本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架用于制備巨噬細胞m2極化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架(scs)，以膠原纖維內(nèi)部無定形水合二氧化硅有序沉積為特征，是一種具有良好理化性能和機械性能的生物材料。我們的前期研究顯示，scs在體外、體內(nèi)均表現(xiàn)出了良好的促進骨缺損修復(fù)的能力，scs在植入體內(nèi)早期，可作用于宿主單核細胞使其表型轉(zhuǎn)化為trap陽性分泌型細胞，并促進其分泌vegf、tgf-β、sdf-1及pdgf-bb等活性因子，促進骨缺損區(qū)域早期血管化，從而為內(nèi)源性骨再生提供營養(yǎng)及氧氣等環(huán)境優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架浸提液用于制備巨噬細胞m2極化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用和仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架用于制備巨噬細胞m2極化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。

發(fā)明人前期研究已證實仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架具備低免疫原性，高效促成骨、成血管活性，值得注意的是，發(fā)明人進一步研究顯示仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架在體內(nèi)及體外環(huán)境中均可顯著促進巨噬細胞的m2型極化，從而能夠有效調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)向著促進組織修復(fù)及愈合的良性方向發(fā)展，最終促進材料與機體的有機整合及骨缺損的修復(fù)。

附圖說明

圖1為流式細胞計數(shù)檢測scs浸提液對巨噬細胞m1/m2極化的影響(數(shù)據(jù)圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)；

圖2為流式細胞計數(shù)檢測scs浸提液對巨噬細胞胞內(nèi)誘導(dǎo)性一氧化碳合酶蛋白表達的影響(數(shù)據(jù)圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)；

圖3為實時定量pcr檢測scs浸提液對巨噬細胞胞內(nèi)炎癥因子、抗炎因子及生長因子基因表達的影響(數(shù)據(jù)圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)；

圖4中a圖為mtt實驗檢測scs浸提液對巨噬細胞增殖活動的影響；b圖為流式細胞計數(shù)檢測scs浸提液對巨噬細胞凋亡活動的影響；

圖5為實時定量pcr檢測經(jīng)scs刺激的巨噬細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨相關(guān)基因表達的影響(圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)；

圖6為堿性磷酸酶染色檢測經(jīng)scs刺激的巨噬細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨活動的影響(數(shù)據(jù)圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)；

圖7為茜素紅染色檢測經(jīng)scs刺激的巨噬細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨活動的影響(數(shù)據(jù)圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)；

圖8為免疫組化染色檢測scs體內(nèi)植入?yún)^(qū)m2型巨噬細胞標(biāo)識分子cd163蛋白的表達，以及m1型巨噬細胞標(biāo)識分子cd68及ccr7蛋白的表達(*代表對照組與預(yù)實驗組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，p<0.05)；

圖9為大鼠股骨部分缺損模型應(yīng)用scs修復(fù)后1個月時的micro-ct檢測結(jié)果(數(shù)據(jù)圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)；

圖10為大鼠股骨部分缺損修復(fù)后1個月時的硬組織切片vangeison染色結(jié)果(數(shù)據(jù)圖中不同字母表示組間存在統(tǒng)計學(xué)差異p<0.05；相同字母表示組間無統(tǒng)計學(xué)差異p>0.05)。

具體實施方式

發(fā)明人前期研究結(jié)果顯示：scs具有較低的免疫原性，對淋巴細胞的二次刺激并沒有引起明顯的增殖反應(yīng)(p>0.05)；同時，材料的異位植入對循環(huán)淋巴細胞的數(shù)量、活性沒有影響(p>0.05)，循環(huán)中的炎癥因子濃度也維持在正常水平(p>0.05)；原位組織學(xué)切片的he染色結(jié)果顯示，硅化膠原支架在植入后7天、14天發(fā)生了明顯的吸收，材料周圍無明顯炎癥細胞浸潤，證明了仿生硅化膠原支架材料具有良好的生物相容性，可以進一步安全地應(yīng)用于體內(nèi)骨缺損修復(fù)。

本發(fā)明的scs浸提液是將scs在rmpi1640細胞培養(yǎng)液浸泡適宜時間后，收集培養(yǎng)液所得。

發(fā)明人以scs作為研究模型，以人外周血中分離的單核-巨噬細胞作為研究對象，通過細胞形態(tài)學(xué)觀察及半定量分析、流式細胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、實時定量pcr方法對材料表面形貌對巨噬細胞炎癥功能的影響進行了研究。

scs浸提液制備：

將scs切成500mg每份的長方體，浸于50ml配制好的rmpi1640細胞培養(yǎng)液中，4℃放置48小時后，取出材料，收集培養(yǎng)液作為scs浸提液，用于后續(xù)實驗中對細胞進行刺激。

單核-巨噬細胞獲?。?/p>

根據(jù)ma等的報道(biomaterials.2014dec；35(37):9853-67)，采用基于泛影鈉溶液的梯度離心法分離人外周血單個核細胞，并采用黏附法純化單核細胞。用含5％胎牛血清的rmpi1640培養(yǎng)基培養(yǎng)新鮮分離并純化的單核細胞，培養(yǎng)基中不添加任何有可能刺激單核細胞的藥物。將單核細胞以1×10⁶個/孔接種于6孔板中，用于體外浸提液的刺激實驗。

研究結(jié)果如下：

(1)采用scs浸提液培養(yǎng)巨噬細胞6天，可顯著誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生m2極化，表現(xiàn)為較溶劑對照組顯著促進cd11b⁺f4/80⁺cd11c^-cd206⁺亞型m2巨噬細胞占總細胞的百分比，該百分數(shù)與陽性對照組(il4+il13刺激組)無顯著差異(圖1)；scs亦可顯著促進m2巨噬細胞胞內(nèi)標(biāo)志性蛋白誘導(dǎo)性一氧化碳合酶(inos)的表達(圖2)；同時抑制促炎癥因子il-1β、il-6及il-8的分泌，促進抑炎因子il-10及生長因子pdgf-bb、tgf-β的分泌(圖3)。

(2)scs浸提液培養(yǎng)巨噬細胞6天，對巨噬細胞增殖、凋亡活動并不顯著影響(圖4)。

(3)經(jīng)scs浸提液刺激的巨噬細胞可顯著促進骨髓間充質(zhì)干細胞(bmscs)的成骨分化，表現(xiàn)為促進其成骨相關(guān)標(biāo)志物osterix，runx2，osteocalcin，alp及col1基因表達水平的增強(圖5)，促進其堿性磷酸酶活性(圖6)，促進其形成茜素紅強陽性成骨結(jié)節(jié)(圖7)。

(4)在大鼠股骨部分缺損的動物模型中，scs植入一個月后可顯著促進植入?yún)^(qū)局部m2亞型巨噬細胞的形成，表現(xiàn)為局部cd163陽性m2型巨噬細胞百分數(shù)較對照組顯著增高(圖8)，然而，scs植入?yún)^(qū)cd68及ccr7陽性m1亞型巨噬細胞的百分數(shù)則較對照組顯著降低(圖8)。

(5)伴隨局部m2亞型巨噬細胞的增多，局部新生骨量也顯著增高。micro-ct結(jié)果顯示scs能夠明顯的提升小鼠股骨缺損的修復(fù)水平(p<0.05)。和對照組相比，在術(shù)后1個月時，能夠觀察到缺損區(qū)形成了更多的新骨，同時其修復(fù)后的骨組織的改建活動更加活躍(圖9)。vangeison染色的結(jié)果顯示(圖10)，scs修復(fù)后1個月時，大鼠股骨的缺損區(qū)域內(nèi)形成了更多的膠原纖維組織(紅色染色部分)，對其進行半定量分析后，其陽性區(qū)域明顯高于對照組(p<0.05)。

人工材料植入體內(nèi)后，巨噬細胞及其分泌的細胞因子會首先向材料植入?yún)^(qū)集聚，并產(chǎn)生一系列級聯(lián)免疫反應(yīng)，當(dāng)材料未能促進或保持相關(guān)免疫反應(yīng)向良性愈合發(fā)展，便會引起局部炎癥反應(yīng)、細胞死亡以及組織不能愈合等一系列問題，因此人工材料對宿主巨噬細胞啟動的免疫應(yīng)答的影響，直接關(guān)系到其最終的修復(fù)效果。巨噬細胞具有高度的功能可塑性，當(dāng)其遷移至材料植入?yún)^(qū)后，可在局部微環(huán)境的作用下以不同方式激活極化，m1型極化的巨噬細胞主要發(fā)揮促炎和組織防御的作用，m2型巨噬細胞則主要行使抗炎及組織修復(fù)作用，因此巨噬細胞的m1/m2極化狀態(tài)對于生物材料植入后的骨愈合起到至關(guān)重要的作用。然而，現(xiàn)有的人工骨修復(fù)支架材料雖具備促成骨、促成血管的效應(yīng)，但并不具備對巨噬細胞調(diào)節(jié)的功能，造成體外與體內(nèi)實驗中促成骨效果的差異懸殊。發(fā)明人前期研究已證實仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架具備低免疫原性，高效促成骨、成血管活性，值得注意的是，發(fā)明人最新研究顯示該支架在體內(nèi)及體外環(huán)境中均可顯著促進巨噬細胞的m2型極化，從而能夠有效調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)向著促進組織修復(fù)及愈合的良性方向發(fā)展，最終促進材料與機體的有機整合及骨缺損的修復(fù)。進一步說明仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架兼具高促成骨活性以及巨噬細胞調(diào)節(jié)功能，可以實現(xiàn)促進組織修復(fù)與調(diào)控免疫結(jié)合。