本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療領(lǐng)域，涉及一種藥物及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種具有提高抗原加工功能的藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，腫瘤免疫治療因?yàn)閷?duì)于常規(guī)無(wú)效的晚期腫瘤具有顯著療效而備受關(guān)注，它通過(guò)激活體內(nèi)的免疫細(xì)胞，特意性地清除癌變的細(xì)胞。這種治療方法具有特異性強(qiáng)，作用期長(zhǎng)和副作用小等優(yōu)點(diǎn)，一直以來(lái)被認(rèn)為是治愈腫瘤的終極手段。腫瘤免疫療法在2013年被science評(píng)為年度十大科技突破之首之后，腫瘤免疫療法的發(fā)展得到更廣泛關(guān)注。

腫瘤免疫治療是繼手術(shù)治療、藥物治療、放射治療之后的一種新的腫瘤治療手段，在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、治療腫瘤病灶等方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。世界上首個(gè)腫瘤治療性疫苗，即表皮生長(zhǎng)因子(egf)腫瘤治療性疫苗，該疫苗可以有效延長(zhǎng)晚期肺癌患者的生存期，副反應(yīng)很輕，且在停藥后自動(dòng)消失，也未發(fā)生自身免疫反應(yīng)癥狀。可見(jiàn)，腫瘤治療性疫苗在抗腫瘤治療具有明顯的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)有抗腫瘤免疫治療的研究主要集中在提高機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答或者阻止腫瘤免疫逃逸，而腫瘤免疫響應(yīng)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜機(jī)制，單純一方面的考慮是難以達(dá)到抗腫瘤治療的目的。

針對(duì)腫瘤的特異性免疫應(yīng)答，首先要求機(jī)體的抗原呈遞細(xì)胞能有效加工和呈遞腫瘤抗原，尤其是腫瘤細(xì)胞的免疫原性弱，數(shù)量少，更不利于有效的抗原呈遞和效應(yīng)細(xì)胞激活。因此，抗原呈遞細(xì)胞的加工水平亟待提高。

有研究表明，抗腫瘤疫苗的免疫效應(yīng)在體內(nèi)中不甚理想的主要原因是質(zhì)粒dna或多肽在進(jìn)入細(xì)胞前就被大量的降解，且腫瘤患者的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells，dc)對(duì)抗原捕獲的攝取能力較低，這也是為何現(xiàn)有許多抗腫瘤dna或多肽疫苗無(wú)法真正進(jìn)入臨床的主要原因之一。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，已有微球、脂質(zhì)體、納米粒、囊泡等納米給藥載體包裹dna、多肽疫苗進(jìn)行免疫研究的報(bào)道，納米給藥系統(tǒng)能增加dc對(duì)dna或多肽的攝取率，且納米給藥載體本身可以作為佐劑誘導(dǎo)增加t細(xì)胞反應(yīng)而增強(qiáng)免疫效應(yīng)。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞一種“自食”的過(guò)程，依靠溶酶體將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬在機(jī)體固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮了重要作用，一方面通過(guò)溶酶體清除胞質(zhì)內(nèi)微生物，發(fā)揮固有免疫調(diào)控作用；另一方面可以通過(guò)調(diào)節(jié)抗原呈遞，在獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮效應(yīng)。

因此，在本領(lǐng)域中期望能夠得到一種將上述兩種作用結(jié)合起來(lái)，通過(guò)調(diào)節(jié)自噬的過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)抗原呈遞的藥物體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種藥物及其制備方法和應(yīng)用，所述藥物通過(guò)增強(qiáng)自噬來(lái)提高抗原呈遞，從而進(jìn)行腫瘤的免疫治療。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種藥物，所述藥物包括細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子、腫瘤抗原分子和載體，所述自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子連接在所述載體上。

本發(fā)明中，所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子指的是具有自噬誘導(dǎo)或提升自噬水平的分子，包括具有生物活性的基因，多肽或小分子，所述腫瘤抗原分子指的是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中新出現(xiàn)或過(guò)度表達(dá)的抗原物質(zhì)，主要指的是蛋白類腫瘤抗原分子。

本發(fā)明通過(guò)將所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子連接在載體上，所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子通過(guò)誘導(dǎo)自噬發(fā)生提高樹(shù)突狀細(xì)胞的自噬水平，加強(qiáng)了樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)的蛋白加工等相關(guān)過(guò)程，所述腫瘤抗原分子通過(guò)載體也被樹(shù)突狀細(xì)胞高效的攝取到細(xì)胞內(nèi)部，伴隨自噬過(guò)程的發(fā)生，所述腫瘤抗原分子在樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)部也被有效加工進(jìn)而呈遞到細(xì)胞表面，所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子通過(guò)連接到同一個(gè)載體上，具有協(xié)同增效的作用，兩者的效果都比單獨(dú)與載體連接后分別進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的效果明顯增強(qiáng)。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)多肽和/或小分子細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，優(yōu)選為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)多肽。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)多肽包括beclin1和/或atg蛋白，優(yōu)選為beclin1。

優(yōu)選地，所述beclin1的氨基酸序列如seqno.1所示，所述seqno.1的氨基酸序列如下：cys-gly-thr-asn-val-phe-asn-ala-thr-phe-his-ser-gly-gln-phe-gly-thr。

優(yōu)選地，所述小分子細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑包括雷帕霉素和/或鈣蛋白酶抑制劑。

優(yōu)選地，所述腫瘤抗原分子為模式抗原肽和/或腫瘤表面標(biāo)志物，優(yōu)選為模式抗原肽。

優(yōu)選地，所述模式抗原肽包括卵清蛋白(ova)、附膜蛋白(muc1)或甲胎蛋白(afp)中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為卵清蛋白。

優(yōu)選地，所述卵清蛋白的氨基酸序列如seqno.2所示，所述seqno.2的氨基酸序列如下：cys-ser-ile-ile-asn-phe-glu-lys-leu。

優(yōu)選地，所述腫瘤表面標(biāo)志物包括附膜蛋白。

本發(fā)明中，所述自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子還可以進(jìn)行靶向性質(zhì)或親水性質(zhì)的修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行這些修飾，在此不做特殊限定，而且靶向性質(zhì)或親水性質(zhì)的修飾不會(huì)對(duì)本申請(qǐng)的治療效果產(chǎn)生影響。

優(yōu)選地，所述載體為無(wú)機(jī)金屬載體材料、無(wú)機(jī)非金屬載體材料或有機(jī)高分子材料中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為有機(jī)高分子材料。

優(yōu)選地，所述無(wú)機(jī)金屬載體材料包括金納米顆粒、銀納米顆粒或四氧化三鐵納米顆粒中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述無(wú)機(jī)非金屬載體材料包括介孔硅、碳納米管和石墨烯中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述有機(jī)高分子材料包括聚氨基酯材料，聚乳酸聚乙醇共聚物或脂質(zhì)體中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為聚氨基酯材料，進(jìn)一步優(yōu)選為修飾了酸敏感側(cè)鏈基團(tuán)的聚氨基酯材料。

本發(fā)明中，所述修飾了酸敏感側(cè)鏈基團(tuán)的聚氨基酯材料在溶酶體逃逸階段的酸性調(diào)節(jié)下，所述聚氨基酯材料結(jié)構(gòu)會(huì)變松散，利于藥物的釋放。

優(yōu)選地，所述聚氨基酯材料的分子式如式i所示：

其中，所述m，n獨(dú)立地選自3-40中的正整數(shù)，m和n可根據(jù)聚合反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行調(diào)節(jié)，在此不做特殊限定，優(yōu)選為n＝36，m＝4。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述藥物的分子式ii如式所示：

第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的藥物的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備載體；

(2)將步驟(1)所述載體溶解于有機(jī)溶劑中，與所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子避光反應(yīng)；

(3)將步驟(2)反應(yīng)后的產(chǎn)物用透析袋透析，收集產(chǎn)物即為所述藥物。

優(yōu)選地，步驟(1)所述的載體為聚氨基酯材料，具體包括：將1,6-己二醇二丙烯酸酯、n，n-二丁基丙二胺和nh2-mpeg2000溶解在有機(jī)溶劑中，溶解后通入n2，加熱后反應(yīng)，將反應(yīng)物進(jìn)行透析，得到所述載體，其中，m選自3-40中的正整數(shù)，優(yōu)選為4。

優(yōu)選地，所述1,6-己二醇二丙烯酸酯、n，n-二丁基丙二胺和nh2-mpeg2000的摩爾比為(8-15):(3-12):1，例如可以是8:3:1、9:3:1、10:3:1、11:3:1、12:3:1、13:3:1、14:3:1、15:3:1、8:4:1、8:5:1、8:6:1、8:7:1、8:8:1、8:9:1、8:10:1、8:11:1、8:12:1、9:4:1、9:5:1、9:6:1、9:7:1、9:8:1、9:9:1、9:10:1、9:11:1、9:12:1、10:4:1、10:5:1、11:5:1、11:6:1、11:7:1、11:8:1、11:9:1、11:10:1、11:12:1、12:4:1、12:6:1、12:8:1、12:10:1、12:12:1、13:4:1、13:6:1、13:8:1、13:10:1、13:12:1、14:4:1、14:6:1、14:8:1、14:10:1、14:12:1、15:4:1、15:6:1、15:8:1、15:10:1、15:12:1，優(yōu)選為(10-13):(6-10):1，進(jìn)一步優(yōu)選為12:9:1。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑選自但不限于二甲基亞砜和/或二甲基甲酰胺，優(yōu)選為二甲基亞砜。

優(yōu)選地，所述通入n2的時(shí)間為10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，優(yōu)選為12-16min，進(jìn)一步優(yōu)選為15min。

優(yōu)選地，所述加熱的溫度為40-60℃，例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃，優(yōu)選為43-56℃，進(jìn)一步優(yōu)選為50℃。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的時(shí)間為5-10天，例如可以是5天、6天、7天、8天、9天或10天，優(yōu)選為6-8天，進(jìn)一步優(yōu)選為7天。

優(yōu)選地，所述透析的透析袋的截留分子量為3000-4000，例如可以是3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900或4000，優(yōu)選為3200-3800，進(jìn)一步優(yōu)選為3500。

優(yōu)選地，所述透析的時(shí)間為5-10h，例如可以5h、6h、7h、8h、9h或10h，優(yōu)選為6-9h。

優(yōu)選地，步驟(2)所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子需要過(guò)量添加，即所述自噬誘導(dǎo)分子與所述載體的摩爾比不小于1:1，所述腫瘤抗原分子與所述載體的摩爾比不小于1:1。

優(yōu)選地，步驟(2)所述有機(jī)溶劑選自但不限于二甲基亞砜和/或二甲基甲酰胺，優(yōu)選為二甲基亞砜。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應(yīng)的溫度為30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，優(yōu)選為35-39℃，進(jìn)一步優(yōu)選為37℃。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應(yīng)的時(shí)間為3-5天，例如可以是3天、4天或5天，優(yōu)選為3天。

優(yōu)選地，步驟(3)所述透析袋的截留分子量為3000-4000，例如可以是3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900或4000，優(yōu)選為3200-3800，進(jìn)一步優(yōu)選為3500。

優(yōu)選地，步驟(3)所述透析的時(shí)間為5-10h，例如可以5h、6h、7h、8h、9h或10h，優(yōu)選為6-9h。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述制備方法包括如下步驟：

(1)將1,6-己二醇二丙烯酸酯、n，n-二丁基丙二胺和nh2-mpeg2000溶解在dmso中，所述1,6-己二醇二丙烯酸酯、n，n-二丁基丙二胺和nh2-mpeg2000的摩爾比為(8-15):(3-12):1，溶解后通入n210-20min，加熱到40-60℃后反應(yīng)5-10天，將反應(yīng)物采用截留分子量為3000-4000的透析袋進(jìn)行透析5-10h，得到所述載體，其中，所述m選自3-40中的正整數(shù)，優(yōu)選為4；

(2)將步驟(1)所述載體溶解于dmso中，加入所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子，所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子與所述載體的摩爾比不小于1:1，所述腫瘤抗原分子與所述載體的摩爾比不小于1:1，30-40℃避光反應(yīng)3-5天；

(3)將步驟(2)反應(yīng)后的產(chǎn)物采用截留分子量為3000-4000的透析袋進(jìn)行透析5-10h，冷凍干燥，即為所述藥物。

第三方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的藥物在制備腫瘤免疫治療藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述藥物的用量應(yīng)小于半毒性劑量(<ic50)。

本發(fā)明所述分子式ii藥物的用量為60-80μg/ml，例如可以是60μg/ml、61μg/ml、62μg/ml、63μg/ml、64μg/ml、65μg/ml、66μg/ml、67μg/ml、68μg/ml、69μg/ml、70μg/ml、71μg/ml、72μg/ml、73μg/ml、74μg/ml、75μg/ml、76μg/ml、77μg/ml、78μg/ml、79μg/ml或80μg/ml，優(yōu)選為65μg/ml，選擇在此用量范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成殺傷作用，而是通過(guò)刺激細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞自身的免疫效果，從而進(jìn)行腫瘤的治療。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明通過(guò)將所述細(xì)胞自噬誘導(dǎo)分子和所述腫瘤抗原分子連接在同一個(gè)載體上，具有協(xié)同增效的作用，兩者的效果都比單獨(dú)與載體連接后分別進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的效果明顯增強(qiáng)，有效誘導(dǎo)自噬從而增強(qiáng)抗原呈遞，最終達(dá)到提高治療腫瘤效果的目的；

(2)本發(fā)明藥物通過(guò)增強(qiáng)自噬從而提高抗原呈遞的藥物為發(fā)展腫瘤免疫治療提供了新思路。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明藥物的示意圖；

圖2是實(shí)施例1中所述載體的核磁圖譜(¹hnmr)；

圖3是實(shí)施例2中所述藥物的核磁圖譜(¹hnmr)；

圖4是所述藥物分子在加入dc2.4細(xì)胞后誘導(dǎo)自噬的共聚焦成像，其中，分子1-實(shí)施例1制備的載體，分子2-本發(fā)明對(duì)比例1制備的對(duì)照藥物，分子3-本發(fā)明實(shí)施例2制備的藥物，分子3+3-ma-分子3與自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤，分子2+rapa-分子2和化學(xué)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素；

圖5是實(shí)施例1中所述分子加入dc2.4細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的蛋白表達(dá)變化，其中，圖5(a)為自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(lc3)相對(duì)肌動(dòng)蛋白actin的表達(dá)，圖5(b)為自噬底物相關(guān)蛋白泛素結(jié)合蛋白p62相對(duì)肌動(dòng)蛋白actin的表達(dá)，其中，分子1-實(shí)施例1制備的載體，分子2-本發(fā)明對(duì)比例1制備的對(duì)照藥物，分子3-本發(fā)明實(shí)施例2制備的藥物；

圖6是實(shí)施例1中所述分子通過(guò)誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞不同程度的自噬后流式檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原水平，其中，分子1-實(shí)施例1制備的載體，分子2-本發(fā)明對(duì)比例1制備的對(duì)照藥物，分子3-本發(fā)明實(shí)施例2制備的藥物，分子3+3-ma-分子3與自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤，分子2+rapa-分子2和化學(xué)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素；

圖7是實(shí)施例1中所述分子進(jìn)行腫瘤治療過(guò)程中小鼠腫瘤的體積大小，其中，分子1-實(shí)施例1制備的載體，分子2-本發(fā)明對(duì)比例1制備的對(duì)照藥物，分子3-本發(fā)明實(shí)施例2制備的藥物；

圖8是實(shí)施例1中所述分子進(jìn)行腫瘤治療過(guò)程中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠的腫瘤內(nèi)部cd8+細(xì)胞數(shù)量，其中，分子1-實(shí)施例1制備的載體，分子2-本發(fā)明對(duì)比例1制備的對(duì)照藥物，分子3-本發(fā)明實(shí)施例2制備的藥物。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

實(shí)施例1載體的制備

以聚氨基酯化合物為例，其分子結(jié)構(gòu)為：

聚合物合成具體方法為：(1)稱取1.2mmol的1,6-己二醇二丙烯酸酯，0.9mmol的n，n-二丁基丙二胺以及0.1mmol的nh2-mpeg2000，并全部溶解分散在2ml的二甲基亞砜(dmso)中，完全溶解后通入n215分鐘，然后加熱到50℃避光反應(yīng)7天；(2)7天后取出反應(yīng)產(chǎn)物，使用截留量為3500的透析袋在水中透析6-9個(gè)小時(shí)，收集透析袋中的產(chǎn)物；(3)冷凍干燥，將產(chǎn)物凍干后收集以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

所述載體的核磁結(jié)構(gòu)如圖2所示，虛線框位置表示雙鍵，可見(jiàn)構(gòu)建成功所述載體。

實(shí)施例2藥物的制備

取實(shí)施例1中反應(yīng)產(chǎn)物溶解于dmso，向其中加入過(guò)量的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)肽beclin1，以及腫瘤抗原肽ova，37℃避光反應(yīng)3天；(2)3天后取出反應(yīng)產(chǎn)物，使用截留量為3500的透析袋在水中透析6-9個(gè)小時(shí)，收集透析袋中的產(chǎn)物；(3)冷凍干燥，將產(chǎn)物凍干后收集以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)物具有自噬誘導(dǎo)功能與腫瘤抗原負(fù)載的分子。

所得到的修飾多肽的分子，即所述藥物分子3的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

其示意圖如圖1所示，核磁圖譜如圖3所示，從圖中可以看出原來(lái)載體分子中聚合物兩端的雙鍵消失(虛線框表示位置)，說(shuō)明雙鍵與多肽中半胱氨酸(cys)上的巰基(-sh)發(fā)生了反應(yīng)，說(shuō)明多肽有效的共價(jià)連接在了載體分子的兩端。

對(duì)比例1所述藥物對(duì)照分子2的制備

取實(shí)施例1中反應(yīng)產(chǎn)物溶解于dmso，向其中加入過(guò)量的不具有自噬誘導(dǎo)功能的對(duì)照多肽beclin1scramble：cys-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu，以及腫瘤抗原肽ova，37℃避光反應(yīng)3天；(2)3天后取出反應(yīng)產(chǎn)物，使用截留量為3500的透析袋在水中透析6-9個(gè)小時(shí)，收集透析袋中的產(chǎn)物；(3)冷凍干燥，將產(chǎn)物凍干后收集以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)物不具有自噬誘導(dǎo)功能分子，具有抗原負(fù)載的分子，為對(duì)照藥物分子2。

實(shí)施例3所述藥物提高誘導(dǎo)自噬

首先，使用dc2.4細(xì)胞系為對(duì)象，進(jìn)行分子誘導(dǎo)自噬效應(yīng)的研究。將dc2.4細(xì)胞按5×10⁴接種在共聚焦皿中，在37℃以及5％co2的條件下孵育12小時(shí)；利用lipo3000對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染gfp-lc3質(zhì)粒，待轉(zhuǎn)染6小時(shí)后將含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)12-16小時(shí)；

向轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中分別加入細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，抑制劑以及對(duì)應(yīng)的分子3或?qū)φ辗肿?，孵育12小時(shí)后用pbs潤(rùn)洗細(xì)胞并使用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的gfp熒光，結(jié)果如圖4，通過(guò)gfp-lc3熒光可初步判斷分子誘導(dǎo)自噬的水平。

當(dāng)僅用載體分子即分子1處理細(xì)胞的時(shí)候，gfp-lc3陽(yáng)性斑點(diǎn)沒(méi)有增加，細(xì)胞的熒光沒(méi)有明顯的增強(qiáng)；當(dāng)用修飾了腫瘤抗原肽和細(xì)胞自噬誘導(dǎo)對(duì)照肽的分子2處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的gfp-lc3陽(yáng)性斑點(diǎn)和細(xì)胞的熒光沒(méi)有明顯的增加；當(dāng)用修飾了具有細(xì)胞自噬誘導(dǎo)功能的多肽和腫瘤抗原肽的分子3處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞中的gfp-lc3斑點(diǎn)明顯變多，熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)，說(shuō)明自噬水平確實(shí)有提高。當(dāng)輔以細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑rapa和分子2共同處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞中的gfp-lc3熒光增強(qiáng)，說(shuō)明自噬水平在誘導(dǎo)劑的作用下得到了提升；當(dāng)用自噬抑制劑3-ma和分子3共同處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的gfp-lc3熒光減弱，說(shuō)明分子3引起的自噬升高被抑制劑3-ma抑制。

再將dc2.4細(xì)胞傳代于六孔板，向細(xì)胞中分別加入自噬誘導(dǎo)劑，抑制劑以及對(duì)應(yīng)的分子或?qū)φ辗肿拥龋?2小時(shí)后收集細(xì)胞并用ripa裂解液裂解，收集細(xì)胞裂解液并用bsa進(jìn)行蛋白定量，然后用于蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5，通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，所述實(shí)施例2制備的藥物能有效誘導(dǎo)自噬。

實(shí)施例4所述藥物提高抗原呈遞效應(yīng)

選取小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞為細(xì)胞模型用于研究該分子的抗原呈遞效應(yīng)。按照l(shuí)utz法分離并擴(kuò)增小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞。到第8天，將樹(shù)突狀細(xì)胞傳代并按5×10⁵重新鋪板于六孔板中；培養(yǎng)12-16小時(shí)后，向其中加入自噬誘導(dǎo)劑，抑制劑以及對(duì)應(yīng)的分子或?qū)φ辗肿拥?；孵?2小時(shí)后分別收集細(xì)胞；使用流式抗體h-2k^b，cd11c(biolegend)孵育細(xì)胞并用bdcallibur儀器檢測(cè)；此外，還可以收集的上清運(yùn)用elisa的手段對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。

通過(guò)圖6結(jié)果可以看到實(shí)施例2所述的藥物分子對(duì)自噬的調(diào)控有效的增強(qiáng)了抗原的呈遞，當(dāng)用具有細(xì)胞自噬誘導(dǎo)功能的分子3處理細(xì)胞時(shí)，抗原呈遞水平顯著升高；而用不具有細(xì)胞自噬誘導(dǎo)功能的分子2處理細(xì)胞時(shí)，抗原呈遞水平升高不明顯。同樣，當(dāng)聯(lián)合用分子2和自噬激活劑rapa處理細(xì)胞時(shí)，抗原呈遞水平顯著升高；而用自噬抑制劑3-ma和分子3處理細(xì)胞時(shí)，由分子3引起的抗原水平升高被下調(diào)。該結(jié)果說(shuō)明自噬水平的高低與抗原呈遞的水平是正相關(guān)的，通過(guò)提高自噬水平以增強(qiáng)抗原呈遞是一種有效的手段。

實(shí)施例5所述藥物提高抗原呈遞用于腫瘤治療

將特異性表達(dá)卵清蛋白o(hù)va抗原的小鼠黑色素瘤細(xì)胞b16-f10-ova接種于小鼠c57bl/6右腿外側(cè)。約5-7天后，待小鼠荷瘤大小長(zhǎng)到200mm³開(kāi)始進(jìn)行腫瘤治療。間隔一日靜脈給藥并檢測(cè)腫瘤大小，如圖7，所給藥物為上述方法實(shí)施例2制備得到的藥物分子，同時(shí)給其他組小鼠給相應(yīng)的對(duì)照藥物，進(jìn)行為期兩周的治療；并通過(guò)流式分析腫瘤內(nèi)部cd8+細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖8，可見(jiàn)所述藥物分子能通過(guò)提高抗原呈遞增強(qiáng)t細(xì)胞的活化，最終達(dá)到提高腫瘤治療效果的目的。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的載藥聚合物納米膠束及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>國(guó)家納米科學(xué)中心

<120>一種藥物及其制備方法和應(yīng)用

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>17

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>1

cysglythrasnvalpheasnalathrphehisserglyglnphegly

151015

thr

<210>2

<211>9

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>2

cysserileileasnpheglulysleu

15