本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，具體涉及一種人參來(lái)源的納米顆粒在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤微環(huán)境(tumormicroenvironment)是指在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞、免疫和炎性細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，以及一些血管內(nèi)皮細(xì)胞等)和細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤有著重要的支持和促進(jìn)作用。如何能夠干預(yù)、改善腫瘤微環(huán)境，是防止腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的核心問(wèn)題。

近年來(lái)研究表明，腫瘤微環(huán)境中生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞——腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associatedmacrophages，tam)是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，在腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段中起關(guān)鍵作用。！

巨噬細(xì)胞(macrophage，)是機(jī)體的重要的免疫細(xì)胞之一，在宿主的免疫防御及維護(hù)組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。根據(jù)功能特征，巨噬細(xì)胞主要被活化為2個(gè)亞型：經(jīng)典活化的m1型(classicallyactivatedmacrophage)及替代活化的m2型(alternativelyactivatedmacrophage)。m1型受到th1分泌的細(xì)胞因子，如干擾素-γ(interferon-γ，inf-γ)、細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，lps)及toll樣受體(toll-likereceptor，tlr)的調(diào)控，其特征是可分泌包括il-6、il-12、il-23及腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)等在內(nèi)的促炎性因子。此外，m1型巨噬細(xì)胞還高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibilitycomplex)ⅰ類及ⅱ類分子進(jìn)行有效地抗原提呈。因此，m1型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是具有殺傷細(xì)菌及腫瘤細(xì)胞并可分泌多種促炎性細(xì)胞因子的細(xì)胞。而m2型巨噬細(xì)胞與m1型的作用截然相反，其被認(rèn)識(shí)是一種具有促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移作用的細(xì)胞。絕大多數(shù)的tam都屬于m2型巨噬細(xì)胞，是人和小鼠最主要的腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞。在腫瘤早期侵襲、轉(zhuǎn)移階段，腫瘤細(xì)胞釋放趨化因子招募巨噬細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞到達(dá)腫瘤周圍的基質(zhì)區(qū)域，隨后tam可穿透基底膜，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫基底膜的束縛到達(dá)周圍正常組織基質(zhì)，同時(shí)tam和腫瘤細(xì)胞均可刺激血管生成，提高細(xì)胞的侵襲性和運(yùn)動(dòng)性^[11]。tam還可以通過(guò)釋放血管生成調(diào)節(jié)酶類，如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloprotein2,mmp2)、mmp-9、mmp-12和,環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2,cox2)等，促進(jìn)血管生成，為腫瘤生長(zhǎng)輸送養(yǎng)分。此外，tam還可釋放一系列促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,begf)等。

基于tam在腫瘤微環(huán)境中的重要作用，如何發(fā)揮巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和可塑性，促使tam向m1型極化，從而改善腫瘤微環(huán)境，可能成為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。

人參是我國(guó)最重要的中藥材之一，被譽(yù)為“百草之王”，有非常高的藥用價(jià)值。人參所產(chǎn)生的納米顆粒級(jí)微泡攜帶有多種人參的有效成分，可能是其發(fā)揮藥效的重要途徑之一?；谌藚㈤_發(fā)有抗腫瘤功能的新型藥物尚未得到有效的開發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可量化生產(chǎn)的人參來(lái)源的納米顆粒(英文名：ginsengderivednano-particles，簡(jiǎn)稱gdnps)，將之應(yīng)用于制備治療腫瘤的藥物。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種人參來(lái)源的納米顆粒在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

所述治療腫瘤的方法為逆極化腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞。

所述逆極化腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞的方法為：下調(diào)m2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志分子及上調(diào)m1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志分子，上調(diào)m1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，改變腫瘤微環(huán)境中m1/m2型巨噬細(xì)胞的比例，從而改善腫瘤微環(huán)境，殺傷腫瘤。

所述m2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志分子為白細(xì)胞分化抗原206(cd206)；所述m1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志分子為toll樣受體2/4(tlr2/4)、白細(xì)胞分化抗原80(cd80)、白細(xì)胞分化抗原86(cd86)、主要組織復(fù)合體2(mhc-ii)中的一種或多種；所述m2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因?yàn)榫彼崦?(arg-1)、白細(xì)胞分化抗原206又稱巨噬細(xì)胞甘露糖受體(cd206)、白細(xì)胞介素10(il-10)、類幾丁質(zhì)酶3樣分子(chi313)中的一種或多種；所述m1型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因?yàn)榘准?xì)胞介素6(il-6)、腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白細(xì)胞分化抗原80(cd80)、趨化因子9(cxcl9)、趨化因子3(ccl3)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inos)等中的一種或多種；所述m1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的免疫活性細(xì)胞因子為腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白細(xì)胞介素6(il-6)中的一種或多種。

所述人參來(lái)源的納米顆粒，具有膜結(jié)構(gòu)，粒徑范圍為150-500nm，峰值粒徑為280～350nm。

所述人參來(lái)源的納米顆粒通過(guò)如下步驟制備：

(1)將新鮮、洗凈的人參通過(guò)低速螺旋擠壓榨出原漿；

(2)將步驟(1)中所得原漿通過(guò)篩網(wǎng)過(guò)濾除雜，收集濾液；

(3)將步驟(2)中得到的濾液依次進(jìn)行低速、中速、高速和超速離心，每次離心后棄去沉淀，收集上清液進(jìn)行下一次離心，其中最后一次離心，收集沉淀；

(4)將步驟(3)中所述最后一次離心收集的沉淀用緩沖液重懸后超速離心1次，收集沉淀；所述沉淀用緩沖液再次重懸后高速離心，收集上清液；所述上清液通過(guò)除菌級(jí)濾膜即得人參來(lái)源的納米顆粒。

優(yōu)選的，以上操作在4～25攝氏度環(huán)境中進(jìn)行。

步驟(1)中，所述低速螺旋擠壓的轉(zhuǎn)速為30～60轉(zhuǎn)/分鐘。

步驟(2)中，所述篩網(wǎng)為200～2000目，優(yōu)選為200～1000目。

步驟(3)中，所述低速離心的離心力為100～500×g，離心時(shí)間為5～10分鐘；所述中速離心的離心力為1000～5000×g，離心時(shí)間為10～30分鐘；所述高速離心的離心力為8000～12000×g，離心時(shí)間為30～60分鐘；所述超速離心的離心力為100000～200000×g，離心時(shí)間為60～120分鐘，所述低速、中速、高速和超速離心的次數(shù)為至少1次。

優(yōu)選的，所述低速離心的離心力為200～500×g；所述中速離心的離心力為2000～5000×g；所述高速離心的離心力為100000～12000×g；所述超速離心的離心力為100000～120000×g。

步驟(4)中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述緩沖液的ph范圍為ph7.2～7.4；所述超速離心的離心力為100000～200000×g，離心時(shí)間為60～120分鐘；所述高速離心的離心力為8000～12000×g，離心時(shí)間為30～60分鐘；所述除菌級(jí)濾膜的孔徑為0.45μm。

本發(fā)明所述的人參來(lái)源的納米顆粒材料來(lái)源廣泛，可以是人參、西洋參、三七、黨參、太子參、丹參、玄參；本發(fā)明制備方法，具有易操作、耗時(shí)少等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述的人參來(lái)源的納米顆粒材料制備方法參考申請(qǐng)?zhí)枮?017100944577的專利中的方法制備。

有益效果：本發(fā)明的人參來(lái)源的納米顆粒在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用能夠有效地使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞從促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的m2型向抗腫瘤的m1型極化，同時(shí)上調(diào)m1型相關(guān)的tlr2/4、cd80等多種表面活性分子，并分泌tnf-a、il-6等細(xì)胞因子,從而改善腫瘤微環(huán)境，在開發(fā)用于制備天然抗腫瘤藥物方面有著良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為電鏡觀察gdnps的形態(tài)；

圖2為馬爾文粒徑儀分析的人參來(lái)源的納米顆粒的粒徑大小及分布；

圖3為單核-巨噬細(xì)胞吞噬gdnps；

圖4為gdnps體外下調(diào)m2型巨噬細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志分子，同時(shí)上調(diào)m1型相關(guān)表面標(biāo)志分子；

圖5為gdnps體外下調(diào)m2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)上調(diào)m1型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；

圖6為gdnps體外促使m2型巨噬細(xì)胞分泌tnf-α、il-6等m1型細(xì)胞因子；

圖7為gdnps治療黑色素瘤在體實(shí)驗(yàn)示意圖；

圖8為各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間腫瘤生長(zhǎng)曲線；

圖9為各組小鼠腫瘤最終體積；

圖10為各組小鼠腫瘤最終重量；

圖11為各組小鼠腫瘤最終大小；

圖12為各組小鼠腫瘤組織中巨噬細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例；

圖13各組小鼠腫瘤組織中m1/m2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：人參來(lái)源的納米顆粒的制備

(1)將新鮮人參用清水洗凈，在20℃環(huán)境中通過(guò)低速螺旋擠壓技術(shù)榨出原漿；

(2)將榨出的原漿在20℃環(huán)境中經(jīng)500目篩網(wǎng)過(guò)濾除雜，收集濾液；

(3)將收集的濾液先以200×g，離心10分鐘，棄沉淀，收集上清；再將上清液以2000×g，離心30分鐘，棄沉淀，收集上清；再將上清液以10000×g，離心60分鐘，棄沉淀，收集上清；最后將上清液以120000×g，離心60分鐘，收集沉淀；

(4)將沉淀用ph7.2的磷酸鹽緩沖液重懸后，以120000×g，離心60分鐘，收集沉淀；將沉淀再次用ph7.2的磷酸鹽緩沖液重懸后，以10000×g，離心60分鐘，收集上清液；最后通過(guò)孔徑為0.45μm的除菌級(jí)濾膜后即獲得納米級(jí)顆粒。保存于-20℃～-80℃中。

實(shí)施例2：電鏡觀察gdnps的形態(tài)

將提取好的gdnps120000×g，60分鐘超速離心后使其沉淀并壓縮緊密，棄上清，沉淀用2.5％(v/v)戊二醛固定，送電鏡室進(jìn)行處理，上鏡觀察gdnps的形態(tài)。如圖1所示：電鏡下可見(jiàn)gdnps為具有膜結(jié)構(gòu)的納米顆粒，大小在150-500nm之間，證實(shí)有效募集了人參來(lái)源的納米級(jí)微體。

實(shí)施例3：馬爾文粒徑儀分析的人參來(lái)源的納米顆粒的粒徑大小及分布

將提取好的gdnps通過(guò)馬爾文粒徑儀進(jìn)行粒徑檢測(cè)，如圖2所示，gdnps的峰值均一性較好。

實(shí)施例4：gdnps體外促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞集落的形成以及增殖

1.骨髓來(lái)源的單核-巨噬細(xì)胞(bonemarrowderivedmacrophages，bmdm)的獲取

①脫頸處死c57/bl6小鼠，酒精浸泡5分鐘，固定小鼠后將小鼠后肢前部的皮毛剝置足部，鈍性分離肌肉剪下大腿，放入盛有無(wú)菌pbs的培養(yǎng)皿中。

②鑷子夾住腿骨，用剪刀剔除其余肌肉，在關(guān)節(jié)處剪斷腿骨。

③用1ml注射器吸取培養(yǎng)皿中的pbs，將針頭刺入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓至骨髓變白，將骨髓沖洗液過(guò)濾篩網(wǎng)。

④取小鼠骨髓，裂解紅細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶個(gè)/ml，培養(yǎng)基：dmem(gibco)+10％fbs(gibco)+20ng/mlm-csf(peprotech)。

⑤算第0天取骨髓，第3天，每皿添含20ng/mlm-csf的完全培養(yǎng)基。

⑥5天后，每皿添加20ng/mlm-csf的完全培養(yǎng)基。

⑦7天后，胰酶消化bmdm，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2×10⁶個(gè)細(xì)胞，加入1ml或2ml培養(yǎng)基。

2.bmdm對(duì)gdnps的攝取

①于前一天通過(guò)fitc標(biāo)記的anti-mousef4/80antibody將bmdm染色，并加入帶有爬片的培養(yǎng)皿中，使其貼壁生長(zhǎng)。

②將100ulgdnps用稀釋液稀釋至250ul。

③將1ulpkh26加入250ul稀釋液中，作為染料。

④將稀釋的gdnps加入到染料中，快速混合。

⑤25℃孵育的2-5分鐘，定時(shí)輕輕顛倒離心管保證在25℃充分混勻。

⑥加入等量血清中止染色反應(yīng)孵育1分鐘。

⑦120000×g，60分鐘超速離心。

⑧吸棄上清，將染色的gdnps用100ulpbs重懸。

⑨以20ug/ml的濃度將gdnps加入培養(yǎng)的bmdm中，培養(yǎng)24小時(shí)。

⑩取出爬片，激光共聚焦觀察單核-巨噬細(xì)胞對(duì)gdnps的吞噬。

如圖3所示：f4/80是小鼠單核-巨噬細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志分子，通過(guò)fitc標(biāo)記的anti-mousef4/80antibody使小鼠bmdm帶有綠色熒光，而pkh26是一種紅色的膜染料，能夠與gdnps表面的膜結(jié)合。在激光共聚焦顯微鏡下，可以明顯的觀察到單核-巨噬細(xì)胞胞內(nèi)出現(xiàn)了多個(gè)紅色顆粒，表明單核-巨噬細(xì)胞能夠有效的吞噬gdnps。

實(shí)施例5：gdnps體外下調(diào)m2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子，同時(shí)上調(diào)m1型相關(guān)表面標(biāo)志分子

①通過(guò)m-csf(20ng/ml)誘導(dǎo)獲得c57/bl6小鼠的bmdm，添加il-4(20ng/ml)和il-13(20ng/ml)使其分化為m2型巨噬細(xì)胞。

②加入gdnps(20ug/ml)，72小時(shí)后，吸去培養(yǎng)上清，pbs清洗一遍后胰酶消化細(xì)胞。

③添加培養(yǎng)液終止消化，1200rpm離心收集巨噬細(xì)胞，fc阻斷劑封閉(室溫，20分鐘)。

④分別加入anti-mousecd206、cd80、cd86、tlr2、tlr4、mhc-ii等單克隆抗體染色(室溫，30分鐘)，pbs洗2次。流式細(xì)胞儀鑒定上述分子的表達(dá)情況。

如圖4所示：gdnps能夠顯著的下調(diào)m2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志分子cd206，同時(shí)上調(diào)m1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志分子(cd80、cd86、tlr2、tlr4、mhc-ii等)。從表面分子標(biāo)志的結(jié)果證實(shí)gdnps能夠使m2型巨噬細(xì)胞向m1型極化。

實(shí)施例6：gdnps體外下調(diào)m2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)上調(diào)m1型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄

1.巨噬細(xì)胞總rna的提取

①實(shí)施例3中的部分細(xì)胞，加入1mltrizol，吸入1.5mlep管中，吹打至液體澄清無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊，顛倒混勻10下，室溫放置5分鐘。

②加入200ul氯仿，劇烈震蕩15秒，進(jìn)行rna抽提，室溫放置3分鐘。

③4℃，12000rpm，15分鐘離心。

④吸取上層水相至新的1.5mlep管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘。

⑤4℃，12000rpm，10分鐘離心。

⑥棄上清，加入預(yù)冷的0.5ml的75％乙醇(depc水配)洗滌沉淀，混勻后，4℃，7500rpm，5分鐘離心。

⑦棄上清，室溫下干燥5-10分鐘。

⑧加入20-60ul去離子水溶解rna，吹打混勻，置于56℃水浴鍋中10分鐘。

⑨快速震蕩離心后于酶標(biāo)儀檢測(cè)rna濃度。

2.cdna的合成

①根據(jù)revertraaceqpcrrtkit說(shuō)明書進(jìn)行

②根據(jù)rna濃度調(diào)整，取1ng-5μg總rna作為模板。反應(yīng)體系如下：

③將以上加入無(wú)核酸酶的pcr管中，加入總rna模板適量體積后，剩余加去離子水補(bǔ)足至20ul，所有操作均在冰上進(jìn)行。

④反應(yīng)條件：42℃，15分鐘→85℃，5秒→4℃，∞，反應(yīng)后獲得cdna，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.熒光定量pcr反應(yīng)

①以上述cdna為模板，gapdh為內(nèi)參，參照sybrgreenrealtimepcrmastermix說(shuō)明書操作測(cè)定m1/m2巨噬細(xì)胞相關(guān)基因il-6、tnf-α、cd80、cxcl9、ccl3、inos/arg-1、cd206、il-10、chi313等的mrna的表達(dá)。

②根據(jù)real-timepcr試劑盒的說(shuō)明配制反應(yīng)液：

③反應(yīng)條件：95℃30秒→pcr循環(huán)(x40循環(huán))：95℃，5秒；55℃，10秒退火；72℃，15秒延伸→制備熔解曲線統(tǒng)計(jì)分析

④以gapdh作為內(nèi)參，反應(yīng)完畢后確認(rèn)real-timepcr的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，檢測(cè)各模板的ct值，所有樣品重復(fù)3次，用2-^△△ct法計(jì)算細(xì)胞中mrna水平的相對(duì)表達(dá)量。

如圖5.所示，gdnps能夠降低m2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)上調(diào)m1型細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從m1/m2相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果證實(shí)gdnps使m2型巨噬細(xì)胞向m1型極化。

實(shí)施例7：gdnps體外促使m2型巨噬細(xì)胞分泌tnf-α、il-6等細(xì)胞因子

實(shí)施例3的培養(yǎng)上清中tnf-α、il-6檢測(cè)(elisa法)

①按說(shuō)明書要求稀釋捕獲抗體(anti-mousetnf-α或il-6)，以100ul/孔量包被于96孔板，4℃過(guò)夜。

②用pbst(含0.5％吐溫的pbs)洗板3次，每次3分鐘。之后用2％的羊血清封閉液封閉，37℃，2小時(shí)。

③pbst洗板3次。將培養(yǎng)上清樣本及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按順序加入封閉好的96孔板內(nèi)，37℃孵育1小時(shí)。

④pbst洗板5次，加入hrp-antimouse-tnf-α或il-6(1：10000)，37℃孵育1小時(shí)。

⑤pbst洗板5次，加入tmb顯色液，37℃孵育15分鐘。

⑥加入h2so4終止液，450nm測(cè)定od值。

⑦根據(jù)od值計(jì)算tnf-α或il-6的濃度。

如圖6.所示，gdnps能夠促使m2型巨噬細(xì)胞分泌m1型相關(guān)的細(xì)胞因子(tnf-α和il-6)，從分泌的細(xì)胞因子角度證實(shí)gdnps能夠使m2型巨噬細(xì)胞向m1型極化。

實(shí)施例8：gdnps體內(nèi)使腫瘤微環(huán)境中的m2型巨噬細(xì)胞極化為m1型，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)

①雄性c57/bl6小鼠，體重18-20克，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。適應(yīng)性生長(zhǎng)1周。

②小鼠右側(cè)腋下皮下接種小鼠黑色素瘤細(xì)胞-b16f10(2.5×10⁵個(gè)/只)，逐日觀察。

③種瘤7天后，小鼠移植瘤大小平均值達(dá)到50-120mm³，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組：荷瘤模型組(腹腔注射pbs)、灌胃治療組(gdnps150ug/只)、腹腔注射治療組(gdnps100ug/只)，治療間隔時(shí)間為3天(圖7)。

④逐日觀察各組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)，每2天測(cè)小鼠體重及腫瘤體積(腫瘤體積計(jì)算＝長(zhǎng)×寬²/2)

⑤治療11天后，測(cè)體重后眼眶采血，引頸處死小鼠，剝離腫瘤組織測(cè)量體積并稱重，其余主要臟器分離后甲醛固定。

⑥取部分小鼠腫瘤組織，膠原酶消化30分鐘后研磨，過(guò)200目濾網(wǎng)獲得腫瘤組織單細(xì)胞懸液，fc阻斷劑封閉(室溫，20分鐘)。

⑦分別加入anti-mousecd45、cd11b、cd206、cd80等單克隆抗體染色(室溫，30分鐘)，pbs洗2次。流式細(xì)胞儀鑒定上述分子的表達(dá)情況。

結(jié)果顯示：gdnps的灌胃治療及腹腔注射治療皆能抑制小鼠黑色素瘤的生長(zhǎng)(圖8～11)；通過(guò)對(duì)各組小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞比例的分析，發(fā)現(xiàn)gdnps的灌胃治療及腹腔注射治療組小鼠的腫瘤組織中，巨噬細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的比例要顯著高于荷瘤模型組(圖12)；同時(shí)，灌胃治療及腹腔注射治療組小鼠的腫瘤組織中m1/m2巨噬細(xì)胞的比例要顯著高于(圖13)。這些結(jié)果提示我們：gdnps在體內(nèi)能夠有效地將腫瘤組織中的m2型巨噬細(xì)胞向m1型極化，改善腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。