本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
對于大面積燒傷或者創(chuàng)傷的病人來說，皮膚移植是最好的治療方法，但是對于燒傷面積特別巨大的創(chuàng)面采用自體全厚皮移植幾乎不可能，而自體微粒皮或薄皮片移植需要真皮支架。來源于人的尸體皮制作的無細胞真皮作為真皮替代物最為理想，但是由于倫理和hiv等病毒的原因，大大限制了其應(yīng)用。目前，根據(jù)實踐和臨床的使用證實脫細胞真皮基質(zhì)是一種新型的創(chuàng)傷修復(fù)材料，其應(yīng)用領(lǐng)域從最初的深度燒傷創(chuàng)面的治療逐漸擴展到整形、美容、口腔、耳鼻喉、普外科等領(lǐng)域。
脫細胞真皮基質(zhì)制備的目的是盡可能的去除皮膚組織中免疫原性很強的細胞成分（表皮細胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中的血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等），保留免疫原性較弱的細胞外基質(zhì)成分以及真皮組織完整的三維空間結(jié)構(gòu)。這樣能提供引導(dǎo)組織再生的生物支架，達到最大限度修復(fù)組織缺損的目的。目前脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法主要有一下幾種：1、dispaseii-triton法：該方法細胞脫除徹底，但是對基底膜破壞大，不利于上皮細胞的粘附與生長；2、高滲鹽-sds法：該方法基底膜保留完整，但真皮中纖維結(jié)合素、彈力素等含量較高，因此可能會有較高的免疫原性；3、高滲鹽-氫氧化鈉銷蝕法：該方法利用高滲鹽去除表皮，同時利用氫氧化鈉中堿離子的吸水作用，奪去組織細胞中的水分，使細胞脫水，該方法膠原纖維結(jié)構(gòu)完整，排列較正常疏松，但是對于細胞的去除效果仍有待提高；4、反復(fù)凍融法，由于全部都是物理操作過程，時間久、周期長，現(xiàn)在基本已經(jīng)不用。
以上方法中，作用手段單一，處理時間過短，無法將免疫原性物質(zhì)全面清除，如果作用時間過長，又會造成基底膜破壞，并有可能造成完整細胞骨架的缺失。同時，人工物理手法去除豬毛，費時費力，占用生產(chǎn)者大量工時。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，既能夠有效降低真皮基質(zhì)的免疫原性，又保留了真皮基質(zhì)正常的膠原結(jié)構(gòu)，同時使用無毒化學(xué)試劑，有效去除動物毛發(fā)，處理過程省時省力，節(jié)約生產(chǎn)成本，又不會造成環(huán)境污染。
同時，本發(fā)明還在于提供一種采用本發(fā)明制備方法制備的醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下操作步驟：
1）將新鮮動物皮膚去肉后，依次進行消毒、清洗、高滲鹽處理，撕去表皮，得待處理真皮皮片；
2）將步驟1）制得的真皮皮片放入堿液和過氧化氫的混合溶液中浸泡3~24小時；
3）將步驟2）處理后的真皮皮片進行裁切、剖片后浸泡在含有胰蛋白酶的溶液中，在35~40℃溫度下，ph7~9，浸泡1~12小時；
4）將步驟3）處理后的真皮皮片清洗后，冷凍存放，即完成。
步驟1）中所述動物皮膚為豬皮、羊皮或牛皮。
上述制備方法還包括將步驟3）處理后的真皮皮片浸泡在交聯(lián)劑中進行室溫交聯(lián)1~24小時。酶消化后進行交聯(lián)處理，避免膠原蛋白在胰蛋白酶溶液中降解過度，造成的膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和排列方式的損壞，確保真皮基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，在降低產(chǎn)品的硬度，使產(chǎn)品更加柔軟貼合皮膚的同時，使產(chǎn)品具有一定的抗張強度，滿足醫(yī)用敷料的要求。而且交聯(lián)劑的使用還會進一步的封閉抗原，減少免疫反應(yīng)，還可以提高產(chǎn)品的收縮溫度。
可選的，所使用的交聯(lián)劑的配制方法是將碳化二亞胺鹽酸鹽和琥珀酰亞胺加入到含有體積百分含量為40%的乙醇水溶液中，ph5.5，攪拌均勻。
可選的，所使用的交聯(lián)劑中各組分的質(zhì)量濃度為：碳化二亞胺鹽酸鹽為0.15%-2.0%，琥珀酰亞胺濃度為0.05%-0.5%。
優(yōu)選的，所使用的交聯(lián)劑中各組分的質(zhì)量濃度為：碳化二亞胺為0.5%，琥珀酰亞胺為0.2%。
可選的，步驟2）中混合溶液中堿的濃度為2~6%；過氧化氫的濃度為0.5~5%。
可選的，所述堿為氫氧化鈉和/或氫氧化鉀。
為了確保堿液和過氧化氫溶液對真皮皮片上的毛發(fā)的去除效果，以及對皮片中蛋白纖維的膨脹疏松效果，同時避免對皮片膠原空間結(jié)構(gòu)和排列方式的破壞，優(yōu)選的，步驟2）中混合溶液中氫氧化鈉的濃度為4%，過氧化氫的濃度為2%，在混合溶液中的浸泡時間為18小時。
可選的，步驟3）中胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的濃度為0.05~0.5%。
可選的，所述胰蛋白酶為醫(yī)藥級胰蛋白酶。
為了在確保胰蛋白酶對多余的脂肪和免疫活性雜蛋白進行消解的同時，避免胰蛋白酶對皮片中膠原蛋白空間結(jié)構(gòu)的破壞，避免膠原蛋白發(fā)生分解或溶解在胰蛋白酶溶液中，進一步優(yōu)選的，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的濃度為0.1%，在胰蛋白酶溶液中的浸泡時間為2小時。
可選的，步驟3）中裁切為將真皮皮片裁切成長*寬*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片。
可選的，步驟1）中消毒的具體方法為：將新鮮動物皮膚去肉后，浸泡入濃度為0.5~1.0%的消毒液中消毒處理30~60分鐘。
可選的，所述消毒液為苯扎溴銨或過氧乙酸。
進一步，優(yōu)選的，所述消毒液為濃度為0.5%的苯扎溴銨，浸泡在消毒液中的處理時間為30分鐘。采用消毒液對皮膚表面進行病毒滅活和殺菌處理。
可選的，步驟1）中所述清洗的具體方法為：采用濃度為0.1~2%的表面活性劑溶液對消毒處理后的動物皮膚清洗2~3次，每次0.5~2小時。通過表面活性劑的作用，去除皮膚表面的油污和脂肪。
可選的，所述表面活性劑為烷基聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸鈉、烷基糖苷中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述表面活性劑為apg1214或apg1216。
進一步優(yōu)選的，所述表面活性劑溶液為濃度為1%的apg1214溶液。
可選的，步驟1）中高滲鹽處理的具體方法為：將待處理動物皮膚浸泡在濃度為0.8~2.0mol/l的氯化鈉溶液中4~24小時。
優(yōu)選的，步驟1）中高滲鹽處理過程中采用的氯化鈉的濃度為1.0mol/l，浸泡時間為24小時。通過高濃度鹽水打斷上皮細胞和結(jié)締組織之間的半橋粒結(jié)構(gòu)。
可選的，步驟4）中所述清洗為采用無菌純水對步驟3）處理后的真皮皮片進行沖洗4~12小時。
可選的，步驟4）中所述的冷凍存放為凍存在-80℃的環(huán)境下。
本發(fā)明醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，通過創(chuàng)造性將堿液和過氧化氫形成混合溶液對高滲鹽處理后的真皮皮片進行處理，在采用堿液使皮片中纖維膨脹和疏松的同時，采用化學(xué)浸泡的方式通過堿液和過氧化氫的協(xié)同作用直接去除毛發(fā)，省去人工去除毛發(fā)的過程，簡化工藝流程，提升生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本，同時使用的試劑無毒，不會造成環(huán)境污染；
同時，本發(fā)明制備方法在堿液和過氧化氫對皮片進行去毛和纖維膨脹、疏松處理后，再進行胰蛋白酶消化處理，進一步去除多余的脂肪和具有免疫活性的雜蛋白，去除皮片中殘留的細胞，同時通過酶消化后進行交聯(lián)處理，避免膠原蛋白在胰蛋白酶溶液中降解過度，造成的膠原蛋白空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和排列方式的損壞，確保真皮基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，在降低產(chǎn)品的硬度，使產(chǎn)品更加柔軟貼合皮膚的同時，使產(chǎn)品具有一定的抗張強度，滿足醫(yī)用敷料的要求。而且交聯(lián)劑的使用還會進一步的封閉抗原，減少免疫反應(yīng)，還可以提高產(chǎn)品的收縮溫度。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
實施例1
一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下操作步驟：
1）將新鮮豬皮皮膚去肉后，浸泡入濃度為0.5%的苯扎溴銨溶液中消毒處理30分鐘；
2）將步驟1）消毒處理后的動物皮膚浸泡入濃度為1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小時；
3）將步驟2）清洗后的動物皮膚浸泡入濃度為1mol/l的氯化鈉溶液中，浸泡24小時，打斷上皮細胞和結(jié)締組織之間的半橋粒，撕去表皮，得待處理真皮皮片；
4）將步驟3）制得的待處理真皮皮片放入含有4%的氫氧化鈉和2%過氧化氫的混合溶液中，浸泡18小時；
5）將步驟4）處理后的真皮皮片裁切成長*寬*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）將步驟5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃溫度下，ph7~9，浸泡2小時；
7）將碳化二亞胺鹽酸鹽和琥珀酰亞胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，攪拌均勻，得含有0.5%的碳化二亞胺和0.1%的琥珀酰亞胺的交聯(lián)劑溶液，然后將步驟6）處理后的皮片浸泡在交聯(lián)劑溶液中，室溫交聯(lián)處理6小時；
8）將步驟7）處理后的皮片采用無菌純水沖洗7小時后，排放整齊，凍存在-80℃的冰箱中。
實施例2
一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下操作步驟：
1）將新鮮豬皮皮膚去肉后，浸泡入濃度為0.8%的過氧乙酸溶液中消毒處理45分鐘；
2）將步驟1）消毒處理后的動物皮膚浸泡入濃度為0.1%的apg1216溶液中，清洗3次，每次清洗1小時；
3）將步驟2）清洗后的動物皮膚浸泡入濃度為0.8mol/l的氯化鈉溶液中，浸泡12小時，打斷上皮細胞和結(jié)締組織之間的半橋粒，撕去表皮，得待處理真皮皮片；
4）將步驟3）制得的待處理真皮皮片放入含有2%的氫氧化鈉和0.5%過氧化氫的混合溶液中，浸泡24小時；
5）將步驟4）處理后的真皮皮片裁切成長*寬*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）將步驟5）裁切后的皮片浸泡在含有0.05%胰蛋白酶的溶液中，在40℃溫度下，ph7~9，浸泡12小時；
7）將碳化二亞胺鹽酸鹽和琥珀酰亞胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，攪拌均勻，得含有0.15%的碳化二亞胺和0.05%的琥珀酰亞胺的交聯(lián)劑溶液，然后將步驟6）處理后的皮片浸泡在交聯(lián)劑溶液中，室溫交聯(lián)處理24小時；
8）將步驟6）處理后的皮片采用無菌純水沖洗12小時后，排放整齊，凍存在-80℃的冰箱中。
實施例3
一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下操作步驟：
1）將新鮮豬皮皮膚去肉后，浸泡入濃度為1.0%的苯扎溴銨溶液中消毒處理60分鐘；
2）將步驟1）消毒處理后的動物皮膚浸泡入濃度為2.0%的十二烷基硫酸鈉溶液中，清洗2次，每次清洗0.5小時；
3）將步驟2）清洗后的動物皮膚浸泡入濃度為2.0mol/l的氯化鈉溶液中，浸泡4小時，打斷上皮細胞和結(jié)締組織之間的半橋粒，撕去表皮，得待處理真皮皮片；
4）將步驟3）制得的待處理真皮皮片放入含有6%的氫氧化鉀和5%過氧化氫的混合溶液中，浸泡3小時；
5）將步驟4）處理后的真皮皮片裁切成長*寬*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）將步驟5）裁切后的皮片浸泡在含有0.5%胰蛋白酶的溶液中，在35℃溫度下，ph7~9，浸泡1小時；
7）將碳化二亞胺鹽酸鹽和琥珀酰亞胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，攪拌均勻，得含有2.0%的碳化二亞胺和0.5%的琥珀酰亞胺的交聯(lián)劑溶液，然后將步驟6）處理后的皮片浸泡在交聯(lián)劑溶液中，室溫交聯(lián)處理1小時；
8）將步驟6）處理后的皮片采用無菌純水沖洗4小時后，排放整齊，凍存在-80℃的冰箱中。
對上述實施例1~3制備的真皮基質(zhì)的使用性能進行檢測，結(jié)果顯示，實施例1~3制備的真皮基質(zhì)在自然干燥后，質(zhì)地柔軟，能夠很好的與皮膚貼合，抗張強度高，在人工徒手拉扯過程中不易斷裂，能夠很好的滿足臨床的使用要求。
對比例1
一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下操作步驟：
1）將新鮮豬皮皮膚去肉后，浸泡入濃度為0.5%的苯扎溴銨溶液中消毒處理30分鐘；
2）將步驟1）消毒處理后的動物皮膚浸泡入濃度為1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小時；
3）將步驟2）清洗后的動物皮膚浸泡入含有4%的氫氧化鈉和2%過氧化氫的混合溶液中，浸泡12小時；
4）將步驟3）清洗后的動物皮膚浸泡入濃度為1mol/l的氯化鈉溶液中，浸泡24小時，打斷上皮細胞和結(jié)締組織之間的半橋粒，撕去表皮，得待處理真皮皮片；
5）將步驟4）制得的待處理真皮皮片放入含有4%的氫氧化鈉的堿液中，浸泡12小時；
5）將步驟4）處理后的真皮皮片裁切成長*寬*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）將步驟5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃溫度下，ph7~9，浸泡2小時；
7）將碳化二亞胺鹽酸鹽和琥珀酰亞胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，攪拌均勻，得含有0.5%的碳化二亞胺和0.1%的琥珀酰亞胺的交聯(lián)劑溶液，然后將步驟6）處理后的皮片浸泡在交聯(lián)劑溶液中，室溫交聯(lián)處理6小時；
8）將步驟7）處理后的皮片采用無菌純水沖洗7小時后，排放整齊，凍存在-80℃的冰箱中。
本對比例相比實施例1在高滲鹽處理前將皮膚浸泡在堿液和過氧化氫組成的混合溶液中，觀察結(jié)果顯示，這種操作方式不能很好的去除毛發(fā)，尤其是真皮毛孔中殘留的毛發(fā)，需要另外進行人工去除毛發(fā)的過程。
對比例2
一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下操作步驟：
1）將新鮮豬皮皮膚去肉后，浸泡入濃度為0.5%的苯扎溴銨溶液中消毒處理30分鐘；
2）將步驟1）消毒處理后的動物皮膚浸泡入濃度為1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小時；
3）將步驟2）清洗后的動物皮膚浸泡入濃度為1mol/l的氯化鈉溶液中，浸泡24小時，打斷上皮細胞和結(jié)締組織之間的半橋粒，撕去表皮，得待處理真皮皮片；
4）將步驟3）制得的待處理真皮皮片放入含有4%的氫氧化鈉的堿液中浸泡12小時后，再在2%過氧化氫溶液中，浸泡12小時；
5）將步驟4）處理后的真皮皮片裁切成長*寬*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）將步驟5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃溫度下，ph7~9，浸泡2小時；
7）將碳化二亞胺鹽酸鹽和琥珀酰亞胺加入到含有40%（v/v）乙醇的水溶液中，ph5.5，攪拌均勻，得含有0.5%的碳化二亞胺和0.1%的琥珀酰亞胺的交聯(lián)劑溶液，然后將步驟6）處理后的皮片浸泡在交聯(lián)劑溶液中，室溫交聯(lián)處理6小時；
8）將步驟7）處理后的皮片采用無菌純水沖洗7小時后，排放整齊，凍存在-80℃的冰箱中。
本對比例與實施例1不同的是，將高滲鹽處理后的真皮皮片分別浸泡在堿液中進行膨脹疏松處理之后，再浸泡在過氧化氫溶液中，觀察結(jié)果顯示，這種操作方式不能很好的去除毛發(fā)，需要進行額外的人工去毛發(fā)的操作步驟。
對比例3
一種醫(yī)用脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下操作步驟：
1）將新鮮豬皮皮膚去肉后，浸泡入濃度為0.5%的苯扎溴銨溶液中消毒處理30分鐘；
2）將步驟1）消毒處理后的動物皮膚浸泡入濃度為1%的apg1214溶液中，清洗3次，每次清洗2小時；
3）將步驟2）清洗后的動物皮膚浸泡入濃度為1mol/l的氯化鈉溶液中，浸泡24小時，打斷上皮細胞和結(jié)締組織之間的半橋粒，撕去表皮，得待處理真皮皮片；
4）將步驟3）制得的待處理真皮皮片放入含有4%的氫氧化鈉和2%過氧化氫的混合溶液中，浸泡18小時；
5）將步驟4）處理后的真皮皮片裁切成長*寬*厚=10cm~80cm*10cm~80cm*0.2mm~1.0mm大小的皮片；
6）將步驟5）裁切后的皮片浸泡在含有0.1%胰蛋白酶的溶液中，在37℃溫度下，ph7~9，浸泡2小時；
7）將步驟6）處理后的皮片采用無菌純水沖洗7小時后，排放整齊，凍存在-80℃的冰箱中。
本對比例與實施例1的區(qū)別在于，本對比例制備方法中酶消化處理后未進行交聯(lián)處理，比較兩種產(chǎn)品性能的結(jié)果顯示，本對比例制備的產(chǎn)品抗張強度低，很容易扯斷，無法正常滿足臨床的需要，產(chǎn)品自然干燥后會變硬，使用過程中也會給患者帶來不舒服的感覺。