本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00980159856.0的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是2009年7月24日提交的pct國(guó)際申請(qǐng)pct/us2009/004299于2011年12月13日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)

根據(jù)35u.s.c.§119(e)，本申請(qǐng)要求2009年4月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)ussn61/168,914的優(yōu)先權(quán)，其通過引用全文并入本文。

本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒樣顆粒(viruslikeparticle，vlp)及其作為治療劑的用途。

背景技術(shù)：

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性主要癌癥死亡原因之一，每年奪去超過233,000名女性的生命。20世紀(jì)以前，在女性中的發(fā)生率和死亡率上，宮頸癌都是最常見的惡性疾病。在發(fā)達(dá)國(guó)家中，宮頸癌發(fā)生率的降低是重大公共健康成就之一，主要?dú)w因于實(shí)施基于人群的篩查(population-basedscreening)以及侵入前疾病(pre-invasivedisease)的檢測(cè)和治療計(jì)劃。然而，雖然在發(fā)達(dá)國(guó)家中宮頸癌的發(fā)生率已降低，但在世界范圍內(nèi)該疾病仍然是女性中第二常見的癌。

巴氏(papanicolaou，pap)涂片可檢測(cè)宮頸中的宮頸癌或癌前病變(pre-cancerouschange)，其中很多與hpv相關(guān)。在實(shí)施廣泛篩查措施的發(fā)達(dá)國(guó)家中，這些pap涂片極大地降低了宮頸癌的發(fā)生率和死亡率。在篩查措施仍然十分有限的發(fā)展中國(guó)家中，宮頸癌是女性中最常報(bào)道的癌，并且其發(fā)生率持續(xù)升高。

宮頸上皮內(nèi)異常(cervicalintraepithelialabnormalities)的所有現(xiàn)有治療(包括冷凍療法(cryotherapy)、激光消融(laserablation)、子宮頸錐切除(excisionalconization)和環(huán)形電切術(shù)(loopelectrosurgicalexcisionprocedure，leep))都是侵入性的手術(shù)過程，常導(dǎo)致明顯的副反應(yīng)，包括分泌物過多、感染、出血、痙攣、子宮頸機(jī)能不全(cervicalincompetence)，可導(dǎo)致流產(chǎn)、宮頸完整性喪失和無(wú)法懷孕。此外，這些過程必須在門診場(chǎng)所中進(jìn)行，這增加了治療的成本。

子宮頸上皮內(nèi)瘤形成(cin，cervicalintraepithelialneoplasia)是指宮頸癌的侵入前病理中間階段。在子宮頸的細(xì)胞涂片或組織活檢中觀察到的異常表現(xiàn)代表了子宮頸內(nèi)皮細(xì)胞分化程度的改變。這種細(xì)胞發(fā)育異常分為三個(gè)不同嚴(yán)重程度的組：cini是指局限于內(nèi)皮的基部1/3的輕微發(fā)育異常；cinii是指局限于內(nèi)皮的基部2/3的病變；ciniii是指涵蓋大于內(nèi)皮厚度2/3的細(xì)胞發(fā)育異常。

在美國(guó)，每年約350萬(wàn)女性會(huì)有異常的pap涂片試驗(yàn)。這些女性中約120萬(wàn)患有鱗狀上皮內(nèi)病變(squamousintraepitheliallesion，sil)，其中的200,000至300,000人屬于晚期。在拉丁美洲，嚴(yán)重cin的發(fā)生率超過美國(guó)發(fā)生率的3倍。表1提供了世界范圍內(nèi)hpv感染和cin流行程度的總結(jié)。

表1：世界范圍內(nèi)hpv和cin的發(fā)病率

hpv感染在性活躍的個(gè)體中流行。具有多個(gè)性伴侶的女性獲得hpv的機(jī)會(huì)并因而獲得hpv相關(guān)子宮頸感染的機(jī)會(huì)更高。高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型的感染增加了女性罹患宮頸癌的可能性。在hpv感染的女性中篩查和隨后治療癌前宮頸病癥對(duì)宮頸癌的預(yù)防高度有效。然而，當(dāng)前的治療常需手術(shù)介入并且需要替代性的治療選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一些方面涉及基于hpv的顆粒及其用于治療疾病和/或遞送治療劑的用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可用于治療粘膜疾病(例如，粘膜組織(例如粘膜內(nèi)皮細(xì)胞)的疾病和/或感染)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一些方面涉及經(jīng)修飾的基于hpv的顆粒，所述顆粒能將治療劑遞送到粘膜組織(例如，表面施用)。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑可為抗病毒劑。所述抗病毒劑可用于治療病毒感染，例如，人乳頭瘤病毒、皰疹病毒或靶向粘膜組織的其他病毒。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑可為抗癌劑。所述抗癌劑可用于治療例如宮頸癌或任何其他粘膜組織的癌癥。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)感染的方法和用于治療對(duì)象中的hpv相關(guān)疾病(包括但不限于宮頸癌)的方法。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的經(jīng)修飾病毒顆粒可用于遞送其他類型的治療劑和/或醫(yī)療劑(例如，成像劑或造影劑)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆?？删植窟f送(例如，以乳膏、泡沫、噴霧劑、氣霧劑或其他適于表面遞送(topicaldelivery)的形式)至任何粘膜組織(例如，子宮頸、鼻、口腔或其他粘膜組織)。然而，本發(fā)明的一些方面不限于表面遞送，經(jīng)修飾顆?？善は?、靜脈內(nèi)、胃腸外和/或通過任何其他適合的遞送途徑遞送。

本文中提供的方法包括將通過基于病毒樣顆粒(vlp)遞送系統(tǒng)遞送的一種或多種治療劑施用于對(duì)象。在某些實(shí)施方案中，所述基于vlp的遞送系統(tǒng)包含人乳頭瘤病毒樣納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，hpv納米顆粒包含病毒l1蛋白。在一些實(shí)施方案中，hpv納米顆粒包含病毒l1蛋白和病毒l2蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述l1和/或l2蛋白可為野生型病毒蛋白。在一些實(shí)施方案中，l1和/或l2蛋白可通過突變和/或插入/缺失而改變。在某些實(shí)施方案中，包含l1和/或l2的hpv納米顆粒的暴露于表面的環(huán)中的氨基酸發(fā)生突變、缺失和/或插入。在某些實(shí)施方案中，暴露于表面的環(huán)中的氨基酸的突變、缺失和/或插入導(dǎo)致hpv納米顆粒的免疫原性的改變。在某些實(shí)施方案中，免疫原性可以這樣的方式改變，使得某些血清型的hpv納米顆粒不再被對(duì)抗這種血清型的抗體所識(shí)別。在這些實(shí)施方案中，所述改變的hpv納米顆粒在具有所述血清型特異性抗體的宿主中是免疫沉默的。

因此，在一些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的基于hpv的顆粒進(jìn)行修飾以使其具有降低或改變的免疫原性?？蛇x擇這樣的顆粒遞送給具有中和性抗hpv應(yīng)答的患者。在一些實(shí)施方案中，出于治療目的將一系列具有不同血清型的基于hpv的顆粒施用給對(duì)象，以降低中和性免疫應(yīng)答對(duì)任一種所述血清型的作用。例如，可將第一血清型用于第一對(duì)象施用組(例如1、2、3、4、5、5-10或更多)。隨后，可將第二血清型用于第二施用組(例如1、2、3、4、5、5-10或更多)以降低對(duì)象針對(duì)所述第一血清型產(chǎn)生的中和免疫應(yīng)答的影響。應(yīng)當(dāng)理解的是，其他施用組可涉及第三、第四、第五等血清型。不同的血清型可為天然血清型、嵌合血清型、其他突變血清型，或其任何組合。應(yīng)當(dāng)理解的是，可將該系列或順序施用用于特定化合物(例如每一種不同血清型中的同一個(gè))或一系列不同的化合物在數(shù)月和/或數(shù)年時(shí)間段內(nèi)的長(zhǎng)期施用(例如，治療)。

在一些實(shí)施方案中，可以如下的方式向病毒衣殼蛋白l1和/或l2中引入氨基酸的突變、缺失和/或插入，使得所得的hpv納米顆粒不失去向所述靶細(xì)胞遞送治療劑的能力。在一些實(shí)施方案中，所述hpv納米顆粒未失去將核酸(例如，sirna或shrna)轉(zhuǎn)移進(jìn)靶細(xì)胞的能力。

在一些實(shí)施方案中，可改變免疫原性以使某些血清型的hpv納米顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉特異性中和性抗體的免疫應(yīng)答。在這些實(shí)施方案中，這樣改變所述hpv納米顆粒，以使得其在其表面上表現(xiàn)出多個(gè)血清特異性表位(例如，通過在表面暴露環(huán)中插入表位)或使得其表現(xiàn)出血清型之間更保守的表位(例如，通過在表面暴露環(huán)中插入l2蛋白的部分，或者通過將保守的表位與hpv納米顆粒的表面相連)。在一些實(shí)施方案中，在hpv感染的個(gè)體中誘導(dǎo)交叉特異性中和性抗體的產(chǎn)生，其中所述hpv感染的個(gè)體已進(jìn)行過治療以消除或減少hpv感染細(xì)胞的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，所述hpv感染的個(gè)體已進(jìn)行過治療以消除或減少hpv相關(guān)腫瘤的大小。在這些實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)交叉特異性中和性抗體的產(chǎn)生以產(chǎn)生足以對(duì)治療后剩余的hpv感染細(xì)胞進(jìn)行免疫監(jiān)視的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的免疫監(jiān)視足以阻止新的hpv感染或hpv感染的細(xì)胞的復(fù)育(repopulation)，或hpv感染的腫瘤的復(fù)發(fā)。在一些實(shí)施方案中，交叉特異性中和性抗體可有效對(duì)抗一種或多種hpv血清型。

在一些實(shí)施方案中，由基于vlp的遞送系統(tǒng)遞送的治療劑為核酸。核酸治療劑可以是例如sirna或shrna分子或編碼它們的質(zhì)粒。其他的治療劑可以是例如小分子，如具有抗病毒或抗癌活性的小分子。

在某些實(shí)施方案中，通過基于vlp的遞送系統(tǒng)給具有hpv感染或hpv相關(guān)癌癥(例如宮頸癌)或病變的對(duì)象施用一種或多種治療劑，導(dǎo)致殺死和/或清除hpv感染細(xì)胞。hpv感染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞被認(rèn)為是引起hpv相關(guān)癌癥或病變的原因。在一些實(shí)施方案中，殺死和/或清除hpv感染的細(xì)胞導(dǎo)致hpv相關(guān)癌癥的部分或完全緩解。

在一些實(shí)施方案中，本文中描述的所述治療方法可在用包含治療劑的hpv納米顆粒治療之前、同時(shí)或之后，與其他治療劑(例如，抗癌劑和/或抗病毒劑)和/或免疫調(diào)節(jié)劑和/或放射治療或免疫治療聯(lián)合施用。在一些實(shí)施方案中，所述抗癌劑和/或抗病毒劑可通過hpv納米顆粒遞送。在一些實(shí)施方案中，所述hpv納米顆粒和所述抗癌劑和/或抗病毒劑可一起施用或者可分別施用，例如，在不同時(shí)間或不同施用部位或者通過不同施用途徑施用。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本文中描述的方法治療的對(duì)象中大多數(shù)或全部hpv感染細(xì)胞被殺死或清除，并且在hpv感染的對(duì)象中不再檢出hpv。在另一些實(shí)施方案中，對(duì)象中一些hpv感染的細(xì)胞被殺死或清除，并且在hpv感染的對(duì)象中仍可檢出hpv。在一些實(shí)施方案中，具有hpv相關(guān)病變或癌癥的對(duì)象可發(fā)生癌癥或病變的部分或完全消退。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象未發(fā)生病變或癌癥或病毒感染的復(fù)發(fā)。在另一些實(shí)施方案中，對(duì)象經(jīng)歷病變或癌癥或病毒感染的復(fù)發(fā)。在一些實(shí)施方案中，在用包含治療劑的hpv納米顆粒治療期間和/或之后，將本文所述的治療方法與抗病毒治療進(jìn)一步聯(lián)合?？山o予抗病毒治療以防止例如hpv復(fù)制、病毒擴(kuò)散和/或具有在首次治療后存活的或已作為新感染進(jìn)入對(duì)象身體的hpv之細(xì)胞的復(fù)育。

在另一些實(shí)施方案中，在初次治療方案結(jié)束時(shí)，施用改變的hpv顆粒。所述hpv納米顆粒進(jìn)行如下改變，使得其在其表面上表現(xiàn)出多個(gè)血清特異性表位，或其表現(xiàn)出血清型間更保守的表位。在一些實(shí)施方案中，施用這種改變的hpv納米顆?？烧T導(dǎo)針對(duì)所施用表位的局部免疫應(yīng)答，例如，誘導(dǎo)交叉特異性中和性抗體的增加，所述抗體足以使免疫監(jiān)視能夠檢測(cè)并殺死新近被hpv感染的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，阻止新病毒感染和/或擴(kuò)散和復(fù)育足以抑制hpv相關(guān)癌癥或病變的復(fù)發(fā)。

在某些實(shí)施方案中，本文中描述的方法包括通過不同途徑施用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，通過表面施用來(lái)施用hpv納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，靶向粘膜進(jìn)行表面施用。例如，包含一種或多種治療劑的所述hpv納米顆?？杀砻媸┯弥羶?nèi)皮(例如子宮頸內(nèi)皮)或其附近，或者局部施用至病變(例如子宮頸或肛門內(nèi)皮癌)或其附近。

在某些實(shí)施方案中，提供包含改變的病毒衣殼的hpv納米顆粒，其中如本文描述的那樣，通過野生型氨基酸的突變、額外氨基酸的插入和/或野生型氨基酸的去除來(lái)改變所述病毒衣殼蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述改變的hpv納米顆粒在對(duì)象中或多或少是免疫原性的，或者具有改變的免疫原性。在一些實(shí)施方案中，所述改變的hpv納米顆粒保持將治療劑遞送或轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的能力。

因此，本發(fā)明的一些方面涉及用于向?qū)ο筮f送一種或多種化合物的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，使用修飾的人乳頭瘤病毒(hpv)樣顆粒，其中所述顆粒包含一種或多種包裝在hpv樣顆粒中的異源化合物，所述顆粒包含免疫原性改變的表面蛋白。所述異源化合物為非hpv分子(例如，不是hpv基因組、不是hpv核酸和/或不是其他hpv分子的化合物)。這樣的化合物可以是治療劑或其他醫(yī)藥化合物。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑可以是下述中的一種或多種：治療劑或醫(yī)藥劑、核酸或小分子，或者成像劑或造影劑。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑為sirna、shrna、反義核酸，或者編碼sirna、shrna或反義核酸的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述sirna、shrna或反義核酸靶向hpv-e6和/或hpv-e7。在一些實(shí)施方案中，所述小分子是抗病毒劑。在一些實(shí)施方案中，所述小分子是抗癌劑(例如吉西他濱)。

應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法和組合物可以與一種或多種其他藥劑(例如，抗病毒劑、抗癌劑(例如吉西他濱)，或其任何組合)一起提供。

在本發(fā)明的方法和組合物的一些實(shí)施方案中，所述hpv樣顆粒包含l1蛋白，或者包含l1蛋白與l2蛋白。在本發(fā)明的方法和組合物的一些實(shí)施方案中，所述表面蛋白是具有修飾的fg環(huán)序列的修飾的l1蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述l1蛋白具有hpv16、hpv31、hpv33、hpv34、hpv35、hpv52、hpv58、hpv73或hpv91血清型的序列，并且其中所述l1蛋白的所述fg環(huán)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，所述改變使人對(duì)象中所述蛋白的免疫原性發(fā)生改變。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變發(fā)生在seqidno：11的x1-x17的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上。在一些實(shí)施方案中，在位置x16上的氨基酸沒有改變。在一些實(shí)施方案中，seqidno：11的x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的一個(gè)或多個(gè)位置被修飾。在一些實(shí)施方案中，seqidno：11的x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的2-3個(gè)位置被修飾。在一些實(shí)施方案中，seqidno：11的x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的4-7個(gè)位置被修飾。在一些實(shí)施方案中，seqidno：11的x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的3個(gè)位置被修飾。在一些實(shí)施方案中，seqidno：11的x6、x11和x14位置被修飾。在一些實(shí)施方案中，seqidno：11的x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14的所有位置均被修飾。在一些實(shí)施方案中，所述l1蛋白具有hpv16血清型的序列，其seqidno：11的x6、x11和x14位置分別改變?yōu)閠、t和n，seqidno：11的其余位置具有hpv16血清型的特征性氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述l1蛋白具有hpv16血清型的序列，其在位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14分別改變?yōu)閒、s、t、s、t、t和n，并且seqidno：11的其余位置具有hpv16血清型的特征性氨基酸。

應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，向不具有針對(duì)表面蛋白血清型的中和免疫應(yīng)答的對(duì)象施用hpv樣顆粒，例如，當(dāng)所述對(duì)象未針對(duì)所述表面蛋白的血清型進(jìn)行過免疫時(shí)，或當(dāng)所述對(duì)象未感染過與所述hpv樣顆粒中表面蛋白血清型具有相同血清型的hpv時(shí)。在一些實(shí)施方案中，在選擇供施用的hpv樣顆粒之前，對(duì)所述對(duì)象的免疫應(yīng)答進(jìn)行評(píng)價(jià)。

在一些實(shí)施方案中，將hpv樣顆粒施用于粘膜組織。所述粘膜組織可在本文中描述的任何位置(例如，子宮頸、泌尿生殖道、口腔等)。此外，在一些實(shí)施方案中，將hpv樣顆粒施用于表皮位置(例如，以治療表皮癌或皮膚癌或感染)。

應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的組合物可局部和/或通過任何其他合適的途徑施用(例如，通過注射劑、氣霧劑、噴霧劑或其他施用形式施用)。

可將本發(fā)明組合物施用于被病毒、細(xì)菌和/或其他微生物或寄生蟲感染的組織。在一些實(shí)施方案中，感染部位可被幾種不同的有機(jī)體(例如，多種病毒和/或其他微生物，例如hpv和皰疹病毒(如hsv))所感染。因此，本發(fā)明的組合物可包含廣泛靶向幾種不同有機(jī)體的化合物，或包含各自靶向不同有機(jī)體的幾種不同化合物，或者其組合。在一些實(shí)施方案中，同樣的hpv樣顆?？砂煌闹委熁衔?。在一些實(shí)施方案中，組合物或治療方案可包含兩種或多種不同的hpv樣顆粒，其各自含有靶向特定感染的化合物。

可將本發(fā)明的組合物施用給對(duì)象以治療癌癥(例如，在施用部位處或其附近)。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥可以與感染(例如，hpv或hsv感染)相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥可以與感染不相關(guān)。因此，本發(fā)明的一些方面可用于治療皮膚癌(例如，非黑色素瘤皮膚癌)。

在一些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明組合物施用給具有免疫系統(tǒng)缺陷的對(duì)象，以治療與免疫系統(tǒng)缺陷相關(guān)的病癥(例如，感染、癌癥或其他病癥)。所述免疫系統(tǒng)缺陷可由感染(例如，hiv感染、aids)或其他病癥(例如癌癥)所引起。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的hpv樣顆粒可與促進(jìn)非特異性免疫應(yīng)答(例如，在施用部位或其附近)的組合物一起施用。所述非特異性免疫應(yīng)答可有助于治療感染和/或癌癥或其他病癥。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)答于施用具有不同血清型的多種hpv樣顆粒的提高的免疫應(yīng)答可能是有益的。因此，本發(fā)明的一些組合物包含幾種不同的血清型。

在一些實(shí)施方案中，可通過在第一段時(shí)間給對(duì)象施用包含化合物的第一hpv樣顆粒，并在第二段時(shí)間給所述對(duì)象施用包含所述化合物的第二hpv樣顆粒，以實(shí)現(xiàn)組合物的長(zhǎng)期施用，其中所述第一和第二hpv樣顆粒具有不同的血清型?？墒褂闷渌逍瓦M(jìn)行進(jìn)一步施用。在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二hpv樣顆粒的血清型獨(dú)立地為天然或改變的血清型。在一些實(shí)施方案中，所述第一和/第二hpv樣顆粒的血清型是嵌合血清型。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物或方法可包括使用hpv樣顆粒，所述顆粒通過包含融合在l1環(huán)中的l2序列而具有嵌合血清型。在一些實(shí)施方案中，所述l2序列連接在l1顆粒的表面上。在一些實(shí)施方案中，所述l2序列由hpv31l2蛋白的13至88位殘基構(gòu)成。

在以下非限定性的實(shí)施例和描述中，更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的這些和其他方面。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了hpv-16的e6和e7基因的sirna的位置。

圖2顯示的條形圖表明zncl2在生產(chǎn)編碼螢光素酶的假病毒顆粒中的作用。在以未使用zncl2的重新組裝的假病毒顆粒轉(zhuǎn)染的293ft細(xì)胞中評(píng)價(jià)了螢光素酶基因的表達(dá)，并且在存在zncl2時(shí)產(chǎn)生的假病毒顆粒轉(zhuǎn)染的293ft、tc1、c33和caski細(xì)胞中評(píng)價(jià)了螢光素酶基因的表達(dá)。

圖3顯示了a)從以lacz、e6-1、e6-2、e7-1和e7-2的shrna轉(zhuǎn)染的caski細(xì)胞中提取的逆轉(zhuǎn)錄mrna。用e6和e7基因特異性引物和作為對(duì)照的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)引物pcr擴(kuò)增了cdna。b)以lacz、e6-2、e6-1、e7-2和e7-1的shrna轉(zhuǎn)染的caski細(xì)胞(模擬組)的細(xì)胞提取物的western印跡的照片。使用p53和β-肌動(dòng)蛋白抗體分析了提取物。

圖4顯示的條形圖表明了e6和e7的shrna對(duì)c33(灰色柱)、caski(黑色柱)和tc1(白色柱)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。細(xì)胞(c)是以lacz、e6-1、e6-2、e7-1和e7-2的shrna轉(zhuǎn)染的。

圖5顯示的照片表明c57bl6小鼠中tc1腫瘤生長(zhǎng)的抑制。將tc1細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染。a)注射以單獨(dú)的vlp(底部)和e7-1假病毒顆粒(頂部)處理的tc1細(xì)胞之后獲得的腫瘤的比較。b)用shrna假病毒顆粒和shrna慢病毒(lentivirus)進(jìn)行不同處理后腫瘤重量比較的定量柱形圖。

圖6顯示的圖表明腫瘤內(nèi)注射對(duì)照shrna和e7-1shrna假病毒顆粒(pseudovirion，pv)后c57bl6小鼠中tc1腫瘤生長(zhǎng)的抑制。a)第一次注射對(duì)照shrna或e7-1shrna假病毒顆粒之后腫瘤大小的(平均直徑)的演變。b)以對(duì)照shrna和e7-1shrna假病毒顆粒處理的小鼠中3周時(shí)的腫瘤重量。

圖7(a)顯示代表性的表面等離子體共振數(shù)據(jù)的圖。(b)顯示通過spr進(jìn)行的由15種構(gòu)象表位識(shí)別的hpv31mab間相互作用研究中構(gòu)建的表位圖(epitopemap)。中和內(nèi)化抗體以黑色顯示，中和細(xì)胞連接的以下劃線顯示。h31.d24抗體是非中和的(以方框顯示)。(c)以下劃線表示抑制vlp與肝素結(jié)合的aq5抗體。

圖8顯示hpv31l1蛋白的表位，所述表位通過使用細(xì)菌呈示法被非中和性mab(h31.d24)和四種中和性mab(h31.b1、h31.f7、h31.f16和h31.h12)所識(shí)別。

圖9描述附著前和附著后的假病毒顆粒的mab中和。(a)通過hpv31mab抑制hpv31假病毒進(jìn)入。以hpv31mab預(yù)先孵育hpv31假病毒顆粒，并隨后加入細(xì)胞。(b)用hpv31mab抑制hpv31假病毒顆粒的內(nèi)化。預(yù)先附著hpv31假病毒顆粒至細(xì)胞，并隨后添加hpv31mab。在圖的右側(cè)對(duì)使用細(xì)菌呈示方法研究的五種mab進(jìn)行分組?；疑泻托灶愋吞禺愋詍ab；黑色柱，交叉中和的f7mab。

圖10描述vlp結(jié)合至hs和ecm：hpv31mab和l1c-末端缺失的作用。(a)用mab預(yù)孵育vlp之后，肝素結(jié)合的抑制。(b)用mab預(yù)孵育vlp之后，ecm結(jié)合的抑制。在圖的右側(cè)對(duì)使用細(xì)菌呈示法研究的五個(gè)mab進(jìn)行分組?；疑褐泻托灶愋吞禺愋詍ab；黑色柱：f7交叉中和mab；空心柱：d24非中和mab。數(shù)值為抑制百分比和sd。大于50％的抑制被認(rèn)為是陽(yáng)性的。

圖11描述了具有或不具有c-末端缺失(d9和d31)的類型16和類型31的天然vlp(黑色柱)和變性的vlp(灰色柱)的肝素結(jié)合。

圖12描述了hpv31的fg環(huán)上被五種單克隆抗體識(shí)別的表位的位置。hpv31l1蛋白的fg環(huán)上被四種mab所識(shí)別的表位的位置。

圖13分別描述了hpv16和hpv31的fg環(huán)的序列比對(duì)，和插入hpv16fg環(huán)野生型序列中以產(chǎn)生嵌合體的突變(x和y)。

圖14描述的圖表顯示提取自轉(zhuǎn)染了wthpv16和嵌合體hpvx和hpvy的cos-7細(xì)胞的螢光素酶活性(計(jì)數(shù)/分鐘，cpm，countperminute)。

圖15描述的表格顯示以elisa檢測(cè)測(cè)量的來(lái)自免疫接種了hpv16、hpv31、hpvx或hpvy的小鼠的hpv16、hpv31、hpvx和hpvy特異性抗體的效價(jià)(幾何平均效價(jià))(geometricmeantiter，gmt))。

圖16描述嵌合的vlpl1stii(a)和31l1-16l2(13-88)(b)的電鏡照片(標(biāo)尺條(bar)＝200nm)。

圖17描述的條形圖顯示通過elisa對(duì)嵌合的hpv16l1-stii、hpv16l1stiil2sa和hpv31l1-16l213-88vlp顆粒的抗原性的分析。使用camvir-1mab將結(jié)果針對(duì)l1反應(yīng)性進(jìn)行調(diào)節(jié)。結(jié)果表示為相對(duì)反應(yīng)性，即用目的抗原獲得的od與用參比抗原(＊)獲得的od之間的比值。使用針對(duì)構(gòu)象(c)表位和streptagii或l2暴露的單克隆抗體在天然條件下分析顆粒。用h16.v5(c)、針對(duì)streptagii序列的單克隆抗體和多克隆的hpv16l2抗血清分析hpv16l1stii和hpv16l1stiil2sa。使用hpv16l1vlp和l1l231vlp為對(duì)照。使用h31.f16(c)和多克隆的hpv16l2抗血清分析hpv31l1-16l213-88vlp。結(jié)果為兩個(gè)重復(fù)的平均值。

圖18描述了l2蛋白表達(dá)的western印跡分析圖。1)純化的l2sa融合蛋白，2)與l1stiivlp相互作用后和3)與l1vlp相互作用后；在用4)編碼gfp的hpv58假病毒和5)用編碼l2的hpv58假病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的cos-7細(xì)胞中。

圖19描述的圖表顯示hpv31、hpv58和hpv18中和性抗體的檢測(cè)。單個(gè)小鼠的中和效價(jià)為提供超過50％螢光素酶表達(dá)抑制的最后的倒數(shù)稀釋度。以標(biāo)尺條(bar)表示幾何平均效價(jià)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的一些方面涉及基于hpv顆粒的方法和組合物及其用于醫(yī)療和/或治療應(yīng)用的用途。在一些實(shí)施方案中，使用基于hpv的顆粒遞送一種或多種藥劑(例如，治療劑、成像劑和/或其他醫(yī)療劑)至靶細(xì)胞或組織(例如，粘膜組織，例如粘膜組織表面)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一些方面涉及含有一個(gè)或多個(gè)天然hpv表面蛋白(例如，l1和/或l2蛋白)的hpv顆粒，并且其載有一種或多種醫(yī)療和/或治療劑，或其二種或更多中的組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一些方面涉及含有一種或多種變體表面蛋白(例如，變體l1和/或l2蛋白)的以修飾hpv為基礎(chǔ)的顆粒，其在對(duì)象中具有降低的或改變的免疫原性。所述修飾可為氨基酸序列的改變，以減少或避免被宿主的免疫系統(tǒng)所中和。在一些實(shí)施方案中，基于修飾的hpv的顆粒是含有重組hpv蛋白(例如，重組l1和/或l2蛋白)的顆粒，包括改變?cè)摰鞍自趯?duì)象中(例如，在人類對(duì)象中)的免疫原性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變。在一些實(shí)施方案中，基于修飾的hpv的顆粒具有改變的免疫原性，但保留了包裝并遞送分子至宿主的能力。因此，本發(fā)明的修飾的hpv顆粒可載有一種或多種藥劑(例如，代替hpv核酸)?？蛇f送這種顆粒至對(duì)象，而不誘導(dǎo)可被天然hpv顆粒所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案可用于遞送一種或多種治療劑至患病組織(例如，患病的粘膜組織)。在一些實(shí)施方案中，患病的組織(例如，粘膜組織、上皮組織或上皮內(nèi)組織)可為感染的組織(例如，感染了病毒，例如hpv或hsv)。在一些實(shí)施方案中，所述粘膜組織是宮頸組織并且所述疾病是發(fā)育異?；虬?例如，子宮頸發(fā)育異常(cervicaldysplasia)，宮頸癌，例如與持續(xù)hpv感染相關(guān)的)。然而，在一些實(shí)施方案中，基于hpv的顆?？杀挥糜谶f送組合物至其他組織(例如，表皮)。在一些實(shí)施方案中，基于hpv的顆粒可被用于治療hpv。然而，在一些實(shí)施方案中，基于hpv的顆?？杀挥糜谶f送治療劑以治療其他疾病或狀況。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案被用于遞送一種或多種成像劑或造影劑至對(duì)象。例如，可遞送量子點(diǎn)、金屬和/或其他成像劑。在一些實(shí)施方案中，可使用藥劑來(lái)追蹤早期階段的疾病(例如，早期階段的轉(zhuǎn)移)。在一些實(shí)施方案中，可使用放射敏感劑來(lái)增強(qiáng)放射治療的作用。在一些實(shí)施方案中，可遞送藥劑以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在其膜上表達(dá)不同的受體或糖。例如，本發(fā)明的一些方面可被用于遞送藥劑，所述藥劑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中可增強(qiáng)免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤的信號(hào)的表達(dá)(例如，可使腫瘤細(xì)胞看起來(lái)更像細(xì)菌或病毒的藥劑)。在一些實(shí)施方案中，可遞送藥劑以阻斷腫瘤細(xì)胞對(duì)糖的攝取。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，可遞送根據(jù)本發(fā)明的一些方面的任何合適的治療和/或其他醫(yī)療劑。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一些方面涉及基于hpv的顆粒，所述顆粒被修飾以展示來(lái)自兩種或更多種不同天然hpv變體的表位。所述修飾的顆粒可用來(lái)提供針對(duì)任何兩種或更多種天然hpv變體感染的免疫。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一些方面涉及施用一種或多種用于治療應(yīng)用的不同hpv顆粒的方案。所述不同的hpv顆?？梢允遣煌膆pv變體、含有不同藥劑的基于hpv的顆粒和已在免疫原性方面經(jīng)修飾的hpv顆粒的任何組合。

在某些實(shí)施方案中，可使用hpv納米顆粒來(lái)將一種或多種治療劑遞送至粘膜細(xì)胞(例如，hpv感染的細(xì)胞)。在另一些實(shí)施方案中，可以使用改變的hpv納米顆粒來(lái)將一種或多種治療劑遞送至靶細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述改變的hpv納米顆粒在具有血清型特異性抗體的宿主中是免疫沉默的。例如，感染了第一hpv血清型(例如，hpv-16)的對(duì)象產(chǎn)生出針對(duì)該血清型的抗體。在這樣的對(duì)象中，具有第一血清型(例如，基于野生型hpv16的vlp)的病毒顆?？烧T導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答降低基于vlp的藥物遞送的效率。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)對(duì)象針對(duì)hpv進(jìn)行免疫(例如，用gardasil和cervarix)且所述對(duì)象已產(chǎn)生出針對(duì)第一和/或第二血清型(例如，hpv-16和hpv18)的中和性抗體。在這樣的對(duì)象中，具有所述第一和/或第二血清型的病毒顆粒(例如，基于野生型hpv-16和hpv18的vlp)可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答顯著降低基于vlp的藥物遞送的效率。

然而，可通過本文中所述的方法改變hpv納米顆粒，以使所述改變的hpv納米顆粒在宿主中不被所述第一血清型特異性抗體(例如，宿主中的hpv-16血清型特異性抗體)和/或宿主中所述第二血清型特異性抗體(例如，宿主中的hpv-18血清型特異性抗體)所識(shí)別。這種包含來(lái)自不同血清型的l1和/或l2蛋白的改變的hpv或hpv納米顆?？捎糜谥委?。例如，所述改變的hpv納米顆?；蚧诓煌逍偷膙lp可用于將一種或多種治療劑遞送至經(jīng)hpv免疫或hpv感染的宿主，而不誘導(dǎo)血清型特異性的免疫應(yīng)答和/或不被宿主應(yīng)答所中和，并且不失去效力。這種改變的hpv納米顆?；蚧诓煌逍偷膙lp可重復(fù)使用(例如，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)以遞送治療劑。在某些實(shí)施方案中，所述對(duì)象會(huì)產(chǎn)生出識(shí)別改變的hpv納米顆粒或基于不同血清型的vlp的新抗體。此外，未感染hpv的對(duì)象可產(chǎn)生針對(duì)基于以治療目的施用給對(duì)象的hpv顆粒血清型的免疫應(yīng)答。在這些情況下，可使用包含來(lái)自其他不同血清型的l1和/或l2蛋白的第二種不同的改變的hpv納米顆粒或第二hpv納米顆粒，以將治療劑繼續(xù)遞送至對(duì)象(例如，至hpv感染的細(xì)胞或者已被免疫接種針對(duì)hpv或用本發(fā)明的基于hpv的組合物治療的對(duì)象中細(xì)胞)，而不誘導(dǎo)針對(duì)初始的hpv血清型和第二種改變的hpv納米顆粒的特異性免疫應(yīng)答(例如，中和免疫應(yīng)答)。在對(duì)象產(chǎn)生出針對(duì)含有第二種l1和/或l2蛋白的第二種改變的hpv納米顆?；虻诙Nvlp的免疫應(yīng)答的情況下(或者為防止發(fā)生免疫應(yīng)答)，可使用含有第三種l1和/或l2蛋白的第三種改變的hpv納米顆?；虻谌Nvlp?？墒褂煤幸幌盗胁煌膌1和/或l2蛋白的一系列不同的改變的hpv納米顆粒和/或不同的lvp重復(fù)該過程幾次。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在對(duì)象中檢測(cè)針對(duì)所述第一套的免疫應(yīng)答時(shí)或在治療開始后的預(yù)定時(shí)間(例如，在施用第一組預(yù)定次數(shù)之后或預(yù)定時(shí)間之后)時(shí)第一組在對(duì)象中失去療效時(shí)，可從一組顆粒轉(zhuǎn)換到不同組的顆粒。

在某些實(shí)施方案中，根據(jù)hpv的基因型和/或血清型相似性來(lái)選擇基于不同血清型的vlp。在一些實(shí)施方案中，基于抗體的中和性交叉反應(yīng)性選擇基于不同血清型的vlp。在一些實(shí)施方案中，基于與已在對(duì)象中產(chǎn)生中和性抗體的第一和/或第二血清型相關(guān)性最遠(yuǎn)的不同血清型來(lái)選擇基于不同血清型的vlp。例如，hpv18與hpv45密切相關(guān)，并且表現(xiàn)出針對(duì)所述中和性抗體的高度交叉保護(hù)作用。hpv16與hpv31密切相關(guān)，并且表現(xiàn)出針對(duì)中和性抗體的高度交叉保護(hù)作用。hpv58與hpv16和hpv18的相關(guān)性更遠(yuǎn)，沒有或幾乎沒有觀察到中和性抗體的交叉保護(hù)作用。

因此，治療系列可涉及施用本發(fā)明的一系列vlp組合物(例如，含有一種或多種治療劑)，其中每種連續(xù)的vlp組合物均基于來(lái)自不同hpv血清型的vlp，例如，來(lái)自關(guān)系較遠(yuǎn)的血清型。例如，在針對(duì)hpv16和hpv18免疫接種的對(duì)象中，基于不同血清型的適宜vlp可以是包含來(lái)自野生型hpv58的l1和/或l2蛋白的顆粒。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，與已在對(duì)象中產(chǎn)生中和性抗體的所述第一和/或第二血清型關(guān)系很遠(yuǎn)的vlp可選自不是hpv的乳頭瘤病毒。在一些實(shí)施方案中，vlp可包含來(lái)自感染非人的哺乳動(dòng)物的乳頭瘤病毒的衣殼蛋白，例如，牛乳頭瘤病毒(bovinepapillomavirus，bvp)或棉尾兔乳頭瘤病毒(cottontailrabbitpapillomavirus，crvp)或shope乳頭瘤病毒。應(yīng)當(dāng)理解，治療系列可涉及基于不同hpv血清型和/或感染其他非人宿主的不同乳頭瘤病毒的一系列vlp。

可使用不同地改變的hpv納米顆?；虿煌逍偷膆pv納米顆粒來(lái)遞送治療劑，直到宿主產(chǎn)生出針對(duì)所述不同地改變的hpv納米顆?；虿煌逍偷膆pv納米顆粒的抗體。在某些實(shí)施方案中，使用上文中所述的方法，基于血清型差異和/或免疫應(yīng)答改變突變來(lái)改變vlp，可用治療劑對(duì)對(duì)象進(jìn)行多輪治療，而不會(huì)因?qū)ο蟮拿庖邞?yīng)答而失去遞送系統(tǒng)的效力。在一些實(shí)施方案中，這種方案允許重復(fù)或持續(xù)治療hpv感染和/或hpv相關(guān)癌癥，直到基本上全部hpv感染細(xì)胞被清除和/或已發(fā)生癌癥或病變的緩解(部分或完全)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，所述方案可用于重復(fù)或連續(xù)治療其他病癥。

在一些實(shí)施方案中，使用hpv疫苗(例如，可商購(gòu)的疫苗，例如gardasil和cervarix)對(duì)對(duì)象進(jìn)行疫苗接種。在這些實(shí)施方案中，所述免疫可保護(hù)對(duì)象免受疫苗所靶向的病毒的感染(例如，對(duì)象在疫苗接種后已產(chǎn)生針對(duì)其的免疫應(yīng)答的病毒)和發(fā)生這些疫苗特異性的病毒所引起的hpv相關(guān)疾病。然而，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)前可獲得的疫苗不會(huì)保護(hù)全部hpv基因型和/或血清型的感染。在一些實(shí)施方案中，hpv疫苗接種的對(duì)象會(huì)被不被所述疫苗所靶向的hpv(例如，高風(fēng)險(xiǎn)hpv)感染，例如，接種的對(duì)象尚未對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的那些。在一些實(shí)施方案中，所述疫苗接種的對(duì)象經(jīng)歷不同hpv類型感染的多次發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同的hpv類型感染，所述hpv類型感染并停留于所述對(duì)象的不同細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，被高風(fēng)險(xiǎn)hpv感染的已接種對(duì)象可發(fā)生由高風(fēng)險(xiǎn)hpv(所述接種患者尚未針對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答)引起的hpv相關(guān)疾病，例如，hpv相關(guān)發(fā)育異?；虬┌Y。在這些實(shí)施方案中，可利用本文中所述的vlp，使用本文中所述的方法來(lái)治療所述對(duì)象。

例如，用可商用疫苗之一免疫接種過的對(duì)象可產(chǎn)生針對(duì)hpv16和18的中和性抗體，并且還可產(chǎn)生針對(duì)hpv6和11的中和性抗體。該免疫接種的對(duì)象受到保護(hù)而不發(fā)生這些hpv類型(hpv16、18(癌癥)和hpv6、11(疣)所引起的宮頸前癌和/或生殖器疣。免疫接種后已產(chǎn)生針對(duì)hpv16和18的中和性抗體的對(duì)象可產(chǎn)生與其他hpv類型表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性的一些中和性抗體(例如，hpv31(針對(duì)hpv16產(chǎn)生的中和性抗體)和hpv45(針對(duì)hpv18產(chǎn)生的中和性抗體))。然而，免疫接種的對(duì)象仍然會(huì)易感其他高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型，因?yàn)閷?duì)象并不針對(duì)這些類型產(chǎn)生交叉中和性抗體(例如，hpv58等)?？筛腥舅雒庖呓臃N對(duì)象的其他高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型可以是例如hpv-33、hpv-35、hpv-39、hpv-51、hpv-52、hpv-56、hpv-59、hpv-68和hpv-69。如果所述免疫接種對(duì)象尚未產(chǎn)生出交叉中和性抗體，或者尚未產(chǎn)生出足夠特異性的交叉中和性抗體，或者尚未產(chǎn)生出足夠效價(jià)的交叉中和性抗體，則當(dāng)對(duì)象被一種或多種高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型(所述對(duì)象對(duì)其沒有產(chǎn)生足夠的保護(hù))感染時(shí)，所述免疫接種對(duì)象仍處于發(fā)生hpv相關(guān)疾病(例如發(fā)育異?；虬┌Y)的風(fēng)險(xiǎn)中。

在這樣的對(duì)象中，可給對(duì)象施用本文中所述的修飾的vlp或包含一種或多種治療劑(例如e7sirna)的不同(關(guān)系更遠(yuǎn)的)血清型(例如，基于hpv58的野生型vlp)的病毒顆粒，以治療對(duì)象的持續(xù)高風(fēng)險(xiǎn)hpv感染(所述對(duì)象對(duì)其沒有產(chǎn)生足夠的保護(hù))引發(fā)的早期階段疾病。在該實(shí)例中，所述治療使得可消除早期發(fā)育異常，并且額外地可對(duì)對(duì)象提供更廣泛的針對(duì)其他額外hpv類型感染的交叉保護(hù)。

在一些實(shí)施方案中，hpv納米顆粒包含病毒l1蛋白。在一些實(shí)施方案中，hpv納米顆粒包含病毒l1蛋白和病毒l2蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述l1和/或l2蛋白可以是野生型病毒蛋白。在一些實(shí)施方案中，l1和/或l2蛋白可通過突變和/或缺失而改變，從而所產(chǎn)生的l1和/或l2蛋白僅包含用于組裝納米顆粒的最“小”結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，l1和/或l2蛋白還可與提供額外功能的其他蛋白質(zhì)和/或肽相融合。這些其他蛋白可以是病毒或非病毒蛋白，并且在一些實(shí)施方案中，可以是例如宿主特異性或細(xì)胞類型特異性蛋白。應(yīng)當(dāng)理解，vlp可基于含有一個(gè)或多個(gè)重組蛋白或其片段(例如，一個(gè)或多個(gè)hpv膜和/或表面蛋白或其片段)的顆粒。在一些實(shí)施方案中，vlp可基于天然顆粒，所述顆粒被加工以整合本文中所述的一種或多種藥劑，但本發(fā)明的方面并不限于所述方面。在某些實(shí)施方案中，可使用包含一種或多種靶向肽的顆粒?？梢允褂胔pv蛋白或肽的其他組合，其作為本發(fā)明的一些方面，但本發(fā)明并不限于所述方面。

在一些實(shí)施方案中，通過突變、插入和缺失改變病毒野生型衣殼蛋白。迄今為止，所鑒定的全部構(gòu)象依賴性類型特異性表位都發(fā)現(xiàn)于高變環(huán)中的hpv-vlp表面上，所述高變環(huán)中的氨基酸序列在hpv類型間高度多樣化，其被稱為bc、de、ef、fg和hi環(huán)。多數(shù)中和性抗體是針對(duì)這些多變環(huán)上的表位產(chǎn)生的并且是類型特異性的，其具有有限的交叉反應(yīng)性、交叉中和和交叉保護(hù)作用。不同的hpv血清型誘導(dǎo)針對(duì)不同類型特異性表位和/或不同環(huán)的抗體。

本文中提供的方法將針對(duì)hpv特異性血清型而產(chǎn)生的抗體的有限交叉反應(yīng)性用于治療。在某些實(shí)施方案中，病毒衣殼蛋白、hpvl1和/或l2在位于一個(gè)或多個(gè)高變環(huán)和/或表面暴露的環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上，發(fā)生突變。在hpv血清型間不保守的環(huán)內(nèi)的氨基酸位置上發(fā)生所述突變。這些位置可以是完全不保守的，即在該位置上可以是任何氨基酸，或所述位置可以是保守的，僅可進(jìn)行保守氨基酸的改變。

可根據(jù)功能、化學(xué)或結(jié)構(gòu)方面的考慮因素來(lái)進(jìn)行保守氨基酸的改變。例如，可根據(jù)下述化學(xué)相似性進(jìn)行保守氨基酸的改變：酸性(d/e)、脂肪族(a/g/i/l/v)、酰胺(n/q)、芳香族(f/w/y)、堿性(r/h/k)、羥基(s/t)、亞胺基(p)、硫(c/m)；或功能相似性：酸性(d/e)、堿性(r/h/k)、疏水性(a/i/l/m/f/p/w/v)、極性(n/c/q/g/s/t/y)；或電荷相似性：酸性、堿性、中性；或結(jié)構(gòu)相似性：兼性(ambivalent)(a/c/g/p/s/t/w/y)、外部(r/n/d/q/e/h/k)、內(nèi)部(i/l/m/f/v)，其中括號(hào)中一組氨基酸中的任何氨基酸均可改變?yōu)楸窘M中的其他氨基酸，并且，根據(jù)所用的考慮因素(例如結(jié)構(gòu)、功能或化學(xué))，這樣的改變可被認(rèn)為是保守改變。在一些實(shí)施方案中，可考慮一種或多種因素。

在某些實(shí)施方案中，可在一個(gè)或多個(gè)環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)位置上引入氨基酸改變，所述改變?cè)谝粋€(gè)或多個(gè)氨基酸位置上和在一個(gè)或多個(gè)環(huán)中將一種血清型的野生型氨基酸序列改變?yōu)榭梢娪谄渌鹔pv血清型中的氨基酸序列。例如，如果血清型x的一個(gè)環(huán)的氨基酸序列是abcdefg，而在不同血清型y的相同環(huán)中的氨基酸序列是abhijg(其中abcdefg和abhijfg是不同的氨基酸序列)，那么ab和fg是保守的，而cde可能是突變的?？稍谘逍蛓的c或d或e，或者在cd或de或ce，或者在cde上引入突變。在這些實(shí)施方案中，c可突變?yōu)閔，d可突變?yōu)閕，并且e可突變?yōu)閖。在這些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)環(huán)可具有一種血清型的氨基酸序列(例如y)，而蛋白的其余部分和(未改變的環(huán))的其余部分是不同血清型的(例如x)。在這些實(shí)施方案中，僅一小部分的病毒衣殼蛋白突變。

表2顯示不同hpv類型的fg環(huán)比對(duì)的實(shí)例：

共有序列：

fvrhx1fnrx2gx3x4g(e/d)x5(v/i)px6dlx7ix8g(s/t)-gx9x10(a/g)

x11x12x13x14x15x16(f/y)(f/y)x17t

(seqidno：11)

表2中的例子顯示可在任何位置‘x’引入突變，并可在括號(hào)中標(biāo)記的任何位置引入保守突變，而保留相同的保守氨基酸(黑體)。根據(jù)表2中的例子，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對(duì)任何數(shù)目的hpv病毒的hpv序列對(duì)任何表面暴露的高變環(huán)進(jìn)行比對(duì)，并且使用公知的比對(duì)軟件得出保守氨基酸和不保守的氨基酸，而無(wú)需過多的實(shí)驗(yàn)。

在某些實(shí)施方案中，可對(duì)一個(gè)或多個(gè)氨基酸環(huán)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，將一種血清型的非保守野生型氨基酸改變?yōu)槠渌逍偷牡韧吧桶被?。例如，根?jù)表2的例子，hpv16的fg環(huán)的野生型氨基酸260位(l)可改變?yōu)?f)，其等同于hpv31261位的等同野生型氨基酸。此外，hpv16的fg環(huán)的野生型氨基酸的264位(a)可改變?yōu)?s)，其為hpv31265位的等同野生型氨基酸，等等。以這種方式，一種血清型的病毒衣殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)環(huán)(例如，hpv16的l1的fg環(huán))可改變，以或多或少精確模擬其他血清型相同病毒衣殼蛋白的環(huán)的氨基酸序列(例如，hpv31的l1的fg環(huán))，而保持衣殼蛋白的所有其他氨基酸為野生型(例如，hpv16的l1)。在一些實(shí)施方案中，以本文中所述的方式，將含有特異性血清型主要表位的一個(gè)或多個(gè)環(huán)的氨基酸改變?yōu)槲挥诓煌逍椭邢嗤h(huán)的等同位置處的氨基酸，降低了hpv感染個(gè)體的免疫系統(tǒng)的hpv特異性抗體對(duì)病毒顆粒的識(shí)別。在一些實(shí)施方案中，所述改變的hpv納米顆粒是免疫沉默的，并且不被hpv感染的對(duì)象所產(chǎn)生的針對(duì)hpv的hpv特異性抗體所識(shí)別。例如，以hpv16免疫接種或感染的對(duì)象產(chǎn)生hpv16特異性的抗體。如果所述免疫系統(tǒng)遇到包含源自hpv16的野生型l1蛋白的vlp，則將發(fā)生免疫應(yīng)答。然而，如果所述免疫系統(tǒng)遇到包含源自以本文中所述方法改變的hpv16的l1蛋白的vlp，則將不會(huì)(首先)發(fā)生hpv16特異性免疫應(yīng)答。用改變的vlp重復(fù)攻擊后，接受所述改變的vlp的對(duì)象會(huì)產(chǎn)生針對(duì)所述顆粒的新免疫應(yīng)答。在這種情況下，可使用不同地改變的vlp和/或來(lái)自其他血清型的vlp用于本文中所述的治療方法。

出乎意料的是，在一些實(shí)施方案中，在一種血清型的病毒衣殼蛋白的一個(gè)或多個(gè)環(huán)被改變以模擬其他血清型病毒衣殼蛋白的環(huán)的表位結(jié)構(gòu)的情況下，包含所述改變的衣殼蛋白的vlp不被針對(duì)兩種血清型中任一種的中和性抗體所識(shí)別。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，即使所述環(huán)(例如，fg環(huán))含有主要表位，所述血清型也是由病毒衣殼蛋白的其余部分的表位所決定的。當(dāng)僅有環(huán)被修飾而不改變病毒衣殼蛋白其余部分的序列時(shí)，獲得了新的血清型，其出乎意料地不被針對(duì)初始血清型(或當(dāng)所述環(huán)的序列從第一血清型的序列改變?yōu)榈诙逍偷男蛄袝r(shí)的血清型)的抗體所識(shí)別。在一些實(shí)施方案中，可改變一個(gè)或多個(gè)位置以產(chǎn)生新的血清型，同時(shí)保留包裝和遞送藥劑(例如核酸(如rna或dna)，例如重組核酸，例如本文中所述的治療性核酸)的能力。

在一些實(shí)施方案中，可改變fg環(huán)的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的一個(gè)或多個(gè)以產(chǎn)生新的血清型，所述血清型仍能夠包裝和遞送藥劑(例如，不同于hpv核酸的異源核酸(例如核酸如rna或dna，例如重組核酸，例如本文中所述的治療性核酸)。在一些實(shí)施方案中，第一l1蛋白的這些位置中的一個(gè)或多個(gè)從第一血清型的氨基酸改變?yōu)榈诙逍偷陌被?。例如，在一些?shí)施方案中，在所述第一(例如，hpv16)l1序列的情形下，x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的所有位置可從第一hpv血清型序列(例如，hpv16血清型序列)改變?yōu)榈诙pv血清型序列(例如，hpv31血清型序列)。在一些實(shí)施方案中，在所述第一(例如，hpv16)l1序列的情形下，僅x6、x11和x14從第一hpv血清型序列(例如，hpv16血清型序列)改變?yōu)榈诙pv血清型序列(例如，hpv31血清型序列)。在一些實(shí)施方案中，x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14的任何組合(例如，所述位置中的任何1、2、3、4、5、6或7個(gè))可從第一血清型的氨基酸改變?yōu)榈诙逍偷陌被幔桓淖僱1序列的其余部分。應(yīng)當(dāng)理解，所述第一和第二血清型可以是任何合適的血清型(例如，hpv16、hpv31、hpv33、hpv34、hpv35、hpv52、hpv58、hpv73、hpv91，或具有特異性fg環(huán)序列的任何其他血清型)。還應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，在l1序列或其部分未改變而保持包裝和遞送藥劑(例如，不同于天然hpv核酸的核酸，或本文中所述的任何其他藥劑)的能力的情況下，這些位置中的任何一個(gè)或多個(gè)可改變?yōu)槿魏伪Ｊ鼗虿槐Ｊ氐陌被?無(wú)論這種改變是否對(duì)應(yīng)于其他天然血清型的氨基酸)。

在一些實(shí)施方案中，仍可包裝和遞送藥劑的經(jīng)修飾hpv顆粒在l1蛋白的位置x16上沒有改變。例如，經(jīng)修飾的hpv16可在其他位置上具有一個(gè)或多個(gè)改變，但在位置x16上保留精氨酸。

應(yīng)當(dāng)理解，中和性mab的主要表位已在hpv血清型間不同的一個(gè)或多個(gè)環(huán)上被鑒定。例如，對(duì)于hpv11在de環(huán)中，對(duì)于hpv6在bc環(huán)和ef環(huán)中以及對(duì)于hpv33在bc、de和fg環(huán)中，對(duì)于hpv16在fg環(huán)中和對(duì)于hpv31在ef環(huán)(例如，如fleury等prot.sci.2009中所述)。使用本文中所述的策略，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可比對(duì)已表明包含主要表位的其他環(huán)的序列，以產(chǎn)生其它的經(jīng)修飾vlp。

還應(yīng)當(dāng)理解，在病毒衣殼蛋白中的任何氨基酸位置上(在一個(gè)或多個(gè)表面環(huán)中，在包含具有朝向內(nèi)部的基團(tuán)的氨基酸的位置上，或在衣殼蛋白中的任何其他位置上)，可進(jìn)行任何數(shù)目的氨基酸改變(突變、缺失、添加)，以修飾或改變免疫原性或者出于任何其他原因(例如，誘導(dǎo)或阻斷構(gòu)象改變、增加或降低帶電荷的氨基酸基團(tuán)、改變靶向、增加生物利用度、誘導(dǎo)特異性修飾以增加通過特異性施用途徑的吸收)，保持所述改變的衣殼蛋白形成vlp的能力，并且保持所得的vlp將治療劑轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的能力。

還應(yīng)當(dāng)理解，可按本文中教導(dǎo)的和本領(lǐng)域中已知的關(guān)于位于環(huán)中的線性和構(gòu)象表位的技術(shù)內(nèi)容引入氨基酸修飾。構(gòu)象表位可以是例如中和性抗體的識(shí)別位點(diǎn)，或者可以是對(duì)于細(xì)胞靶向而言有重要性的位點(diǎn)，或者可通過已經(jīng)鑒定的vlp協(xié)助進(jìn)入細(xì)胞(例如，如fleury等prot.sci.2009和sadeyen等virology，2002，309：32-40中所述，其內(nèi)容通過引用全文并入本文)?？筛鶕?jù)構(gòu)象表位來(lái)設(shè)計(jì)環(huán)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾，并且，除了非保守的氨基酸外，可包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸的修飾。

在一些實(shí)施方案中，可將氨基酸序列插入環(huán)中。例如，可將短氨基酸序列插入一個(gè)或多個(gè)表面暴露的環(huán)中。所述短氨基酸序列插入片段可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200或250個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，或4個(gè)氨基酸至250個(gè)氨基酸之間的任何長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，所述插入片段的長(zhǎng)度在4至50、5至25或5至15個(gè)氨基酸之間。所述插入片段可插入到環(huán)中的任何地方。在一些實(shí)施方案中，所述插入片段被插入到環(huán)的大致中間處。應(yīng)當(dāng)理解，如果已知某些環(huán)呈現(xiàn)某些基序，并且需要維持所述基序，則要將所述插入片段置于所述基序(無(wú)論是n端基序還是c端基序)之外。另外，如果需要破壞存在于某些環(huán)中的某些基序，則將所述插入片段置于所述基序中。所述基序可以是線性基序或結(jié)構(gòu)基序，即其可以是基于一級(jí)氨基酸序列或其二級(jí)(或三級(jí))結(jié)構(gòu)。所述基序可以是可促進(jìn)vlp攝取和/或靶細(xì)胞識(shí)別的細(xì)胞識(shí)別基序，或其可以是被某些抗體識(shí)別的表位，或其已知是抗原性的。在使用插入片段促進(jìn)靶向或細(xì)胞吸收的一些實(shí)施方案中，所述插入片段可包含例如病毒靶向結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)理解，這些結(jié)構(gòu)域不限于hpv。病毒靶向結(jié)構(gòu)域可源自靶向任何所需細(xì)胞的任何病毒。所述插入片段還可包含例如宿主特異性細(xì)胞識(shí)別基序，例如受體識(shí)別基序。在一些實(shí)施方案中，插入片段可包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含用作親和標(biāo)簽的表位，例如streptag^tm(stii，wshpqfek，seqidno：12)。

在一些實(shí)施方案中，使用插入片段來(lái)激發(fā)免疫應(yīng)答。在這些實(shí)施方案中，所述插入片段可包含病毒來(lái)源(例如，來(lái)自多種hpv血清型)的一個(gè)或多個(gè)表位(例如，多表位(polytope))。例如，可構(gòu)建包含多種hpv血清型l1蛋白抗原區(qū)(表位)的多表位，例如，hpv16、18、31、33和45。在一些實(shí)施方案中，可插入蛋白l2的區(qū)域。

在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)表位的插入將在對(duì)象中產(chǎn)生針對(duì)所述一個(gè)或多個(gè)表位的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答賦予針對(duì)病毒(例如hpv)再感染和/或病毒復(fù)育(例如，源自抗病毒治療后剩余的病毒)和/或病毒相關(guān)癌癥復(fù)發(fā)(例如，抗癌治療后源自剩余的病毒轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞)的保護(hù)。

在一些實(shí)施方案中，可將肽連接于vlp表面，以誘導(dǎo)改變的或增強(qiáng)的免疫應(yīng)答(例如，如果所述肽包含一個(gè)或多個(gè)表位)，或者以改變或增強(qiáng)vlp的靶向和/或細(xì)胞攝取(例如，如果所述肽包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞受體)。例如，所述vlp可具有白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)其通過血管的轉(zhuǎn)運(yùn)，或者具有肽的增強(qiáng)跨細(xì)胞作用(transcytosis)(例如，增強(qiáng)底部-頂部跨細(xì)胞作用的整合素結(jié)合(rgd)部分；硫酸肝素部分或其他部分)和/或受體特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以增強(qiáng)其被靶向細(xì)胞的吸收(例如egfr結(jié)合肽)，和/或增強(qiáng)內(nèi)體(endosome)和/或核轉(zhuǎn)運(yùn)的肽。

在一些實(shí)施方案中，可使用合適的接頭(linker)通過化學(xué)交聯(lián)連接所述肽，所述接頭例如戊二醛、亞氨酸酯和bs(peg)9、bs(peg)5、dtssp、edc、sm(peg)2、smcc和磺基smcc(sulfosmcc)(thermoscientific)。

在一些實(shí)施方案中，所述肽可通過親和力標(biāo)簽連接，例如streptagtm。

在一些實(shí)施方案中，所述肽為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。

在某些實(shí)施方案中，可重組地生產(chǎn)l1蛋白和l1+l2蛋白。在某些實(shí)施方案中，重組生產(chǎn)的l1蛋白和li+l2蛋白可自組裝形成病毒樣顆粒(vlp)。重組生產(chǎn)可發(fā)生于細(xì)菌、昆蟲、酵母或哺乳動(dòng)物宿主系統(tǒng)中。在所述宿主系統(tǒng)中，可表達(dá)l1蛋白或共表達(dá)l1+l2蛋白。

用于在宿主系統(tǒng)中表達(dá)和純化l1和l2重組病毒蛋白的方法，用于拆開和重新組裝hpv納米顆粒或vlp的方法，以及對(duì)l1和l2的氨基酸序列進(jìn)行修飾、將vlp給施用對(duì)象的實(shí)例，和包含vlp的藥物組合物，是本領(lǐng)域中公知的，并且在本文中教導(dǎo)。例如，美國(guó)專利no：6,416,945；6,991,795和7,205,126，其通過引用并入本文。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本文中提供的方法和模式并不限于上述美國(guó)專利中的描述。還可以采用本領(lǐng)域中已知的其他方法和模式。

在某些實(shí)施方案中，hpv納米顆?；騰lp載有一種或多種治療劑。如本文所述，可通過拆解和重新組裝l1或l1與l2病毒顆粒來(lái)加載hpv納米顆粒?？捎糜趨f(xié)助將病毒衣殼蛋白拆解/重新組裝為vlp的鹽包括zn、cu和ni、ru和fe鹽?？墒褂闷渌虞d方法，因?yàn)楸景l(fā)明不限于這一方面。在一些實(shí)施方案中，hpv納米顆粒可在于一種或多種治療劑。

在一些實(shí)施方案中，包含l1蛋白或l1與l2蛋白的hpv納米顆粒還包含一種或多種治療劑。在某些實(shí)施方案中，所述治療劑包含一種或多種sirna分子，或者一種或多種核酸(例如質(zhì)?；蚱渌d體)，其每一種均能夠表達(dá)一種或多種sirna分子。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑包含一種或多種反義核酸(例如anti-e6和/或anti-e7)、一種或多種核酸(例如質(zhì)?；蚱渌d體)，其每一種均能夠表達(dá)一種或多種反義核酸。在某些實(shí)施方案中，所述hpv納米顆粒包含兩種或更多種治療劑的組合。

在一些實(shí)施方案中，所述治療劑為rna干擾的誘導(dǎo)劑或基因沉默的其他誘導(dǎo)劑。rna干擾的誘導(dǎo)劑可以是sirna、shrna、雜交核酸分子，其包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含雙鏈核糖核酸(rna)分子，所述第二部分包含單鏈脫氧核酸(dna)分子、更長(zhǎng)的雙鏈rna或dna構(gòu)建體(用于表達(dá)sirna或更長(zhǎng)rna序列)?；虺聊钠渌T導(dǎo)劑包括dna甲基化誘導(dǎo)劑、或核酶、或適體(aptamer)。在另一些實(shí)施方案中，所述治療劑可以是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子，例如pna(肽核酸)。

rna干擾(rnainterference，rnai)是將雙鏈rna(doublestrandedrna，dsrna)引入細(xì)胞，以序列依賴的方式抑制翻譯后基因表達(dá)的過程。rnai可由短的(例如19至25個(gè)核苷酸)dsrna或小干擾rna(sirna)介導(dǎo)。在細(xì)胞中，dsrna被切割產(chǎn)生sirna，所述sirna被整合進(jìn)rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(rna-inducedsilencingcomplex，risc)中，引導(dǎo)所述復(fù)合物至同源的內(nèi)源性mrna，切割所述mrna轉(zhuǎn)錄本，并導(dǎo)致所述mrna的破壞。

為了在細(xì)胞中誘導(dǎo)rna干擾，可將dsrna作為分離的核酸片段或通過轉(zhuǎn)基因、質(zhì)?；虿《疽爰?xì)胞。在某些實(shí)施方案中，使用vlp將dsrna遞送至靶細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞中表達(dá)短發(fā)卡rna(shrna，shorthairpinrna)分子。shrna包含由小環(huán)序列分隔的短反向重復(fù)序列。一個(gè)反向重復(fù)序列與所述目標(biāo)基因互補(bǔ)。隨后，將shrna加工成為降解所述目標(biāo)基因mrna的sirna?？稍诰哂衐na構(gòu)建體的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)shrna，所述構(gòu)建體在rna聚合酶iii啟動(dòng)子(例如，人h1或7sk啟動(dòng)子)的控制下編碼所述shrna序列?；蛘?，可外源性合成shrna并直接引入細(xì)胞中，例如，通過vlp遞送。在某些實(shí)施方案中，shrna序列的長(zhǎng)度在40至100個(gè)堿基之間，或者長(zhǎng)度在40至70個(gè)堿基之間。所述發(fā)卡的莖(stemofthehairpin)為例如19至30個(gè)堿基對(duì)的長(zhǎng)度。所述莖可含有g(shù)-u配對(duì)，以穩(wěn)定所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

根據(jù)sirna序列與目標(biāo)基因的同源性來(lái)對(duì)其進(jìn)行選擇?？墒褂枚喾N程序，包括blast程序(altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-10)或bestfit(geneticscomputergroup，575sciencedrive，madison，wisconsin，usa，wisconsin53711)來(lái)確定兩個(gè)核苷酸序列之間的同源性。可使用fasta和fastp(見pearson&lipman，1988.methodsinenzymology183：63-98)進(jìn)行序列對(duì)比。sirna、shrna和/或mirna的設(shè)計(jì)工具和質(zhì)量是本領(lǐng)域中已知的。用于設(shè)計(jì)sirna序列和亂序sirna序列的基于網(wǎng)絡(luò)的在線軟件系統(tǒng)有例如sidirect、sisearch、seq2svm、deqor、sirnawizard(invivogen)?？墒褂美鐂pecificityserver，miracle來(lái)預(yù)測(cè)特異性?？捎美鏷usida(人sirna數(shù)據(jù)庫(kù)，humansirnadatabase)和sirnadb(sirna序列的數(shù)據(jù)庫(kù))來(lái)研究目標(biāo)序列?？稍谙嚓P(guān)序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行序列對(duì)比，或者可更優(yōu)選地在約10、15、20、25或30堿基的連續(xù)序列內(nèi)進(jìn)行對(duì)比。在某些實(shí)施方案中，sirna與所述目標(biāo)基因之間同源性的程度為至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或者至少99％或100％。所述sirna的長(zhǎng)度可在10bp至30bp之間，或者在20bp至25bp之間，或者所述sirna的長(zhǎng)度為20、21或22bp。

可通過用sirna轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞，繼之以目標(biāo)mrna的rt-pcr來(lái)檢測(cè)rnai的發(fā)生。其中在sirna誘導(dǎo)rnai時(shí)，與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中目標(biāo)mrna的水平將降低。可通過細(xì)胞裂解液的western印跡，繼之以用對(duì)目的蛋白有反應(yīng)性的抗體進(jìn)行探測(cè)來(lái)確證蛋白產(chǎn)生的降低。

在一些實(shí)施方案中，要沉默的基因是hpve6或e7基因。所述sirna序列可以是來(lái)自e6或e7基因序列中任何一個(gè)的10至30bp的任何連續(xù)序列，例如誘導(dǎo)rnai的hpv16或hpv18的序列?；蛘撸墒褂冒醋赃@些序列的連續(xù)序列的更長(zhǎng)dsrna片段，因?yàn)槠鋵⒃诩?xì)胞內(nèi)被切割形成sirna。

可使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)的固相或溶液相合成技術(shù)來(lái)合成sirna。可商業(yè)上獲得針對(duì)分別編碼hpv-16e6和hpv-18e6的mrna的合成sirna(例如，來(lái)自dharmaconresearch，lafayette，usa)。

在一些實(shí)施方案中，所述sirna在一端或兩端具有一個(gè)或多個(gè)脫氧胸苷堿基的突出端(overhang)，以通過降低對(duì)核酸酶降解的敏感性來(lái)增加所述sirna在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方案中，所述sirna為雜交的核酸分子，其包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含雙鏈核糖核酸(rna)分子，所述第二部分包含單鏈脫氧核酸(dna)分子。

核苷酸之間的連接可以是磷酸二酯鍵或替代物，例如如下分子式的連接基團(tuán)：p(o)s，(硫酯(thioate))；p(s)s，(二硫酯(dithioate))；p(o)nr′2；p(o)r′；p(o)or6；co；或conr′2，其中r是h(或鹽)或烷基(1-12c)，r6是通過-o-或-s-連接到鄰近核苷酸上的烷基(1-9c)。

除了天然堿基之外，還可以使用經(jīng)修飾的核苷酸堿基。例如，經(jīng)修飾的堿基可提高所述sirna分子的穩(wěn)定性，因而降低沉默所需的量。術(shù)語(yǔ)經(jīng)修飾的核苷酸堿基包括具有共價(jià)修飾的堿基和/或糖的核苷酸。例如，經(jīng)修飾的核苷酸包括含有糖的核苷酸，所述核苷酸共價(jià)連接至3’位置上的非羥基的低分子量有機(jī)基團(tuán)和至5’位置上的非磷酸基團(tuán)。因此，經(jīng)修飾的核苷酸還可包括2’取代的糖，例如2’-o-甲基-；2-o-烷基；2-o-烯丙基；2’-s-烷基-；2’-s-烯丙基-；2’-氟-；2’-鹵代-或2疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物a-異頭糖；差向異構(gòu)的糖，例如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。

經(jīng)修飾的核苷酸是本領(lǐng)域已知的，并且包括烷基化的嘌呤和嘧啶、乙?；泥堰屎袜奏ぃ约捌渌s環(huán)。這些類的嘧啶和嘌呤是本領(lǐng)域中已知的，并包括偽異胞嘧啶、n4，n4-乙胞嘧啶、8-羥基-n6-甲基腺嘌呤、4-乙?；奏?、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、n6-異戊基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、-d-甘露糖基q核苷(-d-mannosylqueosine)、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5甲氧基尿嘧啶、2甲硫基-n6-異戊基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、偽尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶5-氧基乙酸、q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5乙基胞嘧啶、5-丁基尿嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶和2，6，二氨基嘌呤、甲基偽尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基胞嘧啶。

在一些實(shí)施方案中，通過核酸序列(例如包含在本文中所述載體中的序列)的轉(zhuǎn)錄，可重組地制造sirna分子或更長(zhǎng)的dsrna分子。所述載體可以是任何rna或dna載體。

所述載體可以是表達(dá)載體，其中所述核苷酸序列可操作地連接至與細(xì)胞相容的啟動(dòng)子。適合在各種脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中使用的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。例如，合適的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子，例如哺乳動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄病毒，或dna病毒啟動(dòng)子，例如mlv、cmv、rsv、sv40iep(立即早期啟動(dòng)子)和腺病毒啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子。還可使用強(qiáng)哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。應(yīng)當(dāng)理解，還可使用基本保持相似轉(zhuǎn)錄活性的所述啟動(dòng)子的變體。

在一些實(shí)施方案中，所述載體可具有至少兩個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)指導(dǎo)dsrna有義鏈的表達(dá)，一個(gè)指導(dǎo)dsrna反義鏈的表達(dá)。在另一些實(shí)施方案中，可使用兩種載體，一種用于有義鏈，另一種用于反義鏈?；蛘?，所述載體可編碼形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的rna，其隨后被細(xì)胞切割產(chǎn)生dsrna。

所述核酸構(gòu)建體可含有基因表達(dá)的特異性的細(xì)胞的、病毒的或其他啟動(dòng)子或抑制子。所述啟動(dòng)子或抑制子可被設(shè)計(jì)用于反映其中引入了構(gòu)建體的細(xì)胞的環(huán)境。例如，所述構(gòu)建體可含有病毒啟動(dòng)子，因此，從所述構(gòu)建體的表達(dá)有賴于病毒蛋白的存在，從而所述構(gòu)建體僅在病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)。類似地，所述構(gòu)建體可具有某些細(xì)胞類型特異性的或某些發(fā)育階段特異性的啟動(dòng)子或抑制子。例如，在所述載體是用在病毒感染的細(xì)胞中的情況下，例如hpv感染的細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)使用與所述致病病毒相匹配的病毒啟動(dòng)子，例如hpv啟動(dòng)子(例如引起hpv16e6/e7表達(dá)的啟動(dòng)子)用于hpv感染的細(xì)胞。在這樣的實(shí)施方案中，載體將僅在病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)。

在某些實(shí)施方案中，sirna治療劑靶向促進(jìn)或介導(dǎo)細(xì)胞死亡或靶細(xì)胞凋亡的靶標(biāo)。在某些實(shí)施方案中，所述sirna治療劑靶向hpv病毒蛋白。在一些實(shí)施方案中，sirna分子所靶向的所述病毒蛋白是病毒e6和/或e7。已發(fā)現(xiàn)e6sirna強(qiáng)烈抑制病毒癌基因的表達(dá)，并且e6sirna表現(xiàn)出強(qiáng)效生長(zhǎng)抑制活性(yoshinouchi等，2003)。sirna產(chǎn)生的e7沉默誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡。不想受任何特別理論的限制，已描述合成的小干擾(smallinterfering，si)rna，特別是針對(duì)抗凋亡hpve7癌基因的sirna，在hpv陽(yáng)性癌細(xì)胞中恢復(fù)休眠的腫瘤抑制子途徑(否則其在e7存在下失活)，導(dǎo)致凋亡和細(xì)胞死亡。在一些實(shí)施方案中，sirna引起的e7沉默可足以導(dǎo)致感染的宿主細(xì)胞凋亡，而無(wú)需抑制e6(milner等)。描述了病毒e6和e7的sirna，例如在butz等(oncogene(2003)22，5938-5945)和milner等(專利申請(qǐng)0117359.0和0216929.0以及wo2005/051431)，其通過引用并入本文。

在某些實(shí)施方案中，hpv-16e6和hpv-18e6可特異性地被sirna所靶向。在某些實(shí)施方案中，hpv-16e6的各靶標(biāo)序列是

5′-uacaacaaaccguugugug(seqidno：13，377-395位核苷酸)。

在某些實(shí)施方案中，hpv-18e6的各靶標(biāo)序列是

5′-cuaacuaacacuggguuau(seqidno：14，381-399位核苷酸)(如butz等中所述)。

在另一些實(shí)施方案中，e6和e7sirna構(gòu)建體是：

e6(正向)：5′gagguauaugacuuugcuutt(seqidno：15)；

e6(反向)：ttcuccauauacugaaacgaa5′(seqidno：16)

和

e7(正向)：5′aggaggaugaaauagauggtt(seqidno：17)；

e7(反向)：ttuccuccuacuuuaucuacc5′(seqidno：18)

(如milne，wo2005/051431中所述)。

在另一些實(shí)施方案中，e6和e7shrna構(gòu)建體為：

表3

(如在bousarghin等，molcancerther，2009，8：357-365中所述，其通過引用并入本文)。

在某些實(shí)施方案中，組裝成hpv納米顆粒的病毒野生型蛋白(例如，l1和/或l1+l2)的氨基酸發(fā)生突變和/或替換和/或缺失。在某些實(shí)施方案中，這些氨基酸被修飾以增強(qiáng)vlp內(nèi)部的正電荷。在某些實(shí)施方案中，引入修飾以允許sirna分子與面向vlp內(nèi)部的一種或多種氨基酸更強(qiáng)的靜電相互作用和/或避免sirna漏出所述hpv納米顆粒。

核酸是高度帶電的并且不能通過自由擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜。此外，sirna的親水特征和陰離子骨架降低了其被細(xì)胞的攝取。在某些實(shí)施方案中，治療性抗病毒sirna可被遞送至施用了hpv納米顆粒的對(duì)象以增加sirna的細(xì)胞攝取(在體內(nèi)通過生物膜屏障)和/或生物利用度。

應(yīng)當(dāng)理解，包含僅促進(jìn)hpv感染細(xì)胞之凋亡的藥劑的vlp組合物在一些實(shí)施方案中特別有用，因?yàn)樗鼈儼邢虮籬pv感染的細(xì)胞(例如，vlp表面組分靶向天然感染的hpv所靶向的相同細(xì)胞類型)并遞送殺死所述hpv感染細(xì)胞的藥劑。在一些實(shí)施方案中，這些組合物可用于治療hpv感染。在一些實(shí)施方案中，不需要長(zhǎng)期治療，前提是施用合適的劑量(例如，單劑量或預(yù)定治療階段的療程，但不是長(zhǎng)期治療)來(lái)殺所述hpv感染的細(xì)胞。然而，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可能不足以殺全部的hpv感染細(xì)胞，并需要不只一個(gè)療程的治療和/或長(zhǎng)期治療。在一些實(shí)施方案中，可使用包含抗病毒劑(而不是促凋亡劑)的vlp組合物用于長(zhǎng)期治療。

在某些實(shí)施方案中，所述治療劑是抗癌劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗癌劑是吉西他濱。

在某些實(shí)施方案中，所述治療劑是化療劑，例如，甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、順鉑、不含糖的氯乙基亞硝基脲、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素c、博來(lái)霉素、多柔比星、達(dá)卡巴嗪、紫杉醇(taxol)、fragyline、葡甲銨gla、戊柔比星、卡莫司汀和聚苯丙生(poliferposan)、mmi270、bay12-9566、ras法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、mmp、mta/ly231514、ly264618/洛美曲索(lometexol)、glamolec、ci-994、tnp-470、和美新(hycamtin)/拓?fù)涮婵?、pkc412、伐司樸達(dá)(valspodar)/psc833、諾安托(novantrone)/米托蒽醌、metaret/蘇拉明(suramin)、巴馬司他、e7070、bch-4556、cs-682、9-ac、ag3340、ag3433、incel/vx-710、vx-853、zd0101、isi641、odn698、ta2516/馬立馬司他(marmistat)、bb2516/馬立馬司他(marmistat)、cdp845、d2163、pd183805、dx8951f、乳桿菌制劑(lemonal)dp2202、fk317、picibanil/ok-432、ad32/戊柔比星、metastron/鍶衍生物、temodal/替莫唑胺、evacet/脂質(zhì)體多柔比星、yewtaxan/紫杉醇、taxol/紫杉醇、xeload/卡培他濱、furtulon/脫氧氟尿苷(doxifluridine)、cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉烷(oraltaxoid)、spu-077/順鉑、hmr1275/夫拉平度(flavopiridol)、cp-358(774)/egfr、cp-609(754)/ras癌基因抑制劑、bms-182751/口服鉑類、uft(tegafur/尿嘧啶)、ergamisol/左旋咪唑、eniluracil/776c85/5fu增強(qiáng)劑、campto/左旋咪唑、camptosar/伊立替康、tumodex/雷替曲塞(ralitrexed)、leustatin/克拉立平(cladribine)、paxex/紫杉醇、doxil/脂質(zhì)體多柔比星、caelyx/脂質(zhì)體多柔比星、fludara/氟達(dá)拉濱、pharmarubicin/表柔比星、depocyt、zd1839、lu79553/雙萘亞胺(bis-naphtalimide)、lu103793/多拉司他汀(dolastain)、caetyx/脂質(zhì)體多柔比星、gemzar/吉西他濱、zd0473/anormed、ym116、碘粒(lodineseeds)、cdk4和cdk2抑制劑、parp抑制劑、d4809/dexifosamide、ifes/mesnex/ifosamide、vumon/替尼泊苷、paraplatin/卡鉑、plantinol/順鉑、vepeside/依托泊苷、zd9331、taxotere/多西紫杉醇(docetaxel)、阿糖鳥苷的前藥、紫杉烷類似物、亞硝基脲類、烷化劑例如美法侖(melphelan)和環(huán)磷酰胺、氨魯米特(aminoglutethimide)、天冬酰胺酶、白消安、卡鉑、苯丁酸氮芥、鹽酸阿糖胞苷、放線菌素d、鹽酸柔紅霉素、雌氮芥磷酸鈉、依托泊苷(vp16-213)、氟尿苷(floxuridine)、氟尿嘧啶(5-fu)、氟他胺、羥基脲(羥基尿素)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、干擾素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(lhrh-釋放因子類似物)、洛莫司汀(ccnu)、鹽酸氮芥(氮芥)、巰嘌呤、美司鈉、米托坦(o.p′-ddd)、鹽酸米托蒽醌、奧曲肽(octreotide)、光神霉素、鹽酸甲基芐肼、鏈脲霉素、檸檬酸他莫昔芬、硫鳥嘌呤、塞替派、硫酸長(zhǎng)春堿、安沙可林(amsrcrine(m-amsa))、阿扎胞苷、促紅細(xì)胞生成素(erthropoietin)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine，hmm)、白介素2、米托胍腙(mitoguazone)(甲基-gag；甲基乙二醛雙-丙咪腙；mgbg)、噴司他丁(pentostatin)(2’脫氧助間型霉素)、司莫司汀(semustine)(甲基-ccnu)、替尼泊苷(vm-26)或硫酸長(zhǎng)春地辛，但并不限于這些。

在某些實(shí)施方案中，所述治療劑是免疫治療劑，例如，ributaxin、赫賽汀(herceptin)、quadramet、panorex、idec-y2b8、bec2、c225、oncolym、smartm195、atragen、ovarex、百克沙(bexxar)、ldp-03、iort6、mdx-210、mdx-11、mdx-22、ov103、3622w94、抗vegf、賽尼哌(zenapax)、mdx-220、mdx-447、melimmune-2、melimmune-1、ceacide、pretarget、novomab-g2、tnt、gliomab-h、gni-250、emd-72000、lymphocide、cma676、monopharm-c、4b5、ioregf.r3、iorc5、babs、抗flk-2、mdx-260、anaab、smart1d10ab、smartabi364ab或immurait-cea，但不限于這些。

在某些實(shí)施方案中，所述治療劑為抗病毒劑?？共《緞┑膶?shí)例為：多硫酸鹽/酯(polysulfate，pvas)、多磺酸鹽/酯(polysulfonate，pvs)、多羧酸鹽/酯(polycarboxylate)、多金屬氧酸鹽/酯(polyoxometalates)、菊苣酸(chicoricacid)、津特韋(zintevir)、cosalane衍生物、雙環(huán)拉胺類(bicyclams)(即amd3100)、t-22、t-134、alx-40-4c、cgp-64222、tak-779、azt(疊氮胸苷)、ddi、ddc、d4t(二脫氫二脫氧胸苷)、3tc(3′-硫代二脫氧胸苷，3′-thiadideoxycytidine)、abc及其他ddn(2′，3′-二脫氧核苷酸)類似物、奈韋拉平、地拉夫定、依法韋侖、乙米韋林(mkc-442)、卡普韋林、對(duì)稱二苯硫脲(thiocarboxanilide)uc-781、阿昔洛韋、伐昔洛韋(valaciclovir)、噴西洛維、泛西洛維、溴乙烯去氧尿苷(bromovinyldeoxyuridine，bvdu，溴呋啶(brivudin))、西多福韋、阿德福韋二匹伏酯(adefovirdipivoxil)、替諾福韋二匹伏酯(tenofovirdisoproxil)、利巴韋林、伐昔洛韋、更昔洛韋、福米韋生、膦甲酸(foscarnet)、eicar(5-乙炔基-1-β-d-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺，5-ethynyl-1-β-d-ribofuranosylimidazole-4-carboxamide)、霉酚酸、neplanocina、3-deazaneplanocina、6′-c-methylneplanocina、dhcea(9-(反式-2′，反式-3′-二羥基環(huán)戊-4′-炔基)腺嘌呤，或c³dhcea((9-(反式-2′，反式-3′-二羥基環(huán)戊-4′-炔基)-3-脫氮雜腺嘌呤)，例如如declercqjpharmacolexpther2001，297：1-10中所述，其通過引用并入本文，但并不限于這些。

在一些實(shí)施方案中，本文中所述的rnai處理還包括用西多福韋(cidofovir)處理。西多福韋是用于治療例如hvp誘導(dǎo)的喉乳頭狀瘤病的抗病毒藥。西多福韋在宮頸癌細(xì)胞中也有活性。西多福韋可在基于vlp的rnai處理(例如，e6或e7特異性的sirna或shrna)之前、同時(shí)或之后施用。在一些實(shí)施方案中，西多福韋與rnai分子同時(shí)施用，并用本文中所述的vlp遞送。

其它的治療劑是例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，例如，絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑、ras/mapk抑制劑、胰島素生長(zhǎng)因子受體抑制劑、egfr和/或pdgfr抑制劑、抗血管生成劑如vegf和/或vegfr的抑制劑、parp調(diào)節(jié)劑和抑制劑、hedgehog通路抑制劑、與代謝通路的抑制相關(guān)的藥劑、β-干擾素、tdf或cprpmedap。

在某些實(shí)施方案中，以足以治療對(duì)象的量給對(duì)象施用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒。在某些實(shí)施方案中，用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒治療具有hpv感染的對(duì)象還包括施用抗癌劑和/或抗病毒劑。這些藥劑可同時(shí)或在不同時(shí)間共同施用，例如在施用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒之前或之后。

在某些實(shí)施方案中，將包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒表面施用給感染hpv的對(duì)象。表面施用可包括以合適的藥物組合物或制劑的形式施用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒。在某些實(shí)施方案中，所述適合表面施用的藥物組合物或制劑可以是凝膠或乳膏。在某些實(shí)施方案中，可將所述凝膠和乳膏施用于粘膜。

在某些實(shí)施方案中，將包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒施用于粘膜表面的上皮組織，例如，用于治療宮頸癌或結(jié)腸直腸癌。在這些實(shí)施方案中，包含hpv納米顆粒的藥物組合物還包含粘膜附著物質(zhì)，例如聚合物。粘膜附著物質(zhì)是粘著于體腔粘膜表面層或表面的任何制劑，所述表面包括胃腸道表皮的腔表面、結(jié)腸直腸上皮的腔表面和子宮頸的腔表面。粘膜上皮細(xì)胞層富含粘性分泌物(粘液)。粘膜附著聚合物具有附著至潮濕或濕潤(rùn)的粘膜組織表面的能力，所述表面例如結(jié)腸直腸上皮或子宮頸上皮的粘膜組織表面。

可使用多種聚合物來(lái)形成凝膠、乳膏或其他附著物質(zhì)，例如凝膠，如水凝膠、有機(jī)凝膠或熱可逆凝膠。其他可用的聚合物類型包括但不限于熱塑性塑料和膜。所述聚合物可以是例如，聚(環(huán)氧乙烷)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(丙烯酸)、聚(羥基乙基甲基丙烯酸酯)、羥乙基乙基纖維素、羥乙基纖維素和殼聚糖及其混合物、多糖(瓊脂)或羧甲基纖維素。在一些實(shí)施方案中，所述凝膠、乳膏或其他附著物質(zhì)可含有提供粘膜附著作用的其他物質(zhì)。這樣的材料包括二氧化鈦、二氧化硅和粘土。

可直接施用所述藥物組合物，例如作為凝膠施用，或其可被包含于預(yù)先組裝的貼劑或其他能使所述凝膠附著于所靶向的組織或細(xì)胞的裝置中(例如，如milner等wo2005/051431中所述)。例如，可采用附著于具有合適柔韌性的背襯層(例如，包含聚(氯乙烯)或羥丙基纖維素))以適應(yīng)子宮頸表面組織結(jié)構(gòu)的含有生物附著層或粘膜附著層的貼劑，以將包含治療劑和任選地額外治療劑(例如抗癌劑和/或抗病毒劑)的hpv納米顆粒治療性遞送至宮頸組織。所述貼片的物理特性應(yīng)當(dāng)理想地保持幾小時(shí)至一天或更多天，而不會(huì)使患者不適并且在正常的身體運(yùn)動(dòng)中不會(huì)移位。

在某些實(shí)施方案中，可以凝膠(例如，用于施用至所期望的靶區(qū)域的丙二醇甲基纖維素的制劑)的形式提供包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒。所述凝膠可提供在管中，例如50ma活性成分混懸于凝膠中。這些凝膠特別方便地用于施用于至皮膚或其他上皮表面(例如，子宮頸或肛門生殖器區(qū)域)。

在一些實(shí)施方案中，從長(zhǎng)的施用器管(例如直腸或陰道施用器)中釋放所述凝膠，例如將其進(jìn)行直腸或陰道內(nèi)應(yīng)用。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的組合物可以任何合適的形式施用，以到達(dá)hpv感染的細(xì)胞或其他靶細(xì)胞，因?yàn)楸景l(fā)明不限于這一方面。例如，可以以栓劑、膠囊劑、乳膏劑、凝膠劑、泡沫劑、噴霧劑、氣霧劑的形式提供本發(fā)明的組合物，和/或提供于材料的表面或浸漬于材料內(nèi)，所述材料可與目標(biāo)區(qū)域(例如，口腔、喉、子宮頸、陰道、肛門等)或其中兩種或更多種的任意組合相接觸。

在一些實(shí)施方案中，所述包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒還可以以乳膏或單晶或球丸(pellet)的形式施用，其可被施用于上皮表面或皮膚上，或者用16號(hào)套管針插入到上皮表面或皮膚內(nèi)用于短期治療。

應(yīng)當(dāng)理解，可將本發(fā)明組合物施用于感染有hpv的對(duì)象(例如，診斷或已知具有持續(xù)性高風(fēng)險(xiǎn)hpv感染的對(duì)象)，以治療發(fā)育異常或癌癥和/或防止發(fā)育異?；虬┌Y或其他與hpv感染相關(guān)疾病的發(fā)生。然而，在一些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的組合物施用(例如，預(yù)防性施用)給具有持續(xù)高風(fēng)險(xiǎn)hpv感染的對(duì)象，所述對(duì)象懷疑有被其他血清型高風(fēng)險(xiǎn)hpv感染的風(fēng)險(xiǎn)。

在將本文中所述組合物施用給個(gè)體的情況下，所述施用為“預(yù)防有效量”或“治療有效量”。根據(jù)需要施用最終組合物，其取決于所要治療的疾病和受影響面積的大小。例如，可以每天、每周或每月一次進(jìn)行施用。

術(shù)語(yǔ)組合物的“有效量”是指組合物單獨(dú)或與其它給藥一起實(shí)現(xiàn)所需生物學(xué)作用的必要量或足夠量。當(dāng)然，所需要的應(yīng)答取決于所要治療的具體疾病。結(jié)合本文中提供的教導(dǎo)，通過在多種活性化合物中選擇并權(quán)衡多種因素(例如，效力、相對(duì)生物利用度、患者體重、不良副作用的嚴(yán)重程度和優(yōu)選的施用方式)，可設(shè)計(jì)有效的預(yù)防性或治療性治療方案，所述方案不引起明顯毒性，但卻完全有效地治療所述具體對(duì)象。對(duì)于任何具體施用而言的有效量可根據(jù)所治療的疾病或不良狀況、對(duì)象體重或者疾病或不良狀況的嚴(yán)重程度等因素而改變。通常，優(yōu)選使用各個(gè)組份或其組合的最大劑量，即依據(jù)合理醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，出于醫(yī)療上的原因、心理學(xué)原因或任何實(shí)際其他原因，患者可能堅(jiān)持較低劑量或耐受劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗(yàn)確定有效量，而無(wú)需過多實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于本文中所述的任何化合物，可首先由動(dòng)物模型確定治療有效量。治療有效劑量還可由已知表現(xiàn)出類似藥理學(xué)活性的化合物的數(shù)據(jù)來(lái)確定，例如其他納米顆粒。可基于所施用化合物的相對(duì)生物利用度和效力來(lái)調(diào)節(jié)所施用的劑量。根據(jù)上文中所述方法和本領(lǐng)域中公知的其他方法調(diào)節(jié)所述劑量以達(dá)到最大效力是在普通技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的。

在某些實(shí)施方案中，提供了治療對(duì)象的方法。所述對(duì)象可以是任何哺乳動(dòng)物。當(dāng)用于不良狀況，例如病癥或疾病(例如癌癥、發(fā)育異?；蚰[瘤)時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指預(yù)防性治療(其增加對(duì)象對(duì)發(fā)生所述不良狀況的抵抗力，或者，換句話說(shuō)，降低所述患者發(fā)生所述不良狀況的可能性)以及在所述對(duì)象已經(jīng)發(fā)生所述不良狀況后針對(duì)所述疾病的治療，或阻止所述不良狀況的惡化。

在某些實(shí)施方案中，本文中所述的治療方法適合于任何hpv感染對(duì)象。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療生殖器疣和/或?qū)こｐ?verrucavulgaris)的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療早期發(fā)育異常、cin(ii、iii)和/或原位癌的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療宮頸癌和所有其他hpv相關(guān)發(fā)育異常(例如，唇癌、陰莖癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、頭頸癌或非黑素瘤皮膚癌)的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療hpv感染后繼發(fā)感染的方法，例如單純皰疹病毒感染。在某些實(shí)施方案中，所述對(duì)象是人。在某些實(shí)施方案中，所述對(duì)象為雌性。

類似地，本發(fā)明的一些方面涉及治療一種或多種組織(例如，唇、陰莖、口腔、陰道、子宮頸、皮膚或其他組織感染)的感染。

在某些實(shí)施方案中，在hpv感染的對(duì)象中，包含l1或者l1與l2并且還包含一種或多種治療劑的hpv納米顆?？砂邢蛴凶?yōu)榘┘?xì)胞可能的hpv感染細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，包含l1或者l1與l2并且還包含一種或多種治療劑的hpv納米顆?？砂邢騢pv感染的對(duì)象作為癌細(xì)胞的hpv感染細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，給感染有hpv的對(duì)象施用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒，在所述對(duì)象中殺死hpv感染的癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，給感染有hpv的對(duì)象施用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒，引發(fā)所述對(duì)象中hpv感染的癌細(xì)胞的凋亡。

宮頸癌通常隨時(shí)間緩慢發(fā)展。在子宮頸中出現(xiàn)癌之前，子宮頸細(xì)胞經(jīng)歷稱為發(fā)育異常的變化，其中不正常的細(xì)胞開始在宮頸組織中出現(xiàn)。隨后，癌細(xì)胞開始生長(zhǎng)并更深入擴(kuò)散進(jìn)子宮頸和周圍區(qū)域中。

提供了在需要治療的對(duì)象中進(jìn)行治療的方法。需要治療的對(duì)象優(yōu)選為有hpv感染的對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象處于感染的早期階段。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象表現(xiàn)出早期子宮頸發(fā)育異常。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象表現(xiàn)出cin。在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象表現(xiàn)出宮頸癌。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括以足以治療hpv感染的量將包含l1或l1與l2并且還包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒施用給hpv感染的對(duì)象。在某些實(shí)施方案中，將hpv納米顆粒表面施用于粘膜。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括施用抗癌劑和/或抗病毒劑。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種治療劑為sirna分子或sirna編碼分子。在某些實(shí)施方案中，所述sirna針對(duì)病毒e6和/或e7。在一些實(shí)施方案中，所述抗癌劑是吉西他濱。

在一些實(shí)施方案中，可使用vlp將抗癌劑至遞送患有癌癥的對(duì)象。

在某些實(shí)施方案中，可將所述包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒表面施用于上皮或其附近，所述上皮例如子宮頸上皮；或者表面施用于上皮病變處或其附近，所述病變例如宮頸癌或肛門上皮癌。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種治療劑為sirna分子或sirna編碼分子。

在一些實(shí)施方案中，所述包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒被置于用于上皮表面的表面用制劑中，例如，通過施用于惡性上皮，例如泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，例如肛門、陰道或子宮頸腫瘤，例如子宮頸cin。

在一些實(shí)施方案中，所述包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒制備成用于施用于上皮的表面制劑，例如，用于非黑素瘤皮膚癌的治療。

在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種治療劑為sirna分子或sirna編碼分子。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種hpv組合物或方法可與現(xiàn)有的用于hpv感染和/或?qū)m頸癌的治療聯(lián)合使用。例如，可在使用表4中概括的治療技術(shù)之前和/或之后使用本發(fā)明的治療方法和/或組合物。

表4概括了當(dāng)前用于cin治療的常見技術(shù)。

這些治療具有范圍在60至90％間的不同有效率。然而，所有這些治療都是侵入性的操作，其摘除或破壞宮頸組織并經(jīng)常伴有并發(fā)癥。

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制與持續(xù)的人乳頭瘤病毒感染密切相關(guān)(在zurhausen等中2002綜述)。乳頭瘤病毒是小的無(wú)包膜dna病毒，其二十面體衣殼由l1和l2蛋白構(gòu)成，所述衣殼包封約8kb的閉合環(huán)狀雙鏈dna。直徑為50至60nm的病毒衣殼含有72個(gè)l1大蛋白五聚體和12至72個(gè)的l2小衣殼蛋白拷貝。

包括類型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和hpv-69的15種hpv的亞群被指定為高風(fēng)險(xiǎn)。高風(fēng)險(xiǎn)hpv基因幾乎見于100％的宮頸癌組織樣品中(walboomers等，1999)。在這種特定癌癥的發(fā)生中，病毒基因組的整合和隨后兩個(gè)主要病毒癌基因(e6和e7)的表達(dá)被認(rèn)為是關(guān)鍵步驟。e6與p53腫瘤抑制蛋白結(jié)合，并將其靶向泛素介導(dǎo)的降解(münger和howley，2002)。p53指揮對(duì)多種應(yīng)激刺激(例如電離輻射或化學(xué)治療藥物所引起的遺傳毒性損傷)的細(xì)胞應(yīng)答。根據(jù)損傷的廣泛程度，p53的激活可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、dna修復(fù)機(jī)制的激活或細(xì)胞凋亡(vousden和lu，2002)。無(wú)功能的p53或p53不存在使得細(xì)胞分裂速率加快，并促進(jìn)遺傳不穩(wěn)定性，促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化(attardi，2005)。高風(fēng)險(xiǎn)人乳頭瘤病毒(hpv)的e6和e7mrna的恒定表達(dá)分別消除了53和prb的功能，并且是宮頸癌發(fā)生所必需的。

此外，hpv16與一小亞類的頭頸部腫瘤相關(guān)，主要是瓦爾代爾環(huán)(waldeyerring)的組織。已證明，頭頸部其他部位的惡性病變(包括口腔癌和食管癌)中存在一系列hpv類型，包括低風(fēng)險(xiǎn)hpv類型(devillers等)。

世界范圍內(nèi)，非黑素瘤皮膚癌(基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)是迄今白種人最常見的癌。這些癌癥主要發(fā)生于暴露于陽(yáng)光的部位，表明uv輻射是該疾病發(fā)病中的主要環(huán)境因素。此外，還與幾種遺傳學(xué)變化相關(guān)，包括細(xì)胞基因p53中的突變。β-乳頭瘤病毒屬中幾種hpv類型似乎與皮膚的鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)。這包括皮膚hpv類型(hpv20、hpv38和hpv27)，其被uv激活或抑制。

因此，本發(fā)明的一些方面可用于治療與hpv感染相關(guān)的除宮頸癌以外的其他疾病。例如，本發(fā)明的一些方面可用于治療hpv感染相關(guān)的頭頸癌(例如口腔癌和/或食管癌)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的基于hpv的顆粒可用作治療粘膜疾病或病癥(無(wú)論其是否是由hpv感染所引起的)的一般遞送載體。因此，可使用本發(fā)明的方法和組合物治療其他感染，例如hsv或hiv感染，和/或例如細(xì)菌感染，如陰道加德納菌(gardnerellavaginalis)、淋球菌(neisseriagonorrhoeae)；真菌感染，如白色念珠菌(candidaalbicans)感染；或寄生蟲感染，如寄生蟲陰道毛滴蟲(trichomonasvaginalis)；或生殖道中常見的其他感染。

在一些實(shí)施方案中，可使用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒來(lái)治療持續(xù)的高風(fēng)險(xiǎn)hpv感染、子宮頸發(fā)育異常、前癌病變cini，ii，iii(cin2/3，vin2/3)和/或原位癌。

在一些實(shí)施方案中，可使用包含一種或多種治療劑的hpv納米顆粒來(lái)治療生殖器疣、非黑素瘤皮膚癌、頭頸癌、口咽癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌和/或肛門癌。

根據(jù)治療部位，可將本發(fā)明的組合物施用給女性或男性對(duì)象。

在一些實(shí)施方案中，可使用包含基于hpv的vlp組合物將治療劑遞送至上皮細(xì)胞，例如皮膚。在一些實(shí)施方案中，可使用所述組合物治療革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌引起的表皮感染，所述細(xì)菌包括例如葡萄球菌(staphylococcus)、微球菌(micrococcus)和棒狀桿菌(corynebacterium)屬、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)以及化膿性鏈球菌(streptococcuspyogenes)，其引起例如皮膚疾病，如膿皰瘡(impetigo)和臁瘡(ecthyma)。在一些實(shí)施方案中，包含基于hpv的vlp的組合物可用于治療非黑素皮膚癌。

在一些實(shí)施方案中，如本文中所述，可全身施用(例如靜脈內(nèi)注射(i.v.))包含一種或多種治療劑的經(jīng)修飾hpv顆粒來(lái)治療腫瘤，例如卵巢癌、乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、頭頸癌、nsclc、sclc、膀胱癌或前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，如本文中所述，癌細(xì)胞呈示出hpvvlp和修飾的hpv顆粒的受體，可用于靶向這些癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，還可額外地改變經(jīng)修飾的hpv顆粒以呈示出腫瘤細(xì)胞特異性的靶向劑。

本發(fā)明的一些方面在其應(yīng)用上不限于在上文的說(shuō)明書中提出的，或者在實(shí)施例或附圖中舉例說(shuō)明的構(gòu)建細(xì)節(jié)和組成安排。本發(fā)明的一些方面能夠以多種方式實(shí)施其他實(shí)施或施行方案。另外，本文中使用的用語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)僅是為了說(shuō)明的目的，而不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制性的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其變化形式旨在包括其后列出的項(xiàng)目及其等同物以及額外的項(xiàng)目。

實(shí)施例

實(shí)施例1：包裝了hpv癌蛋白shrna的hpv-vlp對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

本研究的主要目的是構(gòu)建基于hpv的shrna表達(dá)系統(tǒng)并探究利用hpv介導(dǎo)的rna干擾進(jìn)行有效的e6和e7基因沉默。我們?cè)诖吮砻?，在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)e6和e7shrna的hpv假病毒顆粒導(dǎo)致e6和e7表達(dá)的消除和癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，提示hpvvlp可用于遞送編碼用于治療宮頸癌之shrna的質(zhì)粒。

材料和方法

細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在37℃下，在含有5％co2的加濕氣氛中，將人宮頸癌細(xì)胞系caski(atcccrl-150)和c33-a(atcchtb-31，美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection))培養(yǎng)于添加有10％fcs(invitrogen)、1％青霉素/鏈霉素和1％丙酮酸鈉的dmem中。用hpv-16轉(zhuǎn)染caski細(xì)胞并表達(dá)e6和e7，而c33-a細(xì)胞為hpv陰性。以hpv-16e6/e7癌蛋白和c-has-ras共轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞系tc1(atcccrl-2785)。這些細(xì)胞生長(zhǎng)于添加有2mmol/l非必需氨基酸和10％fcs的含有10mmol/lhepes、1mmol/l丙酮酸鈉的rpmi1640中。小鼠293ft細(xì)胞(invitrogen)源自293t細(xì)胞系(atcccrl11268)。其表達(dá)sv40大t抗原，并在500μg/ml遺傳霉素(invitrogen)存在下進(jìn)行培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞用胰酶消化并接種進(jìn)六孔板中。隨后使用lipofectamine2000(invitrogen)，用編碼shrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或用hpv-31假病毒顆粒或編碼shrna的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。收獲細(xì)胞，以在結(jié)果中標(biāo)出的不同時(shí)間進(jìn)行分析。

設(shè)計(jì)和生產(chǎn)表達(dá)e6和e7特異性shrna的質(zhì)粒

為生產(chǎn)pentr/u6進(jìn)入克隆(entryclone)，使用了block-itu6進(jìn)入載體(entryvector)。我們首先設(shè)計(jì)并合成了互補(bǔ)dna寡核苷酸(invitrogen)，每個(gè)含有定向克隆所必需的4個(gè)核苷酸突出端(overhang)。圖1b中描述了對(duì)應(yīng)于e6和e7shrna的互補(bǔ)序列。使用invitrogen的“shrnadesigner”軟件選擇e6-2和e7-2序列。e6-1和e7-1序列是jiang和milner(oncogene2002；21：6041-8)描述的序列。我們使用jiang和milner(oncogene2002；21：6041-8)所描述的lacz和對(duì)照shrna序列作為對(duì)照。用blast確認(rèn)了所有序列的特異性。

在95℃時(shí)，通過在退火緩沖液中孵育4分鐘，使等量的正向和反向鏈寡核苷酸退火生成雙鏈寡核苷酸。生成雙鏈寡核苷酸之后，將其連接進(jìn)入penter/u6載體(invitrogen)中。將所述質(zhì)粒測(cè)序、擴(kuò)增并使用qiagen質(zhì)粒小提試劑盒(qiagen，france)純化。將進(jìn)入克隆用于瞬時(shí)rna干擾分析。

生產(chǎn)表達(dá)e6和e7shrna的hpv假病毒顆粒hpv-引

在以重組桿狀病毒(baculovirus)轉(zhuǎn)染的sf21細(xì)胞中表達(dá)vlp，所述桿狀病毒編碼密碼子優(yōu)化的hpv-31l1和l2基因(fleury等，clinvaccineimmunol2008；15：172-5)。在27℃下孵育細(xì)胞72小時(shí)(touze等，nucleicacidsres1998；26：1317-23；bousarghin等，jclinmicrobiol2004；40：926-32)。離心收集細(xì)胞，將其重懸于含有0.5％np40的pbs中，并使其在室溫下靜置30分鐘。隨后，將細(xì)胞裂解液在4℃下以14,000×g離心15分鐘。將核酸級(jí)分進(jìn)一步重懸于pbs中并超聲處理。隨后將所述片段上樣至預(yù)制的氯化銫梯度的頂部并在beckmansw28轉(zhuǎn)子中平衡離心(24h，27,000rpm，4℃)。將l1陽(yáng)性級(jí)分合并于pbs中并離心(sw28轉(zhuǎn)子，3h，28,000rpm，4℃)。將vlp重懸在0.15mol/l的nacl中。

如前所述(touze等，nucleicacidsres1998；26：1317-23)，并做了一些修改，生成了假病毒顆粒。簡(jiǎn)而言之，在室溫下，將1μgofhpv-31vlp在含有20mmol/ldtt和1mmol/legta的50mmol/ltris-hcl緩沖液(ph7.5)中孵育30分鐘。在該階段，向破壞的vlp中添加編碼shrna、螢光素酶或綠色熒光蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(100ng)。隨后用有或沒有zncl2(10nmol/l)的cacl2不斷增加的濃度(最高達(dá)5mmol/l終濃度)稀釋該制備物。使用zncl2是因?yàn)閾?jù)報(bào)道zncl2可促進(jìn)hpv殼粒(capsomer)組裝成vlp(hanslip等，biotechnolprog2006；22：554-60)。隨后，將假病毒顆粒用1×pbs透析過夜，并在使用前存儲(chǔ)于4℃。

用電子顯微鏡分析殼粒、vlp和假病毒顆粒的存在。為此，將樣品應(yīng)用于碳包網(wǎng)格(carbon-coatedgrid)，用1.5％乙酸鈾酰(uranylacetate)負(fù)染色，并使用jeol1010電子顯微鏡在×50,000標(biāo)稱放大倍數(shù)下觀察。

生產(chǎn)表達(dá)e6和e7hrna的慢病毒

使用block-it慢病毒rna干擾表達(dá)系統(tǒng)(invitrogen)進(jìn)行慢病毒的生產(chǎn)。簡(jiǎn)而言之，進(jìn)行編碼e7shrna的pentr/u6質(zhì)粒和plenti6/block-itdest之間的lr重組反應(yīng)，生成plenti6/block-it-dest表達(dá)構(gòu)建體。通過使用lipofectamine2000(invitrogen)以9μg的virapowerpackagingmix和3μg的plenti6/block-it-dest表達(dá)質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)慢病毒。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。通過用系列稀釋的慢病毒感染tc1細(xì)胞來(lái)測(cè)定表達(dá)e7shrna的慢病毒的效價(jià)。所述慢病毒儲(chǔ)備液效價(jià)為1×10⁶tu/ml。通過將細(xì)胞進(jìn)行殺稻瘟菌素(10μg/ml)選擇來(lái)選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的tc1細(xì)胞。

通過逆轉(zhuǎn)錄pcr分析e6和e7mrna的水平

用1×pbs清洗shrna假病毒顆粒轉(zhuǎn)染的caski細(xì)胞(10⁶)，隨后根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用dynabeadsmrnadirect試劑盒(dynalfrancesa)分離mrna。在42℃下，在含有250μmol/l每種脫氧核苷三磷酸、5μmol/l寡核苷酸(dt)20、25單位的rna酶抑制劑和20單位的禽成髓細(xì)胞血癥(myeloblastosis)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(rochediagnostics)的1×孵育緩沖液中，通過逆轉(zhuǎn)錄1小時(shí)由mrna合成單鏈cdna。使用hpv-16e6、e7或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)特異性的正向和反向引物，對(duì)cdna樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增。使用的引物為

e6正向，5’caccaaaagagaactgcaatgt3’(seqidn0：31)；和反向，ttgctgttctaatgttgttcca(seqidn0：32)；e7正向，5’ggagatacacctacattgcatga3’(seqidno：33)；和反向ggggcacacaattcctagtg(seqidno：34)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶正向，5’acagtccatgccatcactgcc3’(seqidno：35)；和反向，5’gcctgcttcaccaccttcttg3’(seqidno：36)。在geneamp9700溫度循環(huán)器(pekinelmerappliedbiosystems，france)中，以200μmol/l的脫氧核苷酸三磷酸、2μmol/l的每種特異性引物和1單位taq聚合酶(invitrogen)進(jìn)行pcr，對(duì)于e7、e6和gapdh，程序分別為在50℃、55℃或62℃下進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。在2％的瓊脂糖凝膠上使pcr產(chǎn)物可視化并用geldoc系統(tǒng)(bio-rad)進(jìn)行分析。

p53的檢測(cè)

將細(xì)胞(2×10⁵)用pbs1×清洗，直接溶于50μlsds凝膠加樣緩沖液中，并在95℃下孵育10分鐘。將15微升每種樣品在12％sds-page凝膠上分離。將分離的蛋白電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上用于抗體檢測(cè)。使用單克隆抗體do-1(santacruzbiotechnologies)檢測(cè)人p53蛋白，并使用多克隆抗體(sigma)檢測(cè)內(nèi)源性β-肌動(dòng)蛋白。使用堿性磷酸酶綴合的抗小鼠igg抗體(sigma)，以硝基藍(lán)四氮唑(nitrobluetetrazolium)和磷酸溴氯吲哚(bromochloroindolylphosphate)(sigma)為底物使結(jié)合的抗體可視化。

β-半乳糖苷酶和螢光素酶活性的檢測(cè)

在用pbs1×清洗過并用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的pbs固定過的細(xì)胞中，用β-半乳糖苷酶質(zhì)粒和laczshrna轉(zhuǎn)染的caski、c33-a和tc1進(jìn)行β-半乳糖苷酶的檢測(cè)。室溫下10分鐘后，清洗細(xì)胞，并與β-半乳糖苷酶呈現(xiàn)溶液(β-galactosidaserevelationsolution)(2mmol/lmgcl2、4mmol/l亞鐵氰化鉀、4mmol/l鐵氰化鉀和1mg/mlx-gal)一起孵育。對(duì)顯示β-半乳糖苷酶活性的藍(lán)色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過發(fā)光檢測(cè)測(cè)量螢光素酶基因表達(dá)(螢火蟲螢光素酶測(cè)定試劑盒；interchim)。在10s范圍內(nèi)對(duì)發(fā)光進(jìn)行積分(victor2，wallac；perkin-elmer)，結(jié)果表示為計(jì)數(shù)/秒(cps)/孔。

細(xì)胞活力測(cè)定

將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用胰酶消化并隨后接種進(jìn)96孔板中。向加有100μl無(wú)fcs的dmem的細(xì)胞中加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(0.5mg/ml)并在37℃下孵育。2小時(shí)后，添加100μl異丙醇和0.4mmol/lhcl，并在540nm測(cè)量吸光度。細(xì)胞活力測(cè)定為測(cè)試孔中獲得的吸光度與未處理細(xì)胞中獲得的吸光度之間的比值。

細(xì)胞凋亡測(cè)定

使用抗ssdna/apostain(abcys)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。簡(jiǎn)而言之，用含有1μge6-1、e6-2、e7-1、e7-2shrna和對(duì)照shrna的10μg假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)在六孔板中的tc1細(xì)胞(2×10⁵個(gè))。轉(zhuǎn)染2天后，收獲上清液，將細(xì)胞用冰冷的乙醇固定。離心之后，室溫下將5×10⁵個(gè)固定的細(xì)胞重懸于250μl甲酰胺中5分鐘，隨后在75℃下孵育10分鐘。在該步驟后，添加2ml含有1％脫脂奶粉的pbs。15分鐘后，將細(xì)胞離心，并將濾餅重懸于100μl含有抗ssdna單克隆抗體f7-26的pbs中。在15分鐘的孵育和離心之后，將濾餅重懸于100μl含有熒光綴合的抗小鼠igm(20μg/ml，在pbs和1％脫脂奶粉中)的pbs中。孵育15分鐘后，將細(xì)胞清洗、離心并重懸于500μl含有1μg/ml碘化丙錠的pbs中。用小鼠igm而不是特異性的一抗處理陰性對(duì)照。隨后使用coulterxl流式細(xì)胞儀并利用expo32軟件(beckmancoulter，france)分析細(xì)胞。

還使用caspase-glo3/7檢測(cè)試劑盒(promega)研究了細(xì)胞凋亡。如前所述，利用不同shrna轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后兩天，將2×10⁵個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至白色壁的96孔板(perkin-elmer)的每個(gè)孔中，并添加100μl半胱天冬酶(caspase)發(fā)光底物。室溫孵育1小時(shí)后，在luminoscanascent發(fā)光儀(thermoelectron)上讀取板的發(fā)光。

小鼠模型中抗腫瘤作用的評(píng)價(jià)

為了研究e6和e7shrna假病毒對(duì)tc1細(xì)胞致瘤性的作用，給6組(5只小鼠/組)6周齡的雌性c57bl6小鼠(cerj，legeneststisle，france)皮下接種tc1細(xì)胞(2×10⁵個(gè))。在施用于小鼠之前，用假病毒顆粒(10μgvlp/1μge6-1或e7-1shrna)、用編碼e7-1shrna的慢病毒(復(fù)數(shù)感染，50)或使用含有l(wèi)ipofectamine的1μge7-1shrna轉(zhuǎn)染tc1細(xì)胞。對(duì)照組接受未處理的tc1細(xì)胞(模擬組)，而一個(gè)對(duì)照組接受hpvvlp處理的tc1細(xì)胞。3周之后，處死小鼠，切除腫瘤并稱重。

還在具有tc1細(xì)胞腫瘤的小鼠中研究了編碼e7shrna的假病毒顆粒的抗腫瘤效力。用tc1細(xì)胞(2×10⁵)皮下(s.c.)接種兩組(10只小鼠/組)6周齡的雌性c57bl6小鼠。接種后七天，全部小鼠中均已形成明顯的腫瘤，以20μgvlp/2μge7-1或20μgvlp/2μg對(duì)照shrna的劑量，將含有shrna的假病毒顆粒直接注射進(jìn)每個(gè)腫瘤中，每2天一次，注射2周。3周后，處死小鼠，取出腫瘤并稱重。所有動(dòng)物研究都經(jīng)過地區(qū)動(dòng)物倫理委員會(huì)(regionalanimalethicscommittee，creea)的批準(zhǔn)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為均值±se。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05認(rèn)為是有顯著性。

結(jié)果

設(shè)計(jì)導(dǎo)向hpv-16的e6和e7蛋白的shrna

設(shè)計(jì)6個(gè)序列以促進(jìn)特異性的沉默。這些序列中的兩個(gè)，即sie6-1(138-159)和sie7-1(101-119)已經(jīng)作為sirna在jiang和milner(oncogene2002；21：6041-8)中描述，分別對(duì)應(yīng)于e6和e7的兩個(gè)其他序列sie6-2(421-441)和sie7-2(148-167)是通過使用invitrogenshrna設(shè)計(jì)器軟件選擇的，并且兩個(gè)序列(laczshrna和jiang的對(duì)照shrna)用作對(duì)照(圖1和表3)。將這些序列退火并插入pentr/u6中。

為了研究假病毒顆粒系統(tǒng)用于遞送shrna的有效性，使用或不使用編碼laczshrna的pentr/u6lacz質(zhì)粒，用編碼h半乳糖苷酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染tc1、caski和c33-a細(xì)胞。在laczshrna存在下，在所研究的全部細(xì)胞系中均觀察到了h-半乳糖苷酶表達(dá)的降低，在tc1、caski和c33-a細(xì)胞中分別為80％、83％和81％抑制。

在zncl2存在下通過將l1殼粒組裝成vlp來(lái)生產(chǎn)編碼shrna的假病毒顆粒

使用hpvvlp來(lái)包封編碼e6和e7shrna的質(zhì)粒。為了生成這些假病毒，我們使用了前述的拆解-重新組裝法，只是在重新組裝過程中添加了zncl2作為修改。簡(jiǎn)而言之，在含有egta和dtt的緩沖液中孵育純化的vlp，在這些條件下，vlp完全解體為組裝成殼粒的結(jié)構(gòu)。隨后添加e7-1shrna質(zhì)粒，并在有或沒有zncl2(10nmol/l)存在下，用含有1％dmso和5mmol/lcacl2的緩沖液稀釋該制備物，以重新折疊所述vlp。zncl2的存在促進(jìn)了顆粒重新組裝為類似假病毒顆粒的結(jié)構(gòu)。在zncl2存在下，所述殼粒還組裝成為直徑為24nm的管狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度從120至280nm不等。通過比較使用或不使用zncl2所獲得的所述假病毒顆粒制備物轉(zhuǎn)導(dǎo)293ft細(xì)胞的能力來(lái)評(píng)價(jià)zncl2在生產(chǎn)含有編碼螢光素酶之質(zhì)粒的假病毒顆粒中的作用。在zncl2存在下生成的假病毒顆粒獲得了9,981cps的螢光素酶活性，而沒有zncl2時(shí)獲得的假病毒顆粒則為僅845cps。因此，當(dāng)l1顆粒在zncl2存在下重新組裝進(jìn)vlp時(shí)，觀察到了螢光素酶活性增加了12倍(圖2)。此外，研究了所述hpv假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)caski、c33-a和tc1細(xì)胞的能力。該假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)了所研究的全部細(xì)胞系(圖2)。然而，與在caski細(xì)胞(5,232cps)或c33細(xì)胞(4,016cps)中的相比，在tc1細(xì)胞(7,990cps，計(jì)數(shù)每秒，countspersecond)中觀察到了更高水平的螢光素酶表達(dá)。在不存在假病毒顆粒時(shí)，在293ft、tc1、caski和c33細(xì)胞中觀察到的螢光素酶活性分別為57、84、51和41cps。

e6和e7shrna假病毒顆粒對(duì)caski細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)了基因沉默和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的提高

使用含有編碼綠色熒光蛋白之質(zhì)粒的假病毒顆粒來(lái)研究假病毒顆粒在細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移的效力。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到80％的tc1細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(未顯示數(shù)據(jù))。通過測(cè)定其干擾蛋白質(zhì)表達(dá)的能力，我們?cè)u(píng)價(jià)了e6和e7shrna的效力。為此，我們首先通過逆轉(zhuǎn)錄pcr獲得了e6和e7的全長(zhǎng)cdna(以及作為對(duì)照的gapdh)。結(jié)果顯示，在針對(duì)e7的shrna存在時(shí)，e7mrna降低，jiang的序列獲得了高水平的干擾，而e7-2序列觀察到了較低水平的降低，對(duì)照shrna沒有降低(圖3a)。在用e6shrna處理的細(xì)胞中檢測(cè)e6mrna獲得了類似的結(jié)果。當(dāng)用e7shrna處理細(xì)胞時(shí)，觀察到了e6mrna的輕微降低。

由于e6在caski細(xì)胞中的表達(dá)水平太低，以至于不能如gu等(cancergenether2006；13：1023-27)和yamato等(cancergenether2008；15：140-53)所報(bào)道的那樣使用可獲得的抗體通過western印跡分析進(jìn)行檢測(cè)，因此根據(jù)e6shrna恢復(fù)p53表達(dá)的能力對(duì)其活性進(jìn)行了篩選。我們的結(jié)果表明，在表達(dá)e6-1shrna24小時(shí)后，western印跡所檢測(cè)的p53水平增加(圖3b)，并隨時(shí)間而降低。在e7-1、e7-2和e6-2shrna存在下，p53表達(dá)的增加低于e6-1shrna中觀察到的增加。當(dāng)用laczshrna處理細(xì)胞時(shí)，未檢出p53的表達(dá)。這些結(jié)果提示，通過shrna處理，e6蛋白水平降低，并且p53不僅積累，并且在功能上還是有活性的。

為了驗(yàn)證e6和e7表達(dá)的抑制是否可誘導(dǎo)細(xì)胞活力的降低，培養(yǎng)5天后，在shrna轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的caski和tc1細(xì)胞中，使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基、)-2，5-二苯基四唑溴化物測(cè)試測(cè)量540nm的吸光度。我們的結(jié)果顯示，e6和e7沉默誘導(dǎo)細(xì)胞活力的降低(圖4)。該降低對(duì)e7shrna來(lái)說(shuō)更大(70％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制)。當(dāng)用相同的shrna轉(zhuǎn)染hpv陰性的子宮頸細(xì)胞(例如c33-a)時(shí)，未觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，表明e6和e7shrna引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制是特異性的。對(duì)于e6-1和e6-2，以及對(duì)于e7-1和e7-2shrna而言，細(xì)胞生長(zhǎng)的降低是相似的。

用e6和e7shrna假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)tc1細(xì)胞未誘導(dǎo)凋亡

基于凋亡細(xì)胞中dna對(duì)熱變性敏感度的增加來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定，以研究細(xì)胞死亡是否是由于細(xì)胞凋亡所引起的。在該測(cè)定中，通過在甲酰胺存在下加熱使dna變性，并用ssdna特異性的單克隆抗體f7-26染色。與對(duì)照shrna轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，流式細(xì)胞術(shù)未顯示e6-1、e6-2、e7-1和e7-2shrna轉(zhuǎn)染的tc1細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)目的顯著增加。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)凋亡的存在或不存在，在e6和e7shrna假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的tc1細(xì)胞中進(jìn)行了測(cè)量半胱天冬酶(caspase)3和7酶活性的半胱天冬酶測(cè)定。在使用e6和e7shrna時(shí)都沒有觀察到半胱天冬酶活性的增加。該結(jié)果提示，e6和e7shrna誘導(dǎo)tc1細(xì)胞生長(zhǎng)的降低，但這不是通過凋亡性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的。

用e6和e7shrna假病毒顆粒體外轉(zhuǎn)染tc1細(xì)胞在小鼠中誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)的降低

還使用tc1/小鼠模型體內(nèi)研究了e6和e7shrna假病毒顆粒的效力。使用編碼e6-1和e7-1shrna的hpv假病毒顆粒、單獨(dú)的hpvvlp和編碼e7-1shrna的慢病毒體外轉(zhuǎn)導(dǎo)tc1細(xì)胞。24小時(shí)之后，皮下注射未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染的tc1細(xì)胞進(jìn)c57bl6小鼠中。

21天后，處死小鼠，切除腫瘤并稱重。在對(duì)照小鼠中(模擬組和單獨(dú)vlp組)，腫瘤重量的范圍是1.09至2.12g(均值，1.64g)。對(duì)于用e7-1shrna和lipofectamine轉(zhuǎn)染的tc1細(xì)胞，未觀察到腫瘤重量的降低(均值，1.61g)。對(duì)于e6-1hpv假病毒顆粒，觀察到了平均腫瘤重量降低42％(p＜0.10)，對(duì)于e7-1慢病毒和e7-1hpv假病毒顆粒，平均大小分別降低70％至80％(p＜0.05和p＜0.001；圖5)。

在小鼠中用e7shrna假病毒顆粒瘤內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)tc1細(xì)胞腫瘤誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)摩低

還研究了編碼e7shrna的假病毒顆粒的體內(nèi)效力，以確定其在帶有tc1細(xì)胞腫瘤的小鼠中降低腫瘤生長(zhǎng)的能力。根據(jù)其體外效力，選擇e7-1shrna用于這些研究。將e7-1shrna假病毒顆粒直接注射進(jìn)腫瘤中，每2天一次，共2周。1周之后，與對(duì)照小鼠相比，在e7-1shrna處理的小鼠中未觀察到腫瘤生長(zhǎng)的降低(圖6a)。隨后，在處理的第二周，清楚地觀察到了腫瘤生長(zhǎng)的降低，在第二周結(jié)束時(shí)，在用對(duì)照shrna處理的小鼠中平均腫瘤重量為1.05g，而在用e7-1shrna假病毒顆粒處理的小鼠中為0.49g(p＝0.045)。

實(shí)施例2：在hpv31大殼粒蛋白上的中和構(gòu)象表位的鑒定和功能意義

本研究的主要目的是表征hpv31假病毒顆粒中和的抗原結(jié)構(gòu)與機(jī)制。其中一個(gè)問題是誘導(dǎo)hpv中和性抗體的精確表位位置，以及由于與病毒殼粒相互作用而對(duì)抗感染保護(hù)作用的貢獻(xiàn)。

現(xiàn)已公認(rèn)，構(gòu)象表位決定中和性抗體的產(chǎn)生(christensen等，virology1994；205：329-35；rose等，jgenvirol1994；75：2075-79；white等，jvirol1998；72：959-64；white等jvirol1999；73：4882-89；giroglou等jvirol2001；75：1565-70)。因?yàn)閔pv的中和表位是構(gòu)象依賴性的，所以其氨基酸組成和表面位置還未被完全表征。

這些研究可用于疫苗設(shè)計(jì)和病毒-細(xì)胞相互作用。此外，對(duì)hpv抗原結(jié)構(gòu)的理解對(duì)于設(shè)計(jì)來(lái)源于hpv的、具有降低的免疫原性的基因治療載體而言是至關(guān)重要的。生成這樣載體的一個(gè)先決條件是對(duì)激發(fā)中和免疫應(yīng)答的病毒決定簇的更多理解，以設(shè)計(jì)假病毒顆粒載體，所述載體在其負(fù)責(zé)產(chǎn)生中和性抗體的構(gòu)象表位中具有缺失或突變。這些具有降低的免疫原性的突變載體允許再施用這些載體時(shí)，不會(huì)因?yàn)檎T導(dǎo)了針對(duì)所述載體的中和性抗體而引起顯著的轉(zhuǎn)基因效力損失。

材料和方法

hpv31單克隆抗體

如前所述生產(chǎn)和表征本研究中使用的hpv31mab(fleury等，archvirol2006；151：1511-23；fleury等，clinvaccineimmunol2008；15：172-75)。h31.d24mab識(shí)別已在fg環(huán)(271-279位氨基酸)中鑒定的共有線性表位，而h31.f7mab識(shí)別已在fg環(huán)的n末端部分中鑒定的構(gòu)象交叉中和表位(crossneutralizingepitope)(fleury等，archvirol2006；151∶1511-23)。13種其他mab識(shí)別特異性的構(gòu)象中和表位。此外，使用camvir-1單克隆抗體(cv)作為對(duì)照，所述抗體識(shí)別de環(huán)上的共有線性表位(carpentier等，jmedvirol2005；77：558-65)。通過用硫酸銨(33％終濃度)鹽析，隨后用磷酸緩沖鹽(pbs，phosphate-bufferedsaline)透析，繼之以蛋白ag/瓊脂糖凝膠(pierce；免疫純igg純化試劑盒)親和層析，使用細(xì)菌細(xì)胞表面展示法(bacterialcellsurfacedisplaymethod)從未加工的腹水中純化所研究的mab。

假病毒的中和

如前確定每種單克隆抗體的中和能力(fleury等，archvirol2006；151：1511-23；fleury等，clinvaccineimmunol2008；15：172-5)。此外，我們研究了假病毒顆粒細(xì)胞表面結(jié)合之前或之后是否發(fā)生中和。用293ft細(xì)胞中產(chǎn)生的hpv31假病毒顆粒進(jìn)行了測(cè)試，并且使用在完全dulbecco’s改良eagle’s培養(yǎng)基(invitrogen，補(bǔ)充有10％fcs、100iu/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem)中培養(yǎng)的、接種于96孔板中的并且在37℃下孵育24小時(shí)的cos-7細(xì)胞進(jìn)行中和測(cè)定。通過在37℃下將預(yù)先與mab一起孵育過的hpv31假病毒顆粒加入到細(xì)胞(100μl)中1小時(shí)來(lái)進(jìn)行假病毒顆粒細(xì)胞表面結(jié)合之前的測(cè)量中和的測(cè)定。通過在37℃下將hpv31假病毒顆粒加入到cos-7細(xì)胞中1小時(shí)來(lái)進(jìn)行假病毒顆粒細(xì)胞表面結(jié)合之后的測(cè)量中和的測(cè)定。清洗三次以除去未結(jié)合的假病毒顆粒后，將mab添加到100μldmem中。對(duì)于每個(gè)測(cè)定而言，在37℃下3小時(shí)后除去上清液，并添加200μl完全dmem。37℃下進(jìn)一步孵育48小時(shí)之后，通過使用螢火蟲螢光素酶測(cè)定試劑盒(interchim，montlucon，france)測(cè)量轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所表達(dá)的螢光素酶來(lái)對(duì)感染性進(jìn)行評(píng)分，使用多掃描微板發(fā)光計(jì)(thermo-fisherscientific，courtaboeuf，france)對(duì)螢光素酶表達(dá)進(jìn)行定量。如果螢光素酶活性降低＞80％，則認(rèn)為mab是中和性的。如果mab僅在病毒顆粒結(jié)合至細(xì)胞之前添加時(shí)中和假病毒，則對(duì)假病毒與細(xì)胞結(jié)合的抑制進(jìn)行評(píng)分。如果抗體在其添加至cos-7細(xì)胞之前和之后中和假病毒顆粒，則認(rèn)為mab通過細(xì)胞附著后機(jī)制(postcellattachmentmechanism)中和假病毒顆粒。

重組l1蛋白的生成和vlp的純化

使用bac-to-bac系統(tǒng)(invitrogen，fisher-scientific，illkirch，france)，在草地夜蛾(spodopterafrugiperla)(st21)細(xì)胞中表達(dá)hpvl1蛋白。預(yù)先生成了編碼hpv16、hpv31、hpv16dc9和hpv16dc31(分別具有9或31個(gè)氨基酸c末端缺失)的l1基因的桿狀病毒(baculovirus)(touze等，femsmicrobiollett2000；189：121-7；touze等，jclinmicrobiol1998；36：2046-51)。用pcr從全長(zhǎng)hpv31l1密碼子優(yōu)化的基因65擴(kuò)增hpv31dc9和hpv31dc31截短基因，分別使用正向引物(ggatcccaccatgagcctgtggagacccagc，seqidno：37)和反向引物(對(duì)dc9而言)(ggaagcttatgtggtggtgctggcgctgggggc，seqidno：38)以及對(duì)dc31而言(gcaagcttaggcctgcagcaggaactttctgccc.seoidno：39)。通過ta克隆將pcr產(chǎn)物克隆進(jìn)pcrtopo2.1中。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證不存在不需要的突變。隨后將hpvl1基因克隆進(jìn)之前用bamhi和hindiii消化過的pfastbac1質(zhì)粒中。根據(jù)制造商的建議，使用bac-to-bac系統(tǒng)(invitrogen)生成編碼不同l1缺失基因的重組桿狀病毒。將維持在補(bǔ)充有10％胎牛血清(fcs，invitrogen)的grace昆蟲培養(yǎng)基(invitrogen，cergypontoise，france)中的sf21細(xì)胞用各重組桿狀病毒感染，并在27℃下孵育。感染后3天，收獲細(xì)胞，并按照之前的描述純化vlp，29,40。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞重懸于含有nonidetp40(0.5％)、抑肽素a和亮肽素(leupeptin)(各自均為1μg/ml，sigmaaldrich，saintquentinfallavier，france)的pbs中，并使其在4℃下靜置30分鐘。隨后將核裂解液離心并將沉淀重懸于含有抑肽素a和亮肽素的冰冷pbs中，然后進(jìn)行超聲處理。隨后，將樣品加載到cscl梯度上，并離心至平衡(22小時(shí)，27,000rpm，sw28轉(zhuǎn)子，4℃)。通過折光檢查法研究cscl梯度片段的密度，并通過10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sds-page)電泳和考馬斯亮藍(lán)染色(coomassiebluestaining)來(lái)研究l1蛋白的存在。合并陽(yáng)性級(jí)分，在pbs中稀釋并在beckmansw28轉(zhuǎn)子(3小時(shí)，28,000rpm，4℃)中離心。離心之后，將vlp重懸于0.15mol/l的nacl中并用最大功率的60％，以一次5秒脈沖進(jìn)行超聲處理。使用microbca試劑盒(pierce，ozyme，france)測(cè)定總蛋白含量。

在293ft細(xì)胞中產(chǎn)生hpv31l1hbc263/264突變體vlp。使用兩步pcr方案，通過密碼子優(yōu)化的hpv31l1基因的誘突變來(lái)獲得編碼嵌合l1蛋白的dna。進(jìn)行重疊pcr以在hpv31l1蛋白的263/264位獲得hbc蛋白的dpasre序列。在第一步中，使用優(yōu)化的hpv31l1dna序列作為模板，并用5’l1-nhei

(ccgctagccaccatgagcctgtggagaccc.seqidno：40)與3’l1-dpasre(ctctctgctggcggggtcgttgaagaagtgccgcacgaa，seqidno：41)作為引物生成一個(gè)片段。使用優(yōu)化的hpv31l1dna序列作為模板，并用3’l1-ecori(cggaattctatcacttcttggttttcttcc，seqidno：42)和5’l1-dpasre(gaccccgccagcagagagagaagcggcaccgtgggcgag，seqidno：43)作為引物擴(kuò)增另一片段。在第二pcr步驟中，使用這兩個(gè)重疊的片段作為dna模板，使用5’l1-nhei和3’l1-ecori為引物。所產(chǎn)生的dna序列l(wèi)1堿基263/264之間具有hbc78-83編碼序列，并在5’端具有nhei限制性位點(diǎn)并在3’端具有ecori限制性位點(diǎn)。對(duì)于蛋白表達(dá)而言，將hpv31l1hbc263/264基因克隆進(jìn)pires哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(bdbiosciences，clontech)中。通過經(jīng)典的堿裂解法和酚/氯仿抽提制備該dna質(zhì)粒(hpv31l1hbc263/264-pires)，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用fugene6(rochediagnostic，meylan，france)，將該dna質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞。用總共0.5μgdna和1μlfugene6/cm²培養(yǎng)面積轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后44小時(shí)收獲293ft細(xì)胞，并如前所述純化vlp。

通過電子顯微鏡研究了vlp中表達(dá)的不同hpv-l1蛋白的自組裝。為此目的，將vlp制備物應(yīng)用于碳包網(wǎng)格(carbon-coatedgrid)，用1.5％乙酸鈾酰(uranylacetate)負(fù)染，并使用jeol1010電子顯微鏡在×50,000的標(biāo)稱放大倍數(shù)下觀察。所有的電子顯微鏡照片都是在30,000×或50,000×下拍攝的。

通過表面等離子共振研究hpv31mab的vlp結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)

用配備有cm3(羧甲基化葡聚糖)傳感器芯片的biacore1000(biacoreab，uppsala，sweden)進(jìn)行分析。以5μl/分鐘的流速，用35μl的0.05mol/l1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽和0.2mol/ln-羥基琥珀酰亞胺處理cm3傳感器芯片，然后以5μl/分鐘的流速，將hpv31l1vlp(32μg/ml，在35μlpbs緩沖液中)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。隨后，以10μl/分鐘的流速，用50μl1mol/l乙醇胺-hcl(ph8.5)封閉殘余的羧基。通過以10μl/分鐘的流速注射5μlhcl-甘氨酸(10mmol/l，ph2.2)來(lái)消除未結(jié)合的vlp。所有在室溫下進(jìn)行的相互作用分析均采用20μl/分鐘的流速。對(duì)于每個(gè)mab，通過三次注射30μl以pbs稀釋10倍的腹水來(lái)獲得結(jié)合的hpv31l1vlp的抗體飽和。通過注射30μl以pbs稀釋4倍的相同mab的雜交瘤上清液來(lái)驗(yàn)證mab飽和。隨后，通過連續(xù)注射五次以pbs稀釋4倍的不同雜交瘤上清液(每次30μl)建立競(jìng)爭(zhēng)。隨后，通過三次注射10μl的30mmol/lhcl來(lái)使生物傳感器再生，并對(duì)同樣的vlp偶聯(lián)的流動(dòng)室進(jìn)行另一個(gè)飽和-競(jìng)爭(zhēng)循環(huán)。研究了幾種其他的再生緩沖液(包括2mol/lnacl、10mmol/lnaoh和20、25、30和50mmol/lhcl)。所選擇的緩沖液(30mmol/lhcl)顯示除去100％的結(jié)合抗體，但不從傳感器芯片上除去vlp，并且不影響vlp構(gòu)象，因?yàn)獒槍?duì)構(gòu)象表位的抗體仍然如再生處理之前一樣有效地與vlp結(jié)合。

利用細(xì)菌細(xì)胞表面展示進(jìn)行表位做圖

使用pflitrx載體的細(xì)菌細(xì)胞表面展示法使用插入有硫氧還蛋白(thioredoxin)結(jié)構(gòu)域(trxa)的12mer肽文庫(kù)來(lái)限制肽。該硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域自身被插入到大細(xì)菌鞭毛蛋白(flic)中，以展示于大腸桿菌(e.coli)的表面(lu等，biotechnology(ny)1995；13：366-72；james等，science2003；299：1362-1367)。通過將1ml肽文庫(kù)儲(chǔ)備液接種進(jìn)50ml含有100μg/ml氨芐西林的imc培養(yǎng)基(6g/lna2hpo4，3g/lkh2po4，0.5g/lnacl，1g/lnh4cl，0.2％酪蛋白氨基酸(casaminoacid)，0.5％葡萄糖，1mmol/lmgcl2)中而獲得pflitrx隨機(jī)肽展示文庫(kù)(invitrogen，cergypontoise，france)，并隨后在25℃下振蕩(225-250rpm)過夜。通過將100μg/ml色氨酸添加到來(lái)自過夜培養(yǎng)于50ml含有100μg/ml氨芐西林的imc培養(yǎng)基的1010細(xì)菌中來(lái)誘導(dǎo)肽表達(dá)，隨后在25℃下振蕩6小時(shí)。

對(duì)于針對(duì)抗hpv31抗體的文庫(kù)篩選而言，通過用定軌搖床以50rpm輕度搖動(dòng)將1ml無(wú)菌水中的20μgmab包被到60mm板(nunclond，nunc，atgc，marne-la-valle′e，france)上1小時(shí)。用10ml無(wú)菌水清洗后，添加10ml封閉溶液(含有100μg/ml氨芐西林、1％低脂奶粉、150mmol/lnacl、1％a-甲基甘露糖苷的imc培養(yǎng)基)并在搖動(dòng)下孵育1小時(shí)。傾出封閉溶液后，將10ml細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物與0.1g奶粉、300μl5moi/lnacl、500μl20％a-甲基甘露糖苷(終濃度：1％脫脂奶粉、150mmol/lnacl、1％a-甲基甘露糖苷)一起加入。在以50rpm輕度搖動(dòng)1分鐘并在室溫下孵育1小時(shí)后，用10ml含有100μg/ml氨芐西林和1％a甲基甘露糖苷的imc培養(yǎng)基將所述板清洗五次(50rpm，5分鐘)。隨后，通過震蕩所述板30秒將結(jié)合的細(xì)菌細(xì)胞洗脫進(jìn)殘余體積的清洗溶液中。將其轉(zhuǎn)移至50ml培養(yǎng)瓶中，并在25℃和搖動(dòng)(225-250rpm)下培養(yǎng)過夜。將該淘洗循環(huán)(panningcycle)再重復(fù)4次，并將來(lái)自第五次淘洗的過夜培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐西林的rmg板(6g/lna2hpo4、3g/lkh2po4、0.5g/lnacl、1g/lnh4cl、2％酪蛋白氨基酸、0.5％葡萄糖、1mmol/lmgcl2、1.5％瓊脂)上劃線，并在30℃下孵育過夜。將來(lái)自rmg/氨芐西林板上的24至30個(gè)克隆中的每一個(gè)接種進(jìn)2ml含有100μg/ml氨芐西林的rm培養(yǎng)基(6g/lna2hpo4、3g/lkh2po4、0，5g/lnacl、1g/lnh4cl、2％酪蛋白氨基酸、1％甘油、1mmol/lmgcl2)中。30℃下?lián)u動(dòng)孵育過夜后，通過經(jīng)典的堿裂解酚/氯仿dna小量制備法提取dna。使用flitrx正向測(cè)序引物對(duì)核苷酸序列進(jìn)行分析。在abiprism3100avantdna測(cè)序儀(perkinelmer，courtaboeuf，france)上運(yùn)行序列。使用dialign2(morgenstern等，gioinformatics1999；15∶211-18)分析序列。

通過elisa檢測(cè)mab對(duì)野生型和突變vlp的反應(yīng)性

用vlp包被微板孔(maxisorp，nunc)。在4℃下孵育過夜并用pbs-吐溫20(0.1％)清洗兩次后，在37℃下將各孔用補(bǔ)充有1％fcs的pbs飽和1小時(shí)。在37℃下，用在pbs5×-吐溫(1％)-fcs(10％)中稀釋的mab將各孔一式兩份地孵育(兩個(gè)測(cè)試和一個(gè)對(duì)照)。清洗4次后，將以pbs-吐溫(1％)-fcs(10％)稀釋1000倍的過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠igfc(sigmaaldrich)添加至孔中并在37℃下孵育1小時(shí)。隨后，清洗4次后，添加在25mmol/l檸檬酸鈉和50mmol/lna2hpo4中的0.4mg/ml鄰苯二胺和0.03％過氧化氫。30分鐘后，用h2so4(4n)終止反應(yīng)，并在490nm讀取吸光度。為進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從受試樣品的od值中減去在無(wú)一抗時(shí)獲得的光密度(od)值。顯示的數(shù)據(jù)是三至四次測(cè)定的平均值。

基于肝素和ecm的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

使用源自giroglou等(jvirol2001；75：1565-70)描述的用于hpv33vlp的肝素結(jié)合測(cè)定的測(cè)定方法測(cè)試了vlp與肝素間的相互作用。在4℃下，用每孔200ng肝素-bsa(sigma)或matrigelvr(bdbiosciences，lepontdeclaix，france)涂布位微滴定板(maxisorp，nunc)過夜。在用含有0.1％吐溫20的pbs清洗4次后，通過在37℃下用pbs加1％fcs孵育1小時(shí)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。清洗后，添加200ng/孔的在pbs中稀釋的vlp。在37℃下孵育60分鐘并清洗4次之后，添加在pbs、0.1％吐溫20和10％fcs中按1∶1000稀釋的抗hpv31vlpmab并在37℃下孵育60分鐘。在37℃下孵育1小時(shí)并清洗4次后，使用共價(jià)連接辣根過氧化物酶的小鼠抗igg抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。在37℃下孵育1小時(shí)并清洗4次后，添加100μl含有鄰苯二胺和h2o2的底物溶液。30分鐘后，通過添加100μl2mol/lh2so4終止反應(yīng)，并用自動(dòng)板檢測(cè)儀讀取492nm下的吸光度。從測(cè)試孔的值中減去沒有vlp的對(duì)照孔的吸光度。同時(shí)，用肝素-bsa或matrigelvr涂布第二板。孵育并清洗后，添加200ng/孔的vlp(其在37℃下與在pbs、0.1％吐溫20和10％fcs中稀釋1000倍的mab預(yù)孵育1小時(shí))。如前所述，使用共價(jià)連接辣根過氧化物酶的小鼠抗igg抗體檢測(cè)結(jié)合抗體。按照所觀察到的在vlp與肝素相互作用之前和之后添加mab之間od的降低來(lái)計(jì)算vlp與肝素或matrigel結(jié)合的抑制。結(jié)果表示為od降低的百分比。

vlp與hs和ecm結(jié)合的測(cè)定

如前所述，用肝素-bsa包被微滴定板(maxisorp，nunc)。封閉步驟后，添加用pbs稀釋的vlp。在37℃下孵育60分鐘并清洗之后，添加在pbs、0.1％吐溫20和10％fcs中按1∶5000稀釋的canvir1mab，并在37℃下孵育60分鐘。清洗四次之后，使用共價(jià)連接辣根過氧化物酶的小鼠抗igg抗體檢測(cè)結(jié)合抗體，并隨后如前所述進(jìn)行肝素與mab相互作用的檢測(cè)。結(jié)果表示為od值。

通過hpv31l1蛋白的同源性建模(homologymodeling)使hpv31表位可視化

將hpv31l1蛋白的序列(genbankid，p17388)作為輸入值提交給swiss-model建模工具(swissmodel.expasy.org)?；谛蛄邢嗨菩缘哪０鍣z索鑒定了hpv16l1(pdb編碼1dzl和2r5h)、hpv-35l1(2r5j)，hpv-11l1(2r5k)和hpv-18l1(2r5i)作為可能的3d模板。因?yàn)閔pv31l1與hpv16和hpv35l1序列更相似，所以我們選擇了相應(yīng)的3d模板(1dzl、2r5h和2r5j)來(lái)模擬hpv31的l1結(jié)構(gòu)。使用anaolea(swissmodel.expasy.org/anolea/)評(píng)價(jià)了hpv31l1的模型，發(fā)現(xiàn)其正確地用于進(jìn)一步的表位位置結(jié)構(gòu)分析。使用swisspdbviewer，利用hpv31l1模型和hpv16vlp(1dzl)的非晶體學(xué)對(duì)稱性(變換矩陣)(chen等，molcell2000；5：557-67)，重新構(gòu)建了hpv31的l1五聚體。以pdb格式存儲(chǔ)了hpv31l1vlp五聚體的原子坐標(biāo)并用pymol程序顯示，所述pymol程序是一種用于大分子結(jié)構(gòu)的分子圖形可視化工具(pymol.org)。

結(jié)果

使用表面等離子體共振對(duì)hpv31l1mab進(jìn)行表位做圖

使用針對(duì)hpv31l1蛋白的15種mab進(jìn)行表位做圖。測(cè)試這些mab之間的所有競(jìng)爭(zhēng)。例如[圖7(a)]，通過用h31.f16mab(未加工的腹水)使偶聯(lián)的hpv31l1vlp飽和來(lái)建立表位競(jìng)爭(zhēng)，并通過注射相同mab(雜交瘤上清液)來(lái)驗(yàn)證mab飽和。發(fā)生在添加h31.f16mab之后的低共振單位(low-resonanceunit，ru)(-52ru)證明達(dá)到了飽和。飽和之后，由于飽和mab的解離導(dǎo)致ru降低，并且這是負(fù)ru的原因。隨后，通過連續(xù)注射h31.b18、h31.d7、h31.e16、h31.e17和h31.f7mab(雜交瘤上清液)來(lái)建立mab結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。h31.e16和h31.f7mab不結(jié)合hpv31l1vlp(分別為-1和-13ru)，提示這兩個(gè)mab所識(shí)別的表位與h31.f16mab所識(shí)別的表位是相似的或非常接近的。與此相反，使用h31.b18、h31.d7和h31.e17mab觀察到了顯著的vlp結(jié)合(分別為171、523和69ru)，提示這些抗體所識(shí)別的表位與h31.f16mab所識(shí)別的不同。隨后，通過三次注射30mmol/lhcl使生物傳感器再生。該方法用于所有其他競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。

所研究的15種mab中的每一種都與至少3種其他mab競(jìng)爭(zhēng)，但沒有一種mab與所有其他mab競(jìng)爭(zhēng)。使用這些結(jié)果建立了表位圖[圖7(b)]，h31.f7mab所識(shí)別的表位在該圖中為中心位置。該mab所識(shí)別的表位已在l1fg環(huán)上鑒定(carpentier等，jmedvirol2005；77：558-65；fleury等，archvirol2006；1511-23)。與其他mab(h31.b18、h31.b1和h31.h9)競(jìng)爭(zhēng)較小的mab位于所述表位圖的外圍。

hpv31mab與hpv31/hbcvlp的結(jié)合

使用hpv31l1/hbc263/264突變體和hpv31l1wtvlp分析了mab的反應(yīng)性，以鑒定一些中和表位是否位于fg環(huán)上。除了以前產(chǎn)生的hpv31l1vlp以外，我們還通過在位置263-264插入乙型肝炎核心(hbc)dpasre而構(gòu)建了hpv31l1突變體。所有類型特異性mab的vlp結(jié)合都受到在263/264位插入hbc的影響。應(yīng)當(dāng)指出，非中和性h31.d24mab(其識(shí)別位于271-279位的線性表位(svptdlyik，seqidno：44))的反應(yīng)性不受所述插入的影響。camvir-1mab(其識(shí)別在fg環(huán)以外鑒定的線性表位)的結(jié)合也不受所引入的突變的影響。交叉中和性mabh31.f7類似地與hpv16和hpv31wtvlp均有反應(yīng)，但受到在位置263/264插入hbc的影響。

利用細(xì)菌表面展示對(duì)5種mab進(jìn)行表位做圖

利用細(xì)菌展示肽文庫(kù)進(jìn)行表位做圖提供了進(jìn)行單克隆和多克隆抗體表位做圖的新方法(rockberg等，natmethods2008；5：1039-45)。使用一種此類系統(tǒng)(pflitrx細(xì)菌展示系統(tǒng))鑒定l1表位。使用pflitrx載體的細(xì)菌細(xì)胞表面展示利用插入到硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域中的12mer肽文庫(kù)來(lái)限制所述肽，允許構(gòu)象表位的展示。該硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域自身插入到大腸桿菌的大細(xì)菌鞭毛蛋白中，以展示在細(xì)菌表面。將從腹水中純化的高效價(jià)mab包被到nuclond板上，用于抗hpv31抗體的文庫(kù)篩選，并且對(duì)結(jié)合到板上的mab進(jìn)行體外篩選輪次，以選擇與所述mab相互作用的細(xì)菌展示肽。對(duì)于每個(gè)輪次，將細(xì)菌文庫(kù)添加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行陽(yáng)性選擇。洗掉未結(jié)合的細(xì)菌，并回收結(jié)合的細(xì)菌。五個(gè)輪次之后，選出單克隆并分離dna用于測(cè)序。首先使用dialign2程序分析序列。選出高評(píng)分的匹配的肽，隨后使用dialign2與全長(zhǎng)hpv31l1蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。將與選出的所有肽相匹配的hpv31l1序列保留。我們首先將該系統(tǒng)用于h31.d24mab，其識(shí)別以前鑒定的hpv31l1的fg環(huán)中271-279位的線性表位(svptdlyik，seqidno：44)。在進(jìn)行細(xì)菌展示選擇后，將24個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和分析。用h31.d24mab選出的24個(gè)肽中的六個(gè)彼此f2匹配，并與hpv31l1蛋白匹配(參見圖8)，所鑒定的共有序列位于275-279位(dliyk，seqidno：46)。

因而，使用細(xì)菌展示來(lái)研究mabh31.f7所識(shí)別的中和構(gòu)象表位，mabh31.f7與hpv16、18和58具有交叉反應(yīng)活性，并弱中和hpv類型16和31。使用h31.f7mab通過細(xì)菌展示選出了24個(gè)陽(yáng)性克隆。所選出的24個(gè)肽中5個(gè)彼此匹配，并與hpv31l1蛋白序列259-266位(rhffnrsg，seqidno：47)相匹配。還研究了三種類型特異性的識(shí)別構(gòu)象表位的中和性mab(h31.f16、h31.h12和h31.b1)。選出每種mab的陽(yáng)性克隆。用h31.f16mab選出的五種肽、用h31.h12mab選出的五種肽以及用h31.b1mab選出的六種肽彼此匹配，并且與用于h31.f16mab的hpv31l1蛋白序列sgtvgesvp(265-273位)(seqidno：48)、用于h31.h12mab的rsgtvg序列(264-269位)(seqidno：49)和用于h31.b1mab的rsgtvgesv序列(264-272位)(seqidno：50)相匹配。

假病毒顆粒附著前和附著后的mab中和

hpv16和hpv33特異性抗體已顯示出在附著至靶細(xì)胞之前或之后進(jìn)行中和(selinka等，jvirol2003；77：12961-67；day等，jvirol2007；81：8784-92)。通過抗hpv31mab的病毒中和機(jī)制是通過中和測(cè)定確定的，其中在添加f3假病毒顆粒至cos-7細(xì)胞之前[圖9(a)]或細(xì)胞附著后1小時(shí)[圖9(b)]添加mab。六種mab[h31.b1、h31.c24、h31.g5、h31.e16、h31.f7和h31.d7，圖9(b)]通過抑制細(xì)胞附著中和了hpv31假病毒，因?yàn)槠湓诓《靖街爸泻停皇窃诩俨《九c細(xì)胞結(jié)合之后[圖9(b)]。其他8種mab通過細(xì)胞附著后機(jī)制中和了hpv31假病毒，因?yàn)槠湓诩?xì)胞附著之前和之后中和假病毒。應(yīng)當(dāng)指出，通過表面等離子體共振分析獲得的表位圖[圖7(c)]提示，這六種mab中的5種通過抑制細(xì)胞附著中和hpv31假病毒。

vlp與hs和ecm的結(jié)合：hpv31mab和l1c末端缺失的作用

使用elisa研究了hpv31mab對(duì)vlp與肝素之結(jié)合的抑制作用，其中在vlp與elisa板上包被的肝素結(jié)合之前向vlp添加mab。結(jié)果表明，識(shí)別線性表位的非中和性h31.d24mab強(qiáng)烈抑制vlp與肝素的結(jié)合，因?yàn)?4種mab中僅6種識(shí)別f4構(gòu)象中和表位[圖10(a)]。通過表面等離子體共振分析獲得的表位圖表明，mab中的一些抑制vlp與肝素結(jié)合[圖7(c)]。在附著至細(xì)胞之前中和假病毒顆粒的mab與抑制與hs之結(jié)合的mab之間沒有明顯的相關(guān)性。然而，三種中和性抗體(h31.g5、h31.e16和h31.d7)表現(xiàn)出了這兩種能力(參見圖10)。使用matrigelvr作為ecm的替代物，通過elisa研究了對(duì)vlp與ecm蛋白之結(jié)合的抑制作用。結(jié)果[圖10(b)]顯示，除了h31.c24(37％抑制)之外，全部的中和性抗體均抑制vlp與ecm蛋白的結(jié)合(>50％)。非中和性抗體h31.d24不抑制vip與ecm蛋白的結(jié)合。

為進(jìn)一步研究vlp與hpsg的相互作用，我們使用了4種c末端缺失的突變體用于分析肝素與l1蛋白的結(jié)合。已生產(chǎn)了分別具有c末端9個(gè)和31個(gè)氨基酸缺失的hpv16d9和hpv16d31突變體，類似地生產(chǎn)了44和hpv31d9和hpv31d31l1突變體用于本研究的目的。如前邊在相應(yīng)的hpv16缺失突變體44中觀察到的那樣，這些hpv31缺失突變體自組裝成為vlp(參見圖7)，并且這4種c末端缺失的vlp以與wtvlp相似的結(jié)合方式與肝素結(jié)合。然而，當(dāng)這些vlp變性時(shí)，失去與肝素的結(jié)合，確證了肝素與vlp構(gòu)象基序結(jié)合，而該基序不存在于l1蛋白的c末端部分(參見圖11)。因?yàn)閔pv感染靶細(xì)胞是多步驟的過程，涉及hspg、ecm和未知的二級(jí)受體，所以我們研究了hpv31mab對(duì)ecmhpvvlp結(jié)合之中和的作用。

h31.d24識(shí)別的表位是線性表位，三種中和性mab(h31.b1、h31.f16和h31.h12)識(shí)別的表位是構(gòu)象表位，而h31.b1mab是部分交叉中和性的和交叉反應(yīng)性的。

h31.f7mab識(shí)別的表位(即交叉反應(yīng)性的和部分交叉中和性的mab)是在hpv31l1蛋白fg環(huán)的n末端部分的259-268位鑒定的(rhffnrsgtv，seqidno：45)[圖12，利用swisspdbviewer，使用hpv31l1模型和hpv16vlp的aq6非結(jié)晶對(duì)稱信息，重新構(gòu)建了3d殼體結(jié)構(gòu)[pdb編碼：1dzl，(chen等，molcell2000；5：557-67)]]，且根據(jù)hpv31模型，其大多數(shù)是來(lái)自所述殼體表面的不可接近的f6。這與fg環(huán)的早期區(qū)域證明的hpv類型之間的相同結(jié)構(gòu)的事實(shí)和bishop等的基于l1蛋白結(jié)構(gòu)的假說(shuō)是一致的。該假說(shuō)提出，fg環(huán)的該區(qū)域必須能夠在類型之間誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性，但是抗原性較差和/或是不可接近的。

對(duì)于hpv16和hpv33來(lái)說(shuō)，已表明多種l1蛋白表面暴露的環(huán)對(duì)于表位的中和性抗體的誘導(dǎo)有貢獻(xiàn)，所述表位僅在一個(gè)環(huán)中被鑒定，或者幾個(gè)環(huán)對(duì)結(jié)合位點(diǎn)15、46、47有貢獻(xiàn)，有人提出l1的非連續(xù)區(qū)域可對(duì)mab識(shí)別的中和表位有貢獻(xiàn)。我們的結(jié)果支持hpv31中和性抗體主要針對(duì)fg環(huán)，而fg環(huán)僅對(duì)與中和性抗體的結(jié)合有貢獻(xiàn)。l1高變環(huán)彼此緊密臨近的事實(shí)并沒有排除其他環(huán)中的突變或插入影響fg構(gòu)象表位的的可能性，如roth等47所觀察到的那樣。我們觀察到識(shí)別dlyik(seqidno：44)序列(275-279)的交叉反應(yīng)性的h31.d24mab顯著降低hpv31與肝素結(jié)合的能力，因此證實(shí)了賴氨酸278在hs結(jié)合中的作用。然而，該抗體對(duì)hpv31假病毒顆粒41、65和識(shí)別構(gòu)象表位(所述表位已知與位于fg環(huán)n末端部分的序列相結(jié)合)的三種其他中和性抗體與肝素的結(jié)合沒有作用或作用有限。h16.v5和h16.e70mab已表明不阻斷與細(xì)胞表面的相作用。然而，這些中和性抗體抑制病毒與hacat細(xì)胞產(chǎn)生的ecm相結(jié)合，并通過細(xì)胞附著后機(jī)制中和假病毒顆粒43。與此相一致的是，我們觀察到三種類型特異性的中和性抗體不與hs競(jìng)爭(zhēng)與vlp的結(jié)合，并且其中僅一種(h31.b1)被vlp與細(xì)胞的結(jié)合所抑制。然而，與非中和性的h31.d24mab不同，所有這些抗體均競(jìng)爭(zhēng)與ecm的結(jié)合。這些結(jié)果提示，這些抗體識(shí)別hpv16vlp與hs35結(jié)合中所涉及的賴氨酸的構(gòu)象堿性簇的鄰近表位。應(yīng)當(dāng)指出，該簇最重要的賴氨酸存在于h31.d24mab所識(shí)別的表位中。此外，對(duì)于mab對(duì)hpv31假病毒顆粒的附著前和附著后中和的研究表明，hpv31中和性抗體中的6種通過阻止病毒顆粒與細(xì)胞表面結(jié)合而發(fā)揮作用，另外8種中和性mab通過阻止其內(nèi)化而干擾假病毒顆粒。我們的結(jié)果表明，對(duì)于整體的mab而言，中和與mab結(jié)合hs之能力之間沒有相關(guān)性。lopez等66最近報(bào)道，在天然感染中檢測(cè)到的抗hpv抗體抑制hpv16與hs的結(jié)合，并且其觀察到具有最高中和效價(jià)的那些抗體是那些抑制hs結(jié)合的抗體?？傊?，我們的結(jié)果證明hpv31中和性mab識(shí)別位于hpv31l1蛋白fg環(huán)上的構(gòu)象表位，并且其通過阻斷與靶細(xì)胞的附著，或通過細(xì)胞附著后的中和來(lái)發(fā)揮作用。通過細(xì)菌表面展示對(duì)三種類型特異性中和表位的精確確定證明了其在fg環(huán)中央部分的定位，并鑒定了在相對(duì)保守的fg環(huán)n末端部分的交叉反應(yīng)性和部分交叉中和性的構(gòu)象表位。fg環(huán)的溶劑暴露的氨基酸殘基分布在沿著由pro273至leu287所界定的軸而形成的溝的兩側(cè)[圖12]。我們的結(jié)果表明，所述溝的右側(cè)部分含有被h31.d24mab所識(shí)別的線性非中和性表位。這也是硫酸肝素結(jié)合的熱點(diǎn)，因而解釋了為什么h31.d24和hs競(jìng)爭(zhēng)對(duì)該區(qū)域的結(jié)合。所鑒定的構(gòu)象中和性表位均位于fg環(huán)溝的左側(cè)(參見圖12)。如以前對(duì)于針對(duì)bpvl1蛋白的mab所描述的那樣，可通過mab結(jié)合模式上的差異來(lái)解釋針對(duì)這些表位的抗體不與hs強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)這一事實(shí)67。然而，一些其他hpv31中和性mab確實(shí)與hs競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，這提示當(dāng)其與其各自的表位結(jié)合時(shí)，這些mab具有不同的傾斜(tilt)，因而干擾hs更大或更小程度的結(jié)合，或是其針對(duì)來(lái)自溝兩側(cè)的氨基酸殘基。h31.d24mab與vlp的尖端結(jié)合，這支持了這樣的假說(shuō)，即非中和表位還存在于hpv顆粒的表面上。所獲得的結(jié)果表明，hpv31的fg高變環(huán)中中和性表位密集，提示hpv31mab與fg環(huán)中央部分上的重疊但不同的表位結(jié)合，這與hpvvlp表面上的fg環(huán)的暴露相一致，因而證實(shí)了中和性抗體主要位于殼粒的尖端和冠。該結(jié)果還支持并證實(shí)了阻斷病毒與ecm的附著(而不是阻斷病毒與hs的附著)是重要的中和機(jī)制。

實(shí)施例3：hpv16/31l1突變體的生成

乳頭瘤病毒是小的無(wú)包膜dna病毒，其二十面體衣殼由l1和l2蛋白構(gòu)成，所述衣殼包封約8kbp的閉合環(huán)狀雙鏈dna。直徑50-60nm的病毒衣殼含有72個(gè)l1大蛋白的五聚體和12至72拷貝的l2小衣殼蛋白。用自組裝成病毒樣顆粒(vlp)的l1蛋白進(jìn)行了免疫接種誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和性抗體，并賦予類型特異性的長(zhǎng)期保護(hù)，如在動(dòng)物模型中證明的那樣(breitburd等，jvirol1995；69：3959-63；suzich等，pnas1995；92：11553-57；christensen等，jvirol1996；70：960-65)?？贵w應(yīng)答通常是針對(duì)vlp外表面上存在的病毒衣殼l1蛋白的外環(huán)上發(fā)現(xiàn)的表位而產(chǎn)生的(christensen等，virology2001；291：324-34；sadeyen等，virology2003；309：32-40；orozco等，jvirol2005；79：9503-14；yaegashi等，jvirol1991；65：1578-83)。中和性衣殼表位是抗體介導(dǎo)的針對(duì)hpv的免疫保護(hù)作用的重要決定簇，并且線性和構(gòu)象表位均被鑒定位于hpvl1vlp和假病毒顆粒的表面上(yaegashi等，jvirol1991；65：1578-83；volpers等，jgenvirol1995；76：2661-67；heino等，jgenvirol1995；76：1141-53；christensen等，virology1996；224：477-86)。

據(jù)報(bào)道hpv16l1的fg環(huán)和hpv31l1的ef環(huán)中的l1殘基涉及中和性抗體的結(jié)合(sadeyen等，virology2003；309：32-40；white等，jvirol1999；73：4882-89；combita等，jvirol2002；76：6480-86；carter等，jvirol2003；77：11625-32)。

本研究的目標(biāo)是研究嵌合hpv顆粒的免疫原性。我們將含有hpv16主要表位(aa256-294)的l1衣殼蛋白fg外環(huán)的氨基酸替換為hpv31(aa257-295)的l1fg環(huán)的對(duì)應(yīng)氨基酸，生成嵌合l1hpv納米顆粒，所述納米顆粒維持hpv16l1的整體野生型序列，僅在fg環(huán)中有3個(gè)hpv31樣替換(hpv-vlpx)或7個(gè)hpv31樣替換(hpv-vlpy)(圖13)。

從感染了重組桿狀病毒的sf21昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生和純化所述嵌合l1蛋白。sf21昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生大量的嵌合l1蛋白(2.5-3mg/升)。l1hpvx和l1hpvy嵌合蛋白與hpv16野生型l1類似地組裝成為vlp。含有除了hpv-vlpy中的7個(gè)交換之外的突變的嵌合構(gòu)建體不組裝成為vlp。

為了測(cè)試嵌合vlp的感染性，測(cè)定了其將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的能力。將hpv-vlpx和hpv-vlpy以及作為對(duì)照的hpv16野生型vlp解離，添加螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并在重新結(jié)合時(shí)包封到vlp中。將cos-7細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞，atcccrl-1651)與vlp體外接觸并孵育。孵育后，除去培養(yǎng)基，在螢光素酶裂解緩沖液中清洗并裂解細(xì)胞。如圖14所示，嵌合的hpv-vlpx和y保留了野生型hpv-16vlp的感染能力。

為檢測(cè)嵌合vlp的免疫原性，用hpv16、hpv31和兩種嵌合hpvx和y免疫小鼠(每組10只)。如圖15所示，hpv-vlp嵌合體的免疫反應(yīng)性與hpv16和hpv31之間的交叉反應(yīng)性是同一數(shù)量級(jí)的，其是最小的(至少比實(shí)際免疫應(yīng)答低2個(gè)對(duì)數(shù))。在用hpv16免疫接種的小鼠中，用elisa測(cè)量的hpv16特異性抗體的效價(jià)可預(yù)期地為約2000gmt。出乎意料的是，在hpv-vlpx和y感染的小鼠中基本上沒有發(fā)現(xiàn)hpv16特異性抗體，盡管l1hpv-vlpx和y幾乎完全維持hpv16野生型氨基酸序列這一事實(shí)。因此，這些嵌合體不產(chǎn)生hpv16特異性抗體。如所預(yù)期的，在hpv31感染的小鼠中，基本上沒有發(fā)現(xiàn)hpv-16特異性抗體。甚至更出乎意料的結(jié)果是，在hpv-vlpx和y感染的小鼠中基本上沒有發(fā)現(xiàn)hpv31特異性抗體，盡管嵌合體的fg環(huán)類似于hpv31的這一事實(shí)，尤其是對(duì)于l1hpvy的fg環(huán)(其與野生型hpv31的fg環(huán)的不同僅在于一個(gè)氨基酸(hpv31291t-n290hpv16))來(lái)說(shuō)。如所預(yù)期的，在hpv16感染的小鼠中基本上沒有發(fā)現(xiàn)hpv31特異性抗體，而在hpv31中則發(fā)現(xiàn)可靠的應(yīng)答(約1900gmt)。有趣的是，在hpv16或hpv31免疫的小鼠中也未檢測(cè)到x和y特異性抗體，提示基本上沒有交叉反應(yīng)性。對(duì)于x和y，在x或y免疫的小鼠中，可檢測(cè)到中等的交叉反應(yīng)性(對(duì)于x和y而言，分別為538和857gmt)。

數(shù)據(jù)表明，可以設(shè)計(jì)帶有突變的假病毒載體，其在所述假病毒載體來(lái)源的物種之間基本沒有交叉反應(yīng)。這一大大降低的免疫原性將允許重新施用這些載體，而不會(huì)因?yàn)樵趆pv感染的個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)所述載體的中和性抗體而明顯損失轉(zhuǎn)基因效力。

實(shí)施例4：通過用包封了l2基因的hpv假病毒顆粒進(jìn)行免疫來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)異hpv的中和性抗體

用自組裝成病毒樣顆粒(vlp)的l1進(jìn)行的免疫誘導(dǎo)了高效價(jià)的中和性抗體，并賦予動(dòng)物針對(duì)同源的實(shí)驗(yàn)性感染的保護(hù)作用[breitburd等，jvirol1995；69(6)：3959-63；suzich等，pnas1995；92(25)：11553-7]。還已經(jīng)表明，保護(hù)作用是由針對(duì)構(gòu)象表位的中和性抗體介導(dǎo)的。這些結(jié)果已經(jīng)導(dǎo)致了針對(duì)生殖器hpv類型的疫苗的產(chǎn)業(yè)開發(fā)。臨床前研究已表明，l1vlp所誘導(dǎo)的中和性抗體主要是類型特異性的[roden等，jvirol1994；68(11)：7570-4；roden等，jvirol1996；70(9)：5875-83]。然而，已報(bào)道了hpv6和11以及hpv16和31之間低水平的交叉中和[christensen等，virology1994；205(1)：329-35；white等，jvirol1998；72(2)：959-64；giroglou等，vaccine2001；19(13-14)：1783-93；combita等，jvirol2002；76(13)：6480-6]以及hpv18和45之間較高水平的交叉中和[mclaughlin-drubin等，virology2003；312(1)：1-7]。臨床試驗(yàn)已表明，免疫應(yīng)答與針對(duì)hpv16和hpv18的感染以及相關(guān)的病變相關(guān)[ault等，lancet2007；369(9876)：1861-8；paavonen等，lancet2007；369(9580)：2161-70]。當(dāng)前含有l(wèi)1vlp的hpv疫苗促進(jìn)強(qiáng)烈的、主要是類型特異性的中和性抗體應(yīng)答。用hpv16和18疫苗的臨床試驗(yàn)也已揭示了針對(duì)hpv類型的交叉保護(hù)作用限于密切相關(guān)的類型。對(duì)兩種疫苗明顯建立了針對(duì)hpv31的保護(hù)作用，僅對(duì)一種疫苗建立了針對(duì)hpv45的保護(hù)作用[paavonen等，lancet2007；369(9580)：2161-70；brown等，jinfectdis2009；199(7)：926-35]。因?yàn)榕鷾?zhǔn)的hpv疫苗僅靶向15種高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型中的兩種，所以需要另外的策略來(lái)阻止其他高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型的感染。

l2蛋白已作為候選的預(yù)防性疫苗出現(xiàn)，因?yàn)樵谌轭^瘤病毒感染的動(dòng)物模型中用l2免疫接種誘導(dǎo)能夠介導(dǎo)比l1vlp更寬范圍保護(hù)作用的交叉中和性抗體[roden等，jvirol1994；68(11)：7570-4；christensen等，virology1991；181(2)：572-9；yin等，virology1992；187(2)：612-9；chandrachud等，virology1995；211(1)：204-8；gaukroger等，jgenvirol1996；77(7)：1577-83；campo等，virology1997；234(2)：261-6；roden等，virology2000；270(2)：254-7；embers等，jvirol2002；76(19)：9798-805]，并且臨床前和臨床發(fā)現(xiàn)[gambhira等，cancerres2006；66(23)：11120-4；alphs等，pnas2008；105(15)：5850-5；karanam等，vaccine2009；27(7)：1040-9]已經(jīng)證明l2疫苗誘導(dǎo)廣譜交叉中和性抗體。然而，l2蛋白和l2肽的免疫原性低于lvlp，并且將l2蛋白整合進(jìn)l1vlp中由于l1的免疫顯性而不提高抗l2應(yīng)答[roden等，virology2000；270(2)：254-7]。這提示，如果這樣的基于l2的疫苗是有效的，那么必須研究新的疫苗策略。

本研究的目的是研究提高l2蛋白與免疫系統(tǒng)的接觸以產(chǎn)生廣譜hpv疫苗的可能性。

材料和方法

抗體

camvir-1單克隆抗體(bdbiosciences，lepontdeclaix，france)與已定位于hpv-16l1蛋白的203至209位氨基酸之間的線性表位相結(jié)合[fleury等，archvirol2006；151(8)：1511-23]。h16.v5mab針對(duì)hpv16l1蛋白的構(gòu)象中和表位[christensen等，virology1996；223(1)：174-84]。兔抗hpv16l2免疫血清由richardroden惠贈(zèng)。使用streptagii抗體(hrp綴合的)檢測(cè)hpvvlp上steptagii肽的存在(novagen，vwr，fontenaysousbois，france)。

細(xì)胞系

cos-7細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞，atcccrl-1651)生長(zhǎng)于補(bǔ)充有10％熱滅活的胎牛血清(fcs)、100iu/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素以及1mmol/l丙酮酸鈉的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(invitrogen，illkirch，france)中。293ft細(xì)胞系(invitrogen)是穩(wěn)定表達(dá)sv40標(biāo)簽和來(lái)自pcmvport6at.neo質(zhì)粒的新霉素抗性基因的293細(xì)胞系的快速生長(zhǎng)變體。293ft細(xì)胞系生長(zhǎng)于dulbecco改良eagle培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基除了補(bǔ)充有上述成分外，還補(bǔ)充有1％非必需氨基酸和500μg/mlg418。細(xì)胞系生長(zhǎng)在37℃下的含有5％co2的加濕氣氛中。

在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)hpv18、hpv31和hpv58vlp

按照以前的描述[touze等，jclinmicrobiol.1998；36(7)：2046-51；combita等，femsmicrobiollett2001；204(1)：183-8]，從感染了重組桿狀病毒的sf21昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)和純化hpv58l1/l2vlp、hpv31l1/l2vlp和hpv18l1/l2vlp，所述桿狀病毒編碼l1和l2基因。

l2streptactin融合蛋白(l2sa)的生產(chǎn)和純化

包含上游(bamhi和sali)和下游(hindiii)限制性位點(diǎn)的不含起始密碼子的streptactin(sa)序列[voss等，proteineng1997；10(8)：975-82]是由geneart(regensburg，germany)使用用于在草地夜蛾中表達(dá)的經(jīng)調(diào)整密碼子使用而合成的。將sa序列克隆到pfastbacdual表達(dá)載體(invitrogen)的sali和hindiii位點(diǎn)之間，以獲得pfastbacdualsa質(zhì)粒。隨后將hpv16l2orf融合在saofr的5’末端。為此，使用hpv16l2f和hpv16l2δr，通過pcr從含有野生型l2基因(fn297862)的人密碼子改編形式的質(zhì)粒中擴(kuò)增hpv16l2δnlsorf(氨基酸12至442)。設(shè)計(jì)正向引物以引入bamhi位點(diǎn)和起始密碼子上游的kozak序列，以及含有sali限制性位點(diǎn)的反向引物。隨后，通過ta克隆將pcr產(chǎn)物克隆進(jìn)pcr2.1載體(invitrogen)。隨后，通過測(cè)序來(lái)驗(yàn)證不存在不想要的pcr誘導(dǎo)的突變。將pcr2.1-16l2anls和pfastbacdualsa質(zhì)粒用bamhi和saii限制性酶切，并將l2基因與streptactin基因融合，以生成pfastbacdual-16l2δnls(l2sa)。

根據(jù)制造商的推薦，使用bac-to-bac系統(tǒng)(invitrogen)生成了編碼l2sa的重組桿狀病毒。在27℃下，使sf21昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)于補(bǔ)充有青霉素、鏈霉素和兩性霉素b(invitrogen)的sf900ii培養(yǎng)基中。以m.o.i.10感染細(xì)胞并使之生長(zhǎng)4天。刮下細(xì)胞，以300×g離心并隨后重懸于含有0.5％nonidetp40和抗蛋白酶混合物(roche，meylan，france)的pbs1×中，并在冰上孵育30分鐘。將裂解液在4℃以12,000×g離心10分鐘，上清液代表細(xì)胞質(zhì)級(jí)分。將代表核部分的沉淀進(jìn)行超聲處理(3次脈沖，15秒，vibracell，fischerscientific，france)。通過western印跡分析l2sa蛋白的表達(dá)。為此，將蛋白質(zhì)通過12.5％sdspage分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(protranba83，schleicherandschuell，manteslaville，france)。在4℃下，將該膜在含有5％低脂奶粉的tnt(15mmol/ltris，140mmol/lnacl，0.05％吐溫20)中飽和過夜，并隨后用tnt-5％奶清洗3次。室溫下將膜與在tnt-5％奶中按1/1000稀釋的兔多克隆抗l2抗體一起孵育1小時(shí)，隨后清洗三次并添加堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠iggfc(sigmaaldrich)(1/2,500，在tnt-5％奶中)。在室溫下孵育1小時(shí)并在tnt-5％奶中清洗三次以及在tnt中清洗兩次后，使用bcip/nbt液體底物系統(tǒng)(sigma-aldrich，saintquentinfallavier，france)使免疫斑點(diǎn)顯色。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(pierce，ozyme，montignylebretonneux，france)，將l2sa蛋白在固定的亞氨生物素上通過親和進(jìn)行純化。

l1l2savlp的生產(chǎn)

按照以前的描述[sadeyen等，virology2003；309(1)：32-40]，在使用允許在野生型hpv16衣殼基因140-141位插入steptagii肽(stii，wshpqfek，seqidno：12)[schmidt等，natprotoc2007；2(6)：1528-35]的引物的兩個(gè)pcr步驟后，構(gòu)建l116-steptagii基因。在第一個(gè)pcr步驟中，使用表現(xiàn)人化密碼子使用的l1基因作為模板，并使用正向l116stii/反向stii和正向stii/反向l116stii。第二個(gè)pcr步驟中，使用正向l116stii/反向l116stii引物，以將如此獲得的兩個(gè)重疊片段融合，以便產(chǎn)生l116streptagii序列(l1stii)。如上文所述將最終的pcr產(chǎn)物克隆和測(cè)序，并最終克隆到pfastbacdual質(zhì)粒的bamhi和hindiii之間，以產(chǎn)生重組的桿狀病毒。

通過cscl梯度超離心從感染的昆蟲細(xì)胞中純化vlp。通過在相互作用緩沖液(100mmol/ltrishclph8，1mnacl，0.25％tritonx100)中將l1stiivlp與l2sa融合蛋白混合而獲得與l1stiivlp結(jié)合的l2sa蛋白。為了分析所獲得的嵌合vlp(l1l2savlp)，在sw-60轉(zhuǎn)子(beckman)中通過超離心(60,000rpm，1小時(shí))使vlp沉淀，隨后通過上文中的western印跡法分析l2和strep-tag的存在。

生產(chǎn)具有插入到de環(huán)中的hpv31l2肽(13-88位)的hpv31vlp

選擇hpv31l2蛋白的交叉中和表位(13-88位氨基酸)用于插入l1蛋白中[pastrana等，virology2005；337(2)：365-72；gambhira等，jvirol2007；81(21)：11585-92；richards等，pnasusa2006；103(5)：1522-7]。通過兩個(gè)pcr步驟[fleury，clinvaccineimmunol2008；15(1)：172-5]構(gòu)建在140-141位含有限制性位點(diǎn)xhoi和smai的hpv31l1基因序列，以使用pires31l1l2h插入hpv31l2肽序列13-88位(l213-88)中。在第一個(gè)pcr步驟中，使用正向-l1h31/反向-l1和反向-l1h31/正向-l1為引物，擴(kuò)增hpvl131的5’和3’部分。在第二個(gè)pcr步驟中，將這兩個(gè)片段用作模板，使用正向-l1h31/反向l1h31作為引物。隨后將該pcr產(chǎn)物克隆進(jìn)pcrtopo2.1中，測(cè)序并亞克隆進(jìn)之前用bamhi和hindiii酶切的pfastbac1質(zhì)粒中。從pires31l1l2h和l213-88正向和反向引物擴(kuò)增編碼13-88位hpv31l2基因片段的dna，并按上文克隆。用xhoi/smai消化pcr2.1topo/l213-88和pfastbac1/l1，以插入編碼hpvl2肽的序列。生成編碼l1-l213-88蛋白的重組桿狀病毒，并按上文所述3感染昆蟲細(xì)胞。

表5.使用的寡核苷酸序列

hpv58和hpv31假病毒顆粒的生成

使用密碼子改變的hpv衣殼基因的細(xì)胞系統(tǒng)獲得了hpv31和58假病毒顆粒[bucki等，methodsmolmed2005；119：445-62]。簡(jiǎn)而言之，設(shè)計(jì)hpv58l1和l2基因，使其含有在人類中高度表達(dá)的基因中最頻繁使用的密碼子(分別為fn178626和fn178627)。將l1和l2基因克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物雙順反子表達(dá)載體pires(bdbiosciences，clontech)中。將l1基因克隆到cmvie啟動(dòng)子下游的mcsa的nhei和ecori限制性位點(diǎn)之間。隨后將l2基因克隆至pires-l1的mcsb的xbai和noti限制性位點(diǎn)之間。通過經(jīng)典的酚/氯仿dna制備法制備了用于生成假病毒顆粒的編碼螢光素酶的dna質(zhì)粒(pgl3luc，promega，charbonnières-les-bains，france)或piresl2δnls。后一種質(zhì)粒在xbai和noti限制性位點(diǎn)之間含有改編hpv31l2的12至442位氨基酸的dna序列。該序列是從含有人類密碼子改編的hpv31全長(zhǎng)l2基因的質(zhì)粒中通過pcr擴(kuò)增的[fleury等，clinvaccineimmunol2008；15(1)：172-5]。對(duì)于293ft細(xì)胞中假病毒顆粒的生成，用0.5μgdna(0.25μgpgl3-luc，或pcmv-gfp或pires-l2質(zhì)粒，0.25μgl1l2質(zhì)粒)和1μlfugene6(roche)每cm²培養(yǎng)面積轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后兩天收獲細(xì)胞，并按照以前的描述純化假病毒顆粒[fleury等，clinvaccineimmunol2008；15(1)：172-5]，并在-80℃下保存待用。使用camvir-1抗體，通過與已知濃度的同源類型的vlp相比較，以western印跡測(cè)定假病毒顆粒的量。

hpv16和18假病毒顆粒的生產(chǎn)

通過以前發(fā)表的拆分-重新組裝法[touze等，nucleicacidsres1998；26(5)：1317-23]并做一些修改[bousarghin等，molcancerther2009；8(2)：357-65]，生產(chǎn)了hpv16和18假病毒顆粒。在室溫下，將l1/l2vlp(100μg)在含有20mmol/ldtt和1mmol/legta的50mmol/ltris-hcl緩沖液(ph7.5)中孵育30分鐘。在此階段，向所述破壞的vlp中添加pgl3luc(10μg)。隨后在10nmzncl2存在下，用遞增濃度的cacl2(高至5mmol/l的終濃度)稀釋該制備物。隨后，用pbs1×過夜透析假病毒顆粒并儲(chǔ)存在4℃下備用。

免疫方案

將6周齡的balb/c小鼠(cerjjanvier，legeneststisle，france)用不同的疫苗制備物進(jìn)行肌內(nèi)免疫。組1的小鼠接受鹽水，組2至5的小鼠分別接受有或沒有氫氧化鋁的10μghpv16l2-sa蛋白(l2sa)、l1stii-l2sa(l1l2savlp)、hpv16l1l2(l1l2vlps)。組6和7的小鼠分別接受1或10μgpires-hpv31l2δnls質(zhì)粒(dnal2)。組8至10的小鼠分別接受hpv31l1、hpv31l1-31l213-88vlp(l1/l2(13-88)vlp)、hpv31l1l2vlp(31l1l2vlp)。組11的小鼠接受10μg含有hevorf2108-660表達(dá)質(zhì)粒(hevpsv)的hpv31假病毒顆粒。組12和13的小鼠分別接受含有g(shù)fp表達(dá)質(zhì)粒(gfppsv)的hpv58假病毒顆粒和包封有hpv31l2δnls質(zhì)粒(l2psv)的hpv58假病毒顆粒。通過western印跡分析在不同的l1l2vlp和假病毒顆粒之間調(diào)節(jié)l1蛋白的量。在第0、7和21天對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。最后一次注射后兩周收集血清樣品并儲(chǔ)存于-20℃。所有動(dòng)物操作都是按照批準(zhǔn)的方案進(jìn)行的，并且遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合理使用和照顧的推薦標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)由地區(qū)動(dòng)物倫理委員會(huì)(creeacentrelimousin)批準(zhǔn)。

通過elisa測(cè)定抗hpv血清效價(jià)

將200納克的vlp分配到96孔板(maxisorp，nunc，atgc，marne-la-vallée，france)的一半孔中，并在4℃下孵育過夜。用pbs-吐溫(0.1％)清洗兩次后，在37℃下用補(bǔ)充有1％fcs的pbs飽和1小時(shí)。在45℃下，將孔一式兩份(一個(gè)測(cè)試和一個(gè)對(duì)照)用以稀釋緩沖液(pbs5x，1％吐溫，10％fcs)兩倍稀釋(始于1∶25)的小鼠血清孵育1小時(shí)。清洗4次后，將在pbs-吐溫(1％)-fcs(10％)中按1∶1000稀釋的過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠igg(fc特異性的)(sigmaaldrich)添加至孔中，并在45℃下孵育1小時(shí)。清洗4次后，添加在25mmol/l檸檬酸鈉和50mmol/lna2hpo4中的0.4mg/ml鄰苯二胺和0.03％過氧化氫。30分鐘之后，用h2so44n終止反應(yīng)并在492nm讀取光密度(od)。對(duì)于數(shù)據(jù)分析，從測(cè)試抗原的od值中減去在l2不存在下獲得的od值。當(dāng)測(cè)試孔與對(duì)照孔之間od差異大于0.2時(shí)，結(jié)果被認(rèn)為是陽(yáng)性的。各效價(jià)代表給出od差異大于0.2的最終稀釋度的倒數(shù)。各小鼠的值為一式兩份的平均值。計(jì)算每個(gè)組的幾何平均效價(jià)(geometricmeantiter，gmt)。將沒有可檢出抗體效價(jià)(＜25)的動(dòng)物的效價(jià)指定為1，以計(jì)算gmt。對(duì)于抗l2抗體的檢測(cè)而言，進(jìn)行與上文中所述相同的elisa，不同之處是將純化的l2sa蛋白添加至vlp所在的nunc板的每個(gè)孔中。

通過elisa檢測(cè)l1、l2和strep-tag基序

通過elisa分析了嵌合vlp的l1抗原性和l2或strep-tag模體在vlp表面上的存在。在4℃下，用200ngvlp將微滴定板的孔包被過夜。按照上文中的描述，使用抗streptagii的單克隆抗體或多克隆的抗l2抗體進(jìn)行elisa，用來(lái)分別研究vlp表面上的streptagii基序和l2蛋白的存在，或使用h16.v5和h31.f16單克隆抗體，以分別研究hpv16和hpv31l1蛋白的構(gòu)象表位的存在。

hpv16、18、31和58假病毒顆粒的中和測(cè)定

通過抑制用含有pgl3-luc質(zhì)粒的假病毒顆粒對(duì)cos-7細(xì)胞的假感染來(lái)進(jìn)行中和測(cè)定。在96孔板(tpp，atgc)中接種cos-7細(xì)胞(104/孔)。在37℃下孵育24小時(shí)之后，清洗細(xì)胞兩次，之后加入假病毒顆粒/稀釋的血清混合物。調(diào)節(jié)假病毒顆粒的量以獲得0.2rlu的相對(duì)螢光素酶活性(luminoskanascent，thermoscientific，courtaboeuf，france)(hpv16為1∶500、hpv18為1∶50、hpv31為1∶800和hpv58為1∶10000)，并且將50μl的稀釋的假病毒顆粒與50μl以不完全dmem兩倍稀釋(從1∶25至1∶51，200)的小鼠血清混合。在37℃下孵育1小時(shí)之后，將所述混合物添加至孔中。37℃下3小時(shí)后，添加100μl完全dmem。

在37℃下孵育48h之后，測(cè)量螢光素酶的基因表達(dá)(螢火蟲螢光素酶一步測(cè)定試劑盒，fluoprobes，interchim，france)。結(jié)果表示為螢光素酶活性抑制的百分比[richards等，pnasusa2006；103(5)：1522-7]。表示的數(shù)據(jù)為以一式兩份進(jìn)行的2至3個(gè)測(cè)定的均值。中和效價(jià)定義為誘導(dǎo)螢光素酶活性降低至少50％的小鼠血清的最高稀釋度的倒數(shù)。計(jì)算每組的幾何平均效價(jià)。將沒有可檢測(cè)中和性抗體的動(dòng)物的效價(jià)指定為1，以計(jì)算gmt。僅在組10、12和13中研究了hpv16中和性抗體。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

比較各抗體效價(jià)和幾何平均效價(jià)，以評(píng)價(jià)elisa和中和性應(yīng)答。使用xlstat軟件(addinsoft，paris，france)通過t檢驗(yàn)比較組的結(jié)果(每組10只動(dòng)物)。

結(jié)果

hpv31l2和hpv16l2嵌合顆粒以及編碼l2的hpv58假病毒顆粒的生產(chǎn)

我們生產(chǎn)了兩種嵌合l1-l2顆粒，以研究l2疫苗針對(duì)廣譜hpv類型的保護(hù)潛力。為了用l2修飾衣殼的外側(cè)，第一種是基于hpv16l1修飾的vlp蛋白與融合至streptactin的hpv16l2蛋白之間的相互作用，所述streptactin為鏈霉親和素的工程化形式。為實(shí)現(xiàn)這一目的，將模擬生物素結(jié)合環(huán)的序列streptagii肽(wshpqfek，seqidno：12)插入到l1蛋白的de環(huán)位置140/141之間，以避免生物素與l1vlp化學(xué)偶聯(lián)，生物素具有與l1中和表位偶聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)使用重組桿狀病毒在sf-21昆蟲細(xì)胞中表達(dá)和在cscl梯度上純化時(shí)，l1stii重組蛋白自組裝成為與野生型l1蛋白具有相同外觀和類似產(chǎn)量的病毒樣顆粒(圖16)。將載玻片用乙酸鈾酰負(fù)染并用透射電鏡以50000×放大倍數(shù)觀察(標(biāo)尺條＝200nm)。

第二種嵌合型l1/l2蛋白含有插入到hpv31l1蛋白的de環(huán)中的hpv31l2肽(aa13-88)。當(dāng)使用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，l1l2(13-88位)重組蛋白不允許產(chǎn)生形狀良好的vlp，而是主要導(dǎo)致蛋白和/或殼粒的聚集(圖16)。

通過elisa，使用針對(duì)構(gòu)象和線性表位的抗l1mab研究了這兩種嵌合vlp的l1抗原性(圖17)。結(jié)果表明，嵌合型hpv16l1stiivlp上h16.v5所識(shí)別的構(gòu)象l1表位不受影響。然而，與所觀察到的與hpv31l1vlp的結(jié)合相比，觀察到了h31.f16mab與hpv31l1-l213-88vlp的結(jié)合的明顯降低。還通過elisa，使用分別針對(duì)streptagii序列或多克隆的抗l2抗體的mab研究了vlp表面上的streptagii或l2肽(13-88)的存在。所獲得的結(jié)果(圖17)顯示，streptagii和l2序列存在于嵌合vlp的表面上。

此外，通過將5μgvlp與對(duì)應(yīng)于1/1質(zhì)量比(一個(gè)l2sa蛋白/一個(gè)l1蛋白)的10μgl2sa融合蛋白混合而測(cè)定了l1stiivlp與l2sa蛋白結(jié)合的能力。通過復(fù)合vlp的超離心繼之以用western印跡檢測(cè)l2sa分析了l2sa與l1stiivlp的結(jié)合。在超離心沉淀中檢測(cè)到l2sa和l1stiivlp(圖18)，表明l2sa蛋白與vlp有效地結(jié)合。當(dāng)l2sa與野生型hpv16vlp混合時(shí)，未觀察到結(jié)合。elisa也證明了l2蛋白在l1l2savlp中的存在(圖17)。在293ft細(xì)胞中生產(chǎn)了包封有編碼hpv-31l2δnls基因的質(zhì)粒的hpv58假病毒顆粒。通過感染cos-7細(xì)胞研究了其轉(zhuǎn)導(dǎo)l2基因的能力。l2蛋白表達(dá)的western印跡分析表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)后兩天檢測(cè)到了l2(圖18)。為了排除在cos-7細(xì)胞中檢出的l2是因?yàn)榇嬖谳斎氲募俨《绢w粒的可能性，用包封了gfp基因的類似假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)了cos-7細(xì)胞。在這些情況下，未證明l2的存在(圖18)。

用嵌合vlp和假病毒顆粒免疫的小鼠中的抗hpv16-l2免疫應(yīng)答

在未免疫的小鼠中未檢測(cè)到抗hpv16l2抗體(組1)。在接受l2sa蛋白的小鼠(組2)中，觀察到了348的抗l2gmt(表6)。在用hpv16l1l2savlp和hpv16l1l2vlp免疫的小鼠(組3和4)中，觀察到了抗l2抗體水平的增加，gmt分別為1160和1055(p＝0.035和p＝0.05)。向hpv16l1l2vlp中添加氫氧化鋁作為佐劑(組5)進(jìn)一步以非顯著性的方式(p＝0.247)增加了同源性的抗l2抗體的水平。

在用hpv31l1vlp免疫的小鼠(組8)中未檢測(cè)到抗l2抗體，但在l1l213-88vlp免疫的所有小鼠(組9)中，gmt為730，而在以lil2vlp免疫的小鼠(組10)中水平更高，gmt為1100(p＝0.189)。在以對(duì)照假病毒顆粒免疫接種的小鼠(組11和12)中，檢測(cè)到了類似水平的抗l2抗體，gmt為855和1212(p＝0.459)。通過比較這些對(duì)照假病毒顆粒，在以編碼l2的假病毒顆粒免疫的小鼠中，抗l2gmt(2600)更高(分別為p＝0.001和p＝0.101)。

表6：

誘導(dǎo)針對(duì)hpv18、hpv31和hpv58的中和性抗體

用hpv16l2sa蛋白或hpv16l1l2vlp免疫的小鼠(組3至5)中均未產(chǎn)生針對(duì)異源hpv類型(hpv18、hpv31和hpv58)的中和性抗體(表6)。當(dāng)向通過l1和l2蛋白的自組裝獲得的hpv16vlp中添加氫氧化鋁時(shí)，僅僅檢測(cè)到針對(duì)hpv31的低水平的中和性抗體(gmt85)(組5)。

在以hpv31l1或hpv31l1l2vlp和hpv31hevpsv免疫的小鼠(組8、10和11)中檢測(cè)到了同源性的hpv31中和性抗體，gmt分別為2800、3400和5198(圖19)。低效價(jià)的hpv58中和性抗體僅在接受hpv31l1l2vlp(組10)和含有hevorf2無(wú)關(guān)基因的hpv31假病毒顆粒(組11)的小鼠中觀察到。在接受hpv31疫苗制備物的來(lái)自組8至11的小鼠中，未檢測(cè)到針對(duì)hpv18的中和性抗體。

在以hpv58假病毒顆粒免疫接種的小鼠(組12和13)中檢測(cè)到了高水平的同源中和性抗體，gmt分別為4650和5382。在以編碼gfp的假病毒顆粒免疫的小鼠中檢測(cè)到了低水平的針對(duì)hpv31(gmt＝50)的中和性抗體，并且在以編碼hpv31l2蛋白的hpv58假病毒顆粒免疫的小鼠中觀察到了顯著增加的抗hpv31中和性抗體(gmt為733)。僅在用hpv58l2psv免疫的小鼠中，僅僅檢測(cè)到針對(duì)hpv18的中和性抗體，gmt為400。還研究了來(lái)自組10、12和13的小鼠的hpv16中和性抗體。以hpv31l1l2vlp免疫接種的小鼠產(chǎn)生了低水平的hpv16中和性抗體，gmt為40。在以編碼gfp的hpv58psv免疫的小鼠(組12)中未檢測(cè)到hpv16中和性抗體，但在以編碼l2的hpv58psv免疫的小鼠(組13)中檢測(cè)到了hpv16，gmt為60。

專利、專利申請(qǐng)和科學(xué)出版物以及參考文獻(xiàn)通過引用全文并入本文。

以下內(nèi)容對(duì)應(yīng)于母案申請(qǐng)中的原始權(quán)利要求書，現(xiàn)作為說(shuō)明書的一部分并入此處：

1.一種遞送化合物至對(duì)象的方法，所述方法包括

給對(duì)象施用經(jīng)修飾人乳頭瘤病毒(hpv)樣顆粒，其中所述顆粒包含一種或多種包封在hpv樣顆粒中的異源化合物，所述顆粒包含免疫原性改變的表面蛋白。

2.項(xiàng)1的方法，其中所述表面蛋白為具有經(jīng)修飾fg環(huán)序列的經(jīng)修飾l1蛋白。

3.項(xiàng)2的方法，其中所述l1蛋白具有hpv16、hpv31、hpv33、hpv34、hpv35、hpv52、hpv58、hpv73或hpv91血清型的序列，并且其中所述l1蛋白的fg環(huán)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，所述改變使所述蛋白在人對(duì)象中的免疫原性發(fā)生改變。

4.項(xiàng)3的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變是在seqidno：11的x1-x17中的一個(gè)或多個(gè)位置上。

5.項(xiàng)4的方法，其中在位置x16的氨基酸沒有改變。

6.項(xiàng)5的方法，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的一個(gè)或多個(gè)是經(jīng)修飾的。

7.項(xiàng)6的方法，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的2-3個(gè)是經(jīng)修飾的。

8.項(xiàng)6的方法，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的4-7個(gè)是經(jīng)修飾的。

9.項(xiàng)6的方法，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的3個(gè)是經(jīng)修飾的。

10.項(xiàng)6的方法，其中seqidno：11的位置x6、x11和x14是經(jīng)修飾的。

11.項(xiàng)6的方法，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14全部都是經(jīng)修飾的。

12.項(xiàng)10的方法，其中所述l1蛋白具有hpv16血清型的序列，其中seqidno：11的位置x6、x11和x14分別改變成t、t和n，并且seqidno：11的其余位置具有hpv16血清型的特征性氨基酸。

13.項(xiàng)10的方法，其中所述l1蛋白具有hpv16血清型的序列，其中位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14分別改變成f、s、t、s、t、t和n，并且seqidno：11的其余位置具有hpv16血清型的特征性氨基酸。

14.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種化合物是治療劑或醫(yī)療劑。

15.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑是核酸或小分子。

16.項(xiàng)15的方法，其中所述治療劑是sirna、shrna或者編碼sirna或shrna的核酸。

17.項(xiàng)16的方法，其中所述sirna或shrna靶向hpv-e6和/或hpv-e7。

18.項(xiàng)15的方法，其中所述小分子是抗病毒劑。

19.項(xiàng)15的方法，其中所述小分子是抗癌劑。

20.項(xiàng)15的方法，其中所述小分子是吉西他濱。

21.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒與其它藥劑一起施用。

22.項(xiàng)21的方法，其中所述其它藥劑是抗病毒劑。

23.項(xiàng)21的方法，其中所述其它藥劑是抗癌劑。

24.項(xiàng)21的方法，其中所述其它藥劑是吉西他濱。

25.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述醫(yī)療化合物是成像劑或造影劑。

26.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒施用給對(duì)所述表面蛋白的血清型沒有中和免疫應(yīng)答的對(duì)象。

27.項(xiàng)26的方法，其中所述對(duì)象未針對(duì)所述表面蛋白的血清型進(jìn)行過免疫。

28.項(xiàng)26的方法，其中所述對(duì)象未感染過具有與所述hpv樣顆粒中所述表面蛋白的血清型相同血清型的hpv。

29.項(xiàng)26的方法，其中所述對(duì)象的所述免疫應(yīng)答是在選擇用于施用的hpv樣顆粒之前評(píng)價(jià)的。

30.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒施用于粘膜組織。

31.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒施用于上皮部位。

32.項(xiàng)30的方法，其中所述粘膜組織是宮頸組織。

33.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒被表面施用。

34.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒被靜脈施用。

35.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒施用于感染了病毒的組織。

36.項(xiàng)35的方法，其中所述病毒是hpv。

37.項(xiàng)35的方法，其中所述病毒是皰疹病毒。

38.項(xiàng)37的方法，其中所述病毒是hsv。

39.項(xiàng)35-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物是抗病毒化合物。

40.項(xiàng)35-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物是靶向病毒rna的sirna、hnrna或反義rna。

41.項(xiàng)35-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物是表達(dá)靶向病毒rna之sirna、hnrna或反義rna的質(zhì)粒。

42.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒施用于患有與hpv感染相關(guān)的癌的對(duì)象。

43.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒施用于患有與hpv感染相關(guān)病毒感染的對(duì)象。

44.項(xiàng)43的方法，其中所述病毒感染是hsv感染。

45.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述hpv樣顆粒施用于患有與hpv感染相關(guān)之細(xì)菌或寄生蟲感染的對(duì)象。

46.一種在有免疫系統(tǒng)缺陷的對(duì)象中治療皮膚病癥的方法，

所述方法包括將前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物施用于有免疫系統(tǒng)缺陷的對(duì)象的皮膚感染部位，

其中所述組合物包含用于治療皮膚感染的藥劑。

47.項(xiàng)46的方法，其中所述免疫系統(tǒng)缺陷與hiv感染相關(guān)。

48.項(xiàng)46的方法，其中所述皮膚感染為病毒、細(xì)菌、微生物或寄生蟲感染。

49.一種方法，包括給患有癌的對(duì)象施用前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的表面組合物，其中所述組合物包含有效降低癌的生長(zhǎng)或發(fā)育的化合物，并且其中所述組合物與用于促進(jìn)施用部位的非特異性免疫應(yīng)答的組合物一起施用。

50.一種方法，包括給患有癌的對(duì)象施用前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的表面組合物，其中所述組合物包含有效降低癌的生長(zhǎng)或發(fā)育的化合物，并且其中施用兩種或更多種具有不同血清型的不同hpv表面蛋白，以促進(jìn)施用部位的免疫應(yīng)答。

51.一種向?qū)ο笫┯没衔锏姆椒?，所述方法包括?/p>

在第一時(shí)間段中向?qū)ο笫┯冒衔锏牡谝籬pv樣顆粒，和

在第二時(shí)間段中向?qū)ο笫┯冒龌衔锏牡诙pv樣顆粒，其中所述第一和第二hpv樣顆粒具有不同的血清型。

52.項(xiàng)51的方法，其中所述第一和第二hpv樣顆粒的血清型獨(dú)立地為天然或改變的血清型。

53.項(xiàng)52的方法，其中所述第一和/或第二hpv樣顆粒的血清型是嵌合的血清型。

54.一種治療對(duì)象中hpv相關(guān)宮頸癌的方法，所述方法包括：

給患有hpv相關(guān)宮頸癌的對(duì)象施用hpv樣顆粒，所述顆粒包含一種或多種治療劑，其量足以治療所述hpv相關(guān)宮頸癌。

55.項(xiàng)54的方法，其中所述hpv樣顆粒表面施用。

56.項(xiàng)54的方法，其中所述hpv樣顆粒表面施用于上皮或其附近，所述上皮例如宮頸上皮；或者表面施用于上皮病變處或其附近，所述病變例如宮頸癌或肛門上皮癌。

57.一種用于將化合物遞送給對(duì)象的組合物，所述組合物包含經(jīng)修飾人乳頭瘤病毒(hpv)樣顆粒，其中所述顆粒包含包封于hpv樣顆粒中的一種或多種異源化合物，所述顆粒包含免疫原性改變的表面蛋白。

58.項(xiàng)57的所述組合物，其中所述衣殼蛋白是l1蛋白。

59.項(xiàng)58的所述組合物，其中所述l1蛋白具有經(jīng)修飾fg環(huán)序列。

60.項(xiàng)59的所述組合物，其中所述l1蛋白具有hpv16、hpv31、hpv33、hpv34、hpv35、hpv52、hpv58、hpv73或hpv91血清型的序列，并且其中所述l1蛋白的fg環(huán)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，所述改變使該蛋白在人對(duì)象中的免疫原性發(fā)生改變。

61.項(xiàng)60的所述組合物，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變是在seqidno：11的x1-x17中的一個(gè)或多個(gè)位置處。

62.項(xiàng)59-61中任一項(xiàng)的組合物，其中位置x16的氨基酸沒有改變。

63.項(xiàng)59-61中任一項(xiàng)的組合物，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的一個(gè)或多個(gè)是經(jīng)修飾的。

64.項(xiàng)63的組合物，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的2-3個(gè)是經(jīng)修飾的。

65.項(xiàng)63的組合物，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的4-7個(gè)是經(jīng)修飾的。

66.項(xiàng)63的組合物，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14中的3個(gè)是經(jīng)修飾的。

67.項(xiàng)63的組合物，其中seqidno：11的位置x6、x11和x14是經(jīng)修飾的。

68.項(xiàng)63的組合物，其中seqidno：11的位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14全部是經(jīng)修飾的。

69.項(xiàng)67的組合物，其中所述l1蛋白具有hpv16血清型的序列，其中seqidno：11的位置x6、x11和x14分別改變成t、t和n，并且seqidno：11的其余位置具有hpv16血清型的特征性氨基酸。

70.項(xiàng)68的組合物，其中所述l1蛋白具有hpv16血清型的序列，其中位置x1、x2、x3、x5、x6、x11和x14分別改變成f、s、t、s、t、t和n，并且seqidno：11的其余位置具有hpv16血清型的特征性氨基酸。

71.項(xiàng)57的組合物，其中所述一種或多種化合物是治療劑或醫(yī)療劑。

72.項(xiàng)71的組合物，其中所述治療劑是核酸或小分子。

73.項(xiàng)72的組合物，其中所述治療劑是sirna、shrna或者編碼sirna或shrna的核酸。

74.項(xiàng)73的組合物，其中所述sirna或shrna靶向hpv-e6和/或hpv-e7。

75.項(xiàng)72的組合物，其中所述小分子是抗病毒劑。

76.項(xiàng)75的組合物，其中所述小分子是抗癌劑。

77.項(xiàng)75的組合物，其中所述小分子是吉西他濱。

78.項(xiàng)57的組合物，其中所述hpv樣顆粒包含l1蛋白，或者包含l1蛋白與l2蛋白。

79.項(xiàng)57的所述組合物，其中所述表面蛋白是嵌合的，并且包含融合進(jìn)l1環(huán)中的l2序列。

80.項(xiàng)57的組合物，其中所述l2序列附著至l1顆粒的表面。

81.項(xiàng)79或80的組合物，其中所述l2序列是hpv31l2蛋白的13至88位殘基。

序列表

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<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>x=eord

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>x=vori

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(25)

<223>x=sort

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(27)

<223>x=任何氨基酸或無(wú)氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(30)

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<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(31)

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<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(37)

<223>x=任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(39)

<223>x=fory

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(40)

<223>x=任何氨基酸

<400>11

phevalarghisxaapheasnargxaaglyxaaxaaglyxaaxaaxaa

151015

proxaaaspleuxaailexaaglyxaaxaaxaaglyxaaxaaxaaxaa

202530

xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaathr

3540

<210>12

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>12

trpserhisproglnpheglulys

15

<210>13

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>13

uacaacaaaccguugugug19

<210>14

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>14

cuaacuaacacuggguuau19

<210>15

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n=t

<400>15

gagguauaugacuuugcuunn21

<210>16

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>n=t

<400>16

nncuccauauacugaaacgaa21

<210>17

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n=t

<400>17

aggaggaugaaauagauggnn21

<210>18

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>n=t

<400>18

nnuccuccuacuuuaucuacc21

<210>19

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>19

caccagagttcaaaagcccttcatcgaaatgaagggcttttgaactc47

<210>20

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>20

aaaaagagttcaaaagcccttcatttcgatgaagggcttttgaactc47

<210>21

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>21

caccgctacacaaatcagcgatttcgaaaaatcgctgatttgtgtag47

<210>22

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>22

aaaactacacaaatcagcgatttttcgaaatcgctgatttgtgtagc47

<210>23

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>23

caccaggaggatgaaatagatggttcgaaaaccatctatttcatcctcc49

<210>24

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>24

aaaaggaggatgaaatagatggttttcgaaccatctatttcatcctcct49

<210>25

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>25

caccgcccattacaatattgtaacccgaaggttacaatattgtaatgggc50

<210>26

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>26

aaaagcccattacaatattgtaaccttcgggttacaatattgtaatgggc50

<210>27

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>27

caacgaggtatatgactttgcttttcgaaaaaagcaaagtcatatacctc50

<210>28

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>28

aaaagaggtatatgactttgcttttttcgaaaagcaaagtcatatacctc50

<210>29

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>29

caccggtcgatgtatgtcttgttgccgaagcaacaagacatacatcgacc50

<210>30

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>30

aaaaggtcgatgtatgtcttcttgcttcggcaacaagacatacatcgacc50

<210>31

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>31

caccaaaagagaactgcaatgt22

<210>32

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>32

ttgctgttctaatgttgttcca22

<210>33

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>33

ggagatacacctacattgcatga23

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>34

ggggcacacaattcctagtg20

<210>35

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>35

acagtccatgccatcactgcc21

<210>36

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>36

gcctgcttcaccaccttcttg21

<210>37

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>37

ggatcccaccatgagcctgtggagacccagc31

<210>38

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>38

ggaagcttatgtggtggtgctggcgctgggggc33

<210>39

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>39

gcaagcttaggcctgcagcaggaactttctgccc34

<210>40

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>40

ccgctagccaccatgagcctgtggagaccc30

<210>41

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>41

ctctctgctggcggggtcgttgaagaagtgccgcacgaa39

<210>42

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>42

cggaattctatcacttcttggttttcttcc30

<210>43

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>43

gaccccgccagcagagagagaagcggcaccgtgggcgag39

<210>44

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>44

servalprothraspleutyrilelys

15

<210>45

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>45

arghisphepheasnargserglythrval

1510

<210>46

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>46

aspleuiletyrlys

15

<210>47

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>47

arghisphepheasnargsergly

15

<210>48

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>48

serglythrvalglygluservalpro

15

<210>49

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>49

argserglythrvalgly

15

<210>50

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>50

argserglythrvalglygluserval

15

<210>51

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>51

ggatcccaccatgagcctgtggagacccagc31

<210>52

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>52

aagctttcacttcttggttttcttccgcttg31

<210>53

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>53

cttctcgaactgggggtggctccagttctcggtgtcgtccagcttgttc49

<210>54

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>54

tggagccacccccagttcgagaaggccagcgcctacgccgccaacgcc48

<210>55

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>55

aagctttcacttcttggttttcttccgcttg31

<210>56

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>56

ggatcccaccatgagcctgtggagacccagc31

<210>57

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>57

cgggtctagagaattctcgagagggcctccggcgtatctgttgc44

<210>58

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>58

ctcgagaattctctagacccgggcaccgataacagggagtgc42

<210>59

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>59

cccgggggccagggtgtcggtggcggt27

<210>60

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>60

ctcgaggccagcgccacccagctgtacaag30

<210>61

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>61

gtcgaccatgtagtagctggggtgcaggatg31

<210>62

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>62

ccggatccgccaccatggccagcgccacccagctg35

<210>63

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>63

ccctctagagccaccatggccagcgccacccagctgtac39

<210>64

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>64

gcggccgctatcacaggatgtagtagctggggtgcag37

<210>65

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>65

aspproalaserargglu

15