1)使用ph為6的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(簡(jiǎn)稱mes)溶液，將雞卵清蛋白分子配制成1mg/ml的溶液，攪拌均勻。

(2)將1ml濃度為0.1mg/ml的金納米球溶液(制備方法同實(shí)施例1)逐滴緩慢加入步驟(1)中1ml的雞卵清蛋白溶液中，攪拌6h，攪拌速度為600pm。

(3)將步驟(2)中的混合溶液放入探針式超聲儀，超聲反應(yīng)30min(超聲功率600w，工作時(shí)間6s，超聲間隙3s)，最終制得金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的混合體系。超聲過程中，溶液放置于冰水浴，以防超聲導(dǎo)致溶液升溫。

(4)將步驟(3)的混合體系經(jīng)8小時(shí)透析，得到純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針。

(5)冷凍干燥步驟(4)的純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針，得到粉末狀的金納米球/雞卵清蛋白的復(fù)合納米光聲探針。

實(shí)施例5

一種易代謝的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的制備，包括以下步驟：

(1)使用ph為6的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸(簡(jiǎn)稱mes)溶液，將雞卵清蛋白分子配制成2mg/ml的溶液，攪拌均勻。

(2)將1ml濃度為0.5mg/ml的金納米球溶液(制備方法同實(shí)施例1)逐滴緩慢加入步驟(1)中1ml的雞卵清蛋白溶液中，攪拌3h，攪拌速度為300pm。

(3)將步驟(2)中的混合溶液放入探針式超聲儀，超聲反應(yīng)15min(超聲功率300w，工作時(shí)間12s，超聲間隙2s)，最終制得金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針的混合體系。超聲過程中，溶液放置于冰水浴，以防超聲導(dǎo)致溶液升溫。

(4)將步驟(3)的混合體系經(jīng)8小時(shí)透析，得到純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針。

(5)冷凍干燥步驟(4)的純化的金納米球/雞卵清蛋白復(fù)合納米光聲探針，得到粉末狀的金納米球/雞卵清蛋白的復(fù)合納米光聲探針。

實(shí)施例6

與實(shí)施例1相比，絕大部分都一樣，除了本實(shí)施例的金納米球溶液改為按以下方法制備：

將0.02mmol的四辛基溴化氨和0.04mmol的十二氨溶解于0.3ml的甲苯，再加入0.04mmol的氯金酸水溶液(濃度為0.5m)，混合均勻，然后加入0.1mmol冰冷的硼氫化鈉，劇烈攪拌半小時(shí)，最后加入2ml的不良溶劑乙醇，收集沉淀得到尺寸約為5nm的十二氨修飾的金納米球。將金納米球溶解于水溶性和油溶性懼佳的四氫呋喃溶劑中，配制濃度為0.1-1mg/ml的金納米球溶液，溶液為酒紅色。

實(shí)施例7

與實(shí)施例1相比，絕大部分都一樣，除了本實(shí)施例的金納米球溶液改為按以下方法制備：

將0.03mmol的四辛基溴化氨和0.08mmol的十二氨溶解于0.8ml的甲苯，再加入0.06mmol的氯金酸水溶液(濃度為0.5m)，混合均勻，然后加入0.3mmol冰冷的硼氫化鈉，劇烈攪拌半小時(shí)，最后加入5ml的不良溶劑乙醇，收集沉淀得到尺寸約為5nm的十二氨修飾的金納米球。將金納米球溶解于水溶性和油溶性懼佳的四氫呋喃溶劑中，配制濃度為0.1-1mg/ml的金納米球溶液，溶液為酒紅色。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。