本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域，具體涉及一種骨靶向脂質(zhì)體，含該脂質(zhì)體的藥物、制劑，制備方法，及其在制備治療骨病藥物中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨病是與骨和關(guān)節(jié)相關(guān)疾病的總稱(chēng)，主要包括骨質(zhì)疏松、骨折愈合障礙、關(guān)節(jié)炎和多種急慢性頸肩腰腿疼痛等相關(guān)的疾病。盡管現(xiàn)在針對(duì)各類(lèi)骨病已經(jīng)有一些相應(yīng)的藥物研究，并且其中一部分在臨床上已得到應(yīng)用，但是，由于骨組織硬度大、血流量低、滲透性差，生理生化過(guò)程特殊，因此，治療骨病的藥物幾乎都存在按一般給藥途徑難以有效轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位、療效差的問(wèn)題。大多數(shù)藥物需要全身給藥，為了在骨組織達(dá)到有效治療濃度，只有加大給藥劑量，這不僅降低藥物治療指數(shù)，還對(duì)患者的其他器官組織產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。

以骨質(zhì)疏松的治療情況為例：

骨質(zhì)疏松癥是老年人和絕經(jīng)婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病。其主要的發(fā)病機(jī)制是機(jī)體的骨重建的失衡。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折的全身性骨病。骨量低下是指骨組織單位體積內(nèi)骨質(zhì)含量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞指骨質(zhì)中鈣逐漸流失，骨小梁變薄、變細(xì)、斷裂和骨組織內(nèi)的孔隙增多，最終導(dǎo)致骨脆性增加，骨強(qiáng)度下降，容易發(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)主要有全身性的骨痛、駝背、身高縮短和骨折，最常見(jiàn)的骨折部位是胸、腰椎、股骨上端和橈骨遠(yuǎn)端骨折。骨質(zhì)疏松性骨折在骨質(zhì)疏松癥患者中的發(fā)病率為20％左右，且呈逐年上升的趨勢(shì)，成為威脅老年人身心健康和影響生活質(zhì)量的僅次于心血管疾病的嚴(yán)重疾病。特別是髖部骨折后，使患者失去生活自理能力，長(zhǎng)期臥床易并發(fā)感染、心血管疾病。隨著世界人口的增加和平均壽命的提高，這種疾病的威脅將越來(lái)越大。2008年10月20日在北京發(fā)布的《骨質(zhì)疏松癥防治中國(guó)白皮書(shū)》指出，我國(guó)至少有6944萬(wàn)人患有骨質(zhì)疏松，有2.1億人患低骨量存在骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)。預(yù)計(jì)到2020年我國(guó)骨質(zhì)疏松和低骨量患者將增加至2.8億。如果這么大的人群得不到早期干預(yù)治療，其后果將是骨折發(fā)生率大大增加，不但給患者帶來(lái)痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也會(huì)給醫(yī)療資源帶來(lái)不小的壓力。骨質(zhì)疏松癥已成為一個(gè)日益突出的社會(huì)公共健康問(wèn)題。

目前，治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有兩大類(lèi)：一類(lèi)是抑制骨吸收的藥物；一類(lèi)是促進(jìn)骨形成的藥物。前者有雙膦酸鹽(羥乙膦酸鈉和阿侖膦酸鈉等)、降鈣素(鮭魚(yú)降鈣素和鯁魚(yú)降鈣素衍生物)、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雌激素、活性維生素d和鈣劑；后者有氟化物、甲狀旁腺素、活性維生素d和合成類(lèi)固醇等。然而按一般的給藥途徑很難使此類(lèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至有效部位，有些藥物常需全身給藥或者多次給藥，才能在骨組織中達(dá)到有效的治療濃度，而這對(duì)病人的非骨組織或器官造成不必要的毒副作用。如長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素治療骨質(zhì)疏松癥易出現(xiàn)陰道出血、乳房腫痛、子宮內(nèi)膜增生和靜脈血栓等嚴(yán)重不良反應(yīng)；活性維生素d治療骨質(zhì)疏松癥呈劑量依賴(lài)性，然而增加vd用量時(shí)則可能引起高鈣血癥和高尿血癥。

為了提高治療骨病藥物的靶向性，降低藥物毒副作用，已有一些研究選用骨靶向分子作為藥物傳遞的載體，目前常見(jiàn)的靶向分子主要是寡肽類(lèi)和雙磷酸鹽類(lèi)。

寡肽類(lèi)的主要代表為八個(gè)重復(fù)序列的天冬氨酸八肽asp8和天冬氨酸與絲氨酸結(jié)合的短肽(aspserser)6，asp8主要分布在骨內(nèi)的骨吸收表面(wangd,millersc,shlyakhtenkols,etal.osteotropicpeptidethatdifferentiatesfunctionaldomainsoftheskeleton.bioconjugchem.200718(5):1375-8.)，而(aspserser)6被報(bào)道主要靶向到骨形成表面(gezhang,baoshengguo,hengwu.etal.adeliverysystemtargetingboneformationsurfacestofacilitaternai-basedanabolictherapy.naturemedicinevolume18number2|february2012)。本發(fā)明的發(fā)明人在專(zhuān)利cn102643330a中公開(kāi)了一種用天冬氨酸六肽(l-asp)6為骨靶向載體的藥物，可以避免活性成分對(duì)子宮造成不良影響。但是，寡肽類(lèi)為載體的藥物主要定位于骨吸收表面或骨形成表面，導(dǎo)致藥物在骨組織的分布仍具有較大的局限性。此外，寡肽類(lèi)作為骨靶向分子的另一缺點(diǎn)是價(jià)格較高，且相對(duì)容易變性，在體內(nèi)容易被體液所分解消耗，影響藥物傳遞效果，效費(fèi)比不高。

雙磷酸鹽類(lèi)分子結(jié)構(gòu)中的p-c-p鍵是產(chǎn)生骨靶向活性的必要條件(顧吉晉等，骨靶向性藥物及載體的研究進(jìn)展，中國(guó)藥劑學(xué)雜志，2009年，第7卷，第3期，191-197)，其在體內(nèi)主要可分布于骨吸收表面和骨形成表面，主要代表為阿倫磷酸鈉。阿倫磷酸鈉作為一個(gè)雙磷酸鹽藥物，在臨床上主要以抗骨吸收的特性用于骨質(zhì)疏松的治療。阿倫磷酸鈉也因?yàn)槠鋵?duì)羥基磷灰石具有良好的的親和力而常常被作為靶向?qū)蚍肿佑糜诠前邢蛑委熕幬锘蜓例X靶向治療藥物的靶頭。本發(fā)明的發(fā)明人在專(zhuān)利(us9545452b2)以及文章中報(bào)道了一種表面為雙磷酸鹽-聚乙二醇-膽固醇修飾含抗生素的脂質(zhì)體，具有骨靶向性(liuxm,zhangy,chenf,etal.preventionoforthopedicdevice-associatedosteomyelitisusingoxacillin-containingbiomineral-bindingliposomes.pharmres.2012；29(11):3169-79.)。本發(fā)明的發(fā)明人在專(zhuān)利cn104274407a中公開(kāi)了含丹參素的同一骨靶向脂質(zhì)體劑型。但是，雙磷酸鹽自身在骨組織具有抗骨吸收的藥理活性，可能會(huì)干擾其運(yùn)送藥物的作用，并且根據(jù)一些臨床使用案例的報(bào)道，雙磷酸鹽具有導(dǎo)致下顎骨壞死的安全隱患，將其用作藥物傳遞載體大量使用具有很大的風(fēng)險(xiǎn)，而且，雙磷酸鹽無(wú)法進(jìn)入皮質(zhì)骨的內(nèi)部、骨凹陷腔中，分布范圍同樣具有一定的局限性。

因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究并獲得具骨靶向性強(qiáng)、骨組織分布范圍廣、副作用小、成本低的脂質(zhì)體和骨靶向脂質(zhì)體藥物是本發(fā)明的發(fā)明人要解決的技術(shù)問(wèn)題之一。

骨病中的骨折是臨床最為常見(jiàn)的骨骼肌肉系統(tǒng)的傷害之一，每年大約影響著2％的人口，而在所有骨折中5～10％的病例會(huì)出現(xiàn)骨折愈合障礙，在開(kāi)放式長(zhǎng)骨骨折中，愈合障礙出現(xiàn)的比例更高。骨折愈合障礙是骨折最常見(jiàn)的并發(fā)癥，由于社會(huì)老齡化、吸煙、酗酒、藥物使用(如糖皮質(zhì)激素)和疾病(如糖尿病)等多種因素導(dǎo)致的骨折愈合障礙病例逐年增多，這給個(gè)人及社會(huì)均帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前骨折愈合障礙的治療手段有限，僅包括自體骨移植手術(shù)和bmp蛋白干預(yù)治療。bmp蛋白是被fda確切批準(zhǔn)能夠用于骨折愈合治療的唯一藥物，但需要與基質(zhì)搭配，并且只能用于脛骨開(kāi)放性骨折，適用范圍極為有限。無(wú)論是自體骨移植手術(shù)還是bmp蛋白干預(yù)的治療方法均存在操作不便、費(fèi)用高昂和安全性差等問(wèn)題，故難以滿(mǎn)足臨床的需求。

針對(duì)骨折愈合障礙發(fā)病率不低，又缺乏有效治療藥物的現(xiàn)狀，進(jìn)一步尋找簡(jiǎn)單、安全又有效的骨折愈合障礙藥物是本發(fā)明的發(fā)明人要解決的又一技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種骨靶向脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體以焦磷酸作為骨靶向載體，具有骨靶向性好、骨組織分布廣泛、副作用低的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的骨靶向脂質(zhì)體，包含具有式5結(jié)構(gòu)的化合物：

其中，n選自1～100的整數(shù)，優(yōu)選為2～20的整數(shù)，更優(yōu)選為2～10的整數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)選為2～5的整數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例，當(dāng)n為3，式5的化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

式5的化合物與磷脂、膽固醇制備具有骨靶向功能的脂質(zhì)體，在制備過(guò)程中加入藥物溶液，使藥物被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，再用帶濾膜的擠壓器將脂質(zhì)體擠壓過(guò)膜，即可獲得一定粒徑的骨靶向脂質(zhì)體藥物。式5的化合物中，膽固醇基團(tuán)充當(dāng)脂質(zhì)體雙分子層的錨固定分子，焦磷酸基團(tuán)伸出脂質(zhì)體雙分子層外充當(dāng)骨靶向分子。這種經(jīng)表面修飾的載藥脂質(zhì)體具有靶向、載藥、并控制釋放的多重特性。本發(fā)明的研究結(jié)果證明，式5化合物中的焦磷酸鹽基團(tuán)與雙磷酸鹽類(lèi)似，對(duì)羥基磷灰石有很好的粘附性，骨骼親和力高，而且與雙膦酸鹽只傾向性的靶向到骨吸收表面相比，式5化合物可以靶向到骨骼的各種表面，骨吸收、骨形成表面均可到達(dá)，還可以進(jìn)入到皮質(zhì)骨的內(nèi)部，以及進(jìn)入到骨凹陷腔中，制備的脂質(zhì)體可攜帶多種治療骨病的藥物廣泛分布于骨組織中，充分滿(mǎn)足多種骨病治療的需求，效果令人滿(mǎn)意。并且，焦磷酸在食品行業(yè)已經(jīng)廣泛使用數(shù)十年，其安全性得到充分確認(rèn)而且價(jià)格便宜，式5的化合物在體內(nèi)水解后，焦磷酸可安全代謝出體外，其他水解產(chǎn)物也不具有可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害的風(fēng)險(xiǎn)，安全性高。因此含有式5化合物的脂質(zhì)體克服了現(xiàn)有骨靶向藥物的多種缺陷，為多種缺乏有效治療方案的骨病提供了更多的可能。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種骨靶向脂質(zhì)體藥物，所述藥物包括含有式5化合物的脂質(zhì)體，以及包裹在所述脂質(zhì)體內(nèi)的活性藥物分子。

所述活性藥物分子選自治療骨質(zhì)疏松、骨折愈合障礙、骨折、骨缺損修復(fù)、骨質(zhì)增生、異位骨化、骨/關(guān)節(jié)炎和骨/關(guān)節(jié)疼痛的藥物。

所述活性藥物分子選自選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(serm)、雌激素、雄激素，選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑(sarm)，活性維生素d、糖原合成酶激酶－3抑制劑(glycogensynthasekinase3inhibitor)，smoothened激動(dòng)劑、核因子κb配體的受體激活體抑制劑(ranklinhibitor，suchasdenosumab)、甲狀旁腺素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein)、抗硬化蛋白抗體(anti-sclerostinantibodies)、山茱萸總苷、黃芪多糖、補(bǔ)骨脂素、骨碎補(bǔ)總黃酮、葛根異黃酮、川續(xù)斷皂苷、淫羊藿苷、蛇床子素、合成類(lèi)固醇、糖皮質(zhì)激素、丹參酚b和丹參素或其鹽中的一種或兩種或兩種以上的組合，優(yōu)選為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、抗硬化蛋白抗體或丹參素或其鹽，最優(yōu)選為丹參素。

丹參素的鹽優(yōu)選為其鈉鹽。

本發(fā)明所述選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑包括但不限于他莫昔芬、雷洛昔芬、巴西多昔芬、拉索昔芬，所述合成類(lèi)固醇選自睪酮衍生物，所述糖皮質(zhì)激素選自地塞米松，潑尼松，可的松，強(qiáng)的松。

丹參素是傳統(tǒng)中藥丹參的水溶性成分，化學(xué)名為d(+)β-(3,4-二羥基苯基)乳酸。結(jié)構(gòu)式為:

本發(fā)明的一些具體實(shí)施例以丹參素為活性藥物分子制得骨靶向脂質(zhì)體藥物，通過(guò)試驗(yàn)證明，該藥物在骨病治療中具有非常顯著的療效，特別是在治療骨折愈合障礙中，丹參素骨靶向脂質(zhì)體對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨折延遲愈合小鼠模型的骨折愈合過(guò)程具有顯著的促進(jìn)成骨作用，能夠在骨折早期增加小鼠骨折后骨痂的形成，骨折后期促進(jìn)骨痂向正常骨骼形態(tài)的轉(zhuǎn)化，顯著縮短骨折愈合障礙小鼠的完全愈合時(shí)間(至少提前52％)，這是現(xiàn)有研究無(wú)法預(yù)期的。

本發(fā)明的目的之三在于提供上述骨靶向脂質(zhì)體藥物的制備方法，包括將卵磷脂、膽固醇和式5的化合物溶解于有機(jī)溶劑，然后加入活性藥物分子溶液混合振搖均勻，攪拌反應(yīng)5～50min，在8～40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，形成脂質(zhì)體，再用帶濾膜的擠壓器擠壓獲得脂質(zhì)體藥物，所述有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、異丙醚、乙醚和三氯甲烷中的一種或任意兩種的混合物，優(yōu)選為二氯甲烷，所述濾膜優(yōu)選為0.2～0.4um的濾膜。

上述骨靶向脂質(zhì)體藥物的制備方法，以重量計(jì)，所述卵磷脂、膽固醇、式5的化合物和活性藥物分子的投料比為40:(4～20):(1～12):(1～40)，優(yōu)選為40：(5～10)：(2～8)：(5～10)，更優(yōu)選為40：7：3：4。

當(dāng)所述式5的化合物具有式4的結(jié)構(gòu)時(shí)，式4的化合物進(jìn)一步采用包括以下步驟的方法制備：

(1)合成中間產(chǎn)物2：三甘醇-膽固醇

將膽固醇，三乙胺，4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷后冷卻到0度，加入4-對(duì)甲苯磺酰氯后，溶液在室溫下攪拌反應(yīng)20小時(shí)，向溶液中加入乙酸乙酯，然后分別使用稀鹽酸溶液，飽和食鹽水和蒸餾水洗滌溶液，有機(jī)相使用硫酸鎂mgso4干燥后蒸干溶劑，加入三甘醇和1,4-二氧六環(huán)后，加熱至80℃，反應(yīng)7小時(shí)，然后加入乙酸乙酯，用鹽水和蒸餾水洗，有機(jī)相使用硫酸鎂mgso4干燥后蒸干溶劑，通過(guò)柱色譜分離得產(chǎn)品；

(2)合成中間產(chǎn)物3：甲苯磺?；娜蚀?膽固醇

將上一步驟產(chǎn)物與三乙胺、4-二甲氨基吡啶溶于無(wú)水二氯甲烷后冷卻到0度，加入4-對(duì)甲苯磺酰氯，溶液在0度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，升至室溫下反應(yīng)3小時(shí)，加入乙酸乙酯后分別使用稀鹽酸溶液、鹽水和蒸餾水洗滌溶液，有機(jī)相分離干燥后，蒸干溶劑，柱色譜純化得到產(chǎn)品；

(3)合成終產(chǎn)物4：焦磷酸-膽固醇:

將甲苯磺?；娜蚀?膽固醇和(bu4n)3(ho)p2o6溶于一個(gè)無(wú)水乙腈和四氫呋喃混合溶劑，室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)后蒸干溶劑，將銨離子轉(zhuǎn)化為鈉離子，最終凍干得到焦磷酸-膽固醇產(chǎn)品。本發(fā)明的目的之四在于提供含有上述骨靶向脂質(zhì)體藥物的制劑。

所述制劑選自固體制劑和液體制劑，所述固體制劑包括但不限于片劑、膠囊劑、顆粒劑和滴丸劑，所述液體制劑包括但不限于注射劑、軟膠囊劑和氣霧劑，優(yōu)選所述制劑為注射劑。

上述制劑由本發(fā)明的骨靶向脂質(zhì)體藥物與藥學(xué)上可接受的載體或輔料制成，所述藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于無(wú)菌液體，例如水和油，包括那些石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)所述制劑是液體制劑，特別是注射劑時(shí)，水、生理鹽水、葡萄糖或甘油水溶液均可作為液體載體。所述制劑還可以包括適合的賦形劑，如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述制劑還可以視需要包含濕潤(rùn)劑、乳化劑、ph緩沖劑、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。本發(fā)明所述制劑可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何方法來(lái)制備，例如通過(guò)混合、溶解、制粒、糖包衣、碾磨、乳化、凍干等。

本發(fā)明的目的之五在于提供所述骨靶向脂質(zhì)體藥物在制備治療骨病的藥物中的應(yīng)用。

所述骨病選自骨質(zhì)疏松、骨折愈合障礙、骨折、骨缺損修復(fù)、異位骨化、骨質(zhì)增生、骨/關(guān)節(jié)炎和骨/關(guān)節(jié)疼痛，優(yōu)選所述骨病為骨質(zhì)疏松和/或骨折愈合障礙。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2的丹參素骨靶向脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)圖；

圖2-1和圖2-2分別是透射電子顯微鏡(tem)觀察結(jié)果圖；

圖3是丹參素骨靶向脂質(zhì)體的丹參素釋放圖；

圖4是fplc丹參素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖；

圖5是fplc將丹參素脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體和丹參素分離圖譜；

圖6是骨靶向脂質(zhì)體和非靶向脂質(zhì)體的羥基磷灰石吸附熒光圖；

圖7是羅丹明b標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體體內(nèi)分別熒光圖；

圖8-1～8-6分別是irdye800cw熒光分子標(biāo)記的非骨靶向脂質(zhì)體、不同含量比率骨靶向?qū)蛭锏墓前邢蛑|(zhì)體、等量的irdye800cw溶液注射對(duì)照組在骨折部位和尾部注射后骨折小鼠體內(nèi)熒光分布圖；

圖9是不同濃度潑尼松延遲小鼠骨折愈合圖；

圖10是不同治療組對(duì)骨折小鼠的骨痂影響x射線(xiàn)影像圖；

圖11是不同治療組骨折小鼠的骨痂病理染色圖像；

圖12是不同治療組骨折小鼠的骨痂顯微ct圖像；

圖13是丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療小鼠骨折后第42天x射線(xiàn)影像圖；

圖14是丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療小鼠骨折后第64天對(duì)小鼠骨生物力學(xué)性影響圖；

圖15是丹參骨靶向脂質(zhì)體對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性影響圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明以下實(shí)施例所用試劑、儀器等試驗(yàn)材料均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1骨靶向化合物分子的合成

本發(fā)明式5化合物的合成可以參考化合物4的合成方法制備，也可以參考專(zhuān)利cn104274407的方法，其區(qū)別僅在于焦磷酸與膽固醇之間的連接鏈的長(zhǎng)度不同。

以化合物4為例，按以下合成路線(xiàn)合成骨靶向化合物分子：

(1)合成中間產(chǎn)物：三甘醇-膽固醇

膽固醇(3.86g,10mmol)，三乙胺(et3n,2.02g,20mmol)，4-二甲氨基吡啶(dmap,244mg,2mmol)溶于二氯甲烷(dcm,20ml)，溶液在冰水浴中冷卻到0度，加入4-對(duì)甲苯磺酰氯(tscl,2.85g,15mmol)，溶液在室溫下攪拌反應(yīng)20小時(shí)。蒸掉溶劑后柱層析分離得到化合物1后溶于三甘醇(24g,160mmol)和1,4-二氧六環(huán)(60ml)后，加入至80℃，反應(yīng)7小時(shí)。然后加入乙酸乙酯(100ml)，接著用鹽水(100ml×3)和蒸餾水(100ml×2)，將混合溶液中的有機(jī)相分離出來(lái)，使用硫酸鎂mgso4干燥，然后將溶液旋轉(zhuǎn)蒸干，得到的初產(chǎn)物使用快速層析法(洗脫液，乙酸乙酯)純化得到3.65g產(chǎn)品，得率70.5％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)＝5.33(m,1h),3.71(t,j＝4.4hz,2h),3.66(s,4h),3.63(s,4h),3.60(t,j＝4.4hz,2h),3.24,(br,1h),3.18(m,1h),2.36(m,1h),2.20(m,1h),2.00(m,2h)1.95-1.79(m,3h),1.60-0.90(m,21h),1.00(s,3h),0.92(d,j＝6.4hz,3h),0.865(d,j＝6.6hz,3h),0.861(d,j＝6.6hz,3h),0.67(s,3h).

¹³cnmr(125mhz,cdcl3):δ(ppm)＝140.55,121.31,79.27,72.41,70.59,70.38,70.08,66.99,61.36,56.53,55.96,49.94,42.07,39.56,39.29,38.77,37.00,36.59,35.98,35.57,31.70,31.65,28.07,28.01,27.75,24.06,23.65,22.61,22.36,20.85,19.14,18.52,11.64.

(2)合成中間產(chǎn)物：甲苯磺?；娜蚀?膽固醇

將上一步驟得到的三甘醇-膽固醇(3.1g,6.0mmol),三乙胺(1.21g,12mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap146mg,1.2mmol)溶于無(wú)水二氯甲烷(dcm,30ml)，溶液在冰水浴中冷卻到0度，加入4-對(duì)甲苯磺酰氯(tscl,1.37g,7.2mmol)，溶液在0度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后接著在室溫下反應(yīng)3小時(shí)。然后向溶液中加入乙酸乙酯(100ml)，然后分別使用鹽酸溶液(1m,20ml)，鹽水(100ml×2)和蒸餾水(100ml×2)洗滌溶液，將混合溶液中的有機(jī)相分離出來(lái)，使用硫酸鎂mgso4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，得到的初產(chǎn)物。使用快速層析法(洗脫液，乙酸乙酯：己烷＝2：1)將初產(chǎn)物純化得到3.58g產(chǎn)品，得率88.8％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3):δ(ppm)＝7.81(d,j＝8.3hz,2h),7.35(d,j＝8.3hz,2h),5.34(m,1h),4.17(t,j＝4.9hz,2h),3.70(t,j＝4.9hz,2h),3.61(s,2h),3.60(s,6h),3.17(m,1h),2.46(s,3h),2.36(m,1h),2.20(m,1h),2.00(m,2h),1.92-1.79(m,3h),1.60-0.90(m,21h),1.00(s,3h),0.92(d,j＝6.5hz,3h),0.874(d,j＝6.6hz,3h),0.870(d,j＝6.6hz,3h),0.68(s,3h).

¹³cnmr(125mhz,cdcl3):δ(ppm)＝144.68,140.88,133.02,129.75,127.92,121.50,79.43,70.88,70.70,70.50,69.18,68.63,67.21,56.72,56.11,50.13,42.27,39.73,39.46,39.02,37.18,36.81,36.14,35.73,31.89,31.84,28.30,28.18,27.95,24.24,23.77,22.76,22.51,21.58,21.01,19.32,18.67,11.80

(3)焦磷酸-膽固醇的合成：

將上一步驟得到的甲苯磺?；娜蚀?膽固醇(336mg,0.5mmol)和(bu4n)3(ho)p2o6(902mg,1mmol)溶于一個(gè)混合溶劑體系(ch3cn:thf＝10:3)，整個(gè)溶液體系在室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)直至反應(yīng)完成(使用薄層色譜監(jiān)控)。最終的溶液凍干得到焦磷酸-膽固醇315mg，得率84.6％。

¹hnmr(500mhz,thf-d8/d2o):δ(ppm)＝5.29(m,1h),4.03(m,2h),3.69(m,2h),3.66(m,2h),3.62(m,2h),3.57(s,4h),3.20(m,1h),3.11(m,1h),2.33(m,1h),2.23(m,1h),1.97(m,1h),1.90(m,2h),1.78(m,2h),1.60-0.90(m,21h),0.95(s,3h),0.88(d,j＝6.4hz,3h),0.813(d,j＝6.6hz,3h),0.810(d,j＝6.6hz,3h),0.65(s,3h).

¹³cnmr(125mhz,thf-d8/d2o):δ(ppm)＝141.69,121.56,79.91,70.96,70.94,70.72,70.48,70.38,65.41,57.49,56.83,50.95,42.81,40.49,40.02,39.26,37.76,37.25,36.73,36.37,32.53,32.48,28.73,28.54,28.50,25.31,24.29,22.82,22.57,21.54,19.45,18.86,11.95.

³¹pnmr(202.5mhz,d2o):δ(ppm)＝-9.76(d,j＝20.2hz),-10.02(d,j＝20.2hz).

實(shí)施例2丹參素骨靶向脂質(zhì)體的制備

精密稱(chēng)取一定比例的卵磷脂、膽固醇和焦磷酸-膽固醇將三者放入圓底蒸發(fā)瓶，加入一定比例二氯甲烷溶解試劑，稱(chēng)取丹參素適量溶于ph值為7.4的pbs中制備丹參素溶液，將丹參素溶液加入到圓底燒瓶，兩樣混合振搖均勻，將混合溶液用磁力攪拌1500rpm/min攪拌10min，再將攪拌形成的乳狀液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除其內(nèi)含的二氯甲烷(500mpa，2小時(shí)；250mpa，1小時(shí))，形成脂質(zhì)體。將形成的脂質(zhì)體用帶有0.2μm和0.4μm濾膜的avanti@miniextruder擠壓器來(lái)回反復(fù)擠壓11次以得到理想大小的脂質(zhì)體，再使用商業(yè)化的pd-10純化柱去除未裝載在脂質(zhì)體中的游離藥物。

本發(fā)明的經(jīng)焦磷酸-膽固醇表面修飾的載藥脂質(zhì)體即具有骨靶向功能。焦磷酸-膽固醇分子中的膽固醇基團(tuán)充當(dāng)脂質(zhì)體雙分子層的錨固定分子，焦磷酸伸出脂質(zhì)體雙分子層外充當(dāng)骨靶向分子，這種經(jīng)表面修飾的載藥脂質(zhì)體具有既能靶向到骨組織，同時(shí)又能大量載藥并控制釋放的特性。其結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖1。

2.1精密稱(chēng)取卵磷脂40mg，膽固醇8.5mg，焦磷酸-膽固醇1.5mg，將三者溶于3ml的二氯甲烷中，然后加入濃度為4mg/ml的丹參素溶液1ml兩樣混合振搖均勻，將混合溶液劇烈磁力攪拌(1500rpm/min)反應(yīng)10min。再將攪拌形成的乳狀液在室溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除其內(nèi)含的二氯甲烷(500mpa，2小時(shí)；250mpa，1小時(shí))，形成脂質(zhì)體，將形成的脂質(zhì)體用帶有0.2μm濾膜的avanti@miniextruder擠壓器來(lái)回反復(fù)擠壓11次以得到理想大小的脂質(zhì)體，再使用商業(yè)化的pd-10純化柱去除未裝載在脂質(zhì)體中的游離藥物。

2.2精密稱(chēng)取卵磷脂(150mg,1.9×10^-4mol)，膽固醇(27mg,7×10^-5mol)，焦磷酸-膽固醇(11mg,1.5×10^-5mol)，將三種物質(zhì)放入圓底燒瓶，加入6ml二氯甲烷使之完全溶解，另加入2ml丹參素溶液(30mg,1.5×10^-4mol丹參素溶于2ml的pbs中,ph7.4)，將混合溶液用磁力攪拌1500rpm/min攪拌10min，再將攪拌形成的乳狀液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除其內(nèi)含的二氯甲烷(500mpa，2小時(shí)；250mpa，1小時(shí))，形成脂質(zhì)體。將形成的脂質(zhì)體用帶有0.2μm和0.4μm濾膜的avanti@miniextruder擠壓器來(lái)回反復(fù)擠壓11次以得到理想大小的脂質(zhì)體，再使用商業(yè)化的pd-10純化柱去除未裝載在脂質(zhì)體中的游離藥物。

制備不同含量比率骨靶向?qū)蛭锏墓前邢蛑|(zhì)體，只需按上述步驟調(diào)整卵磷脂，膽固醇，焦磷酸-膽固醇之間的重量比例即可。

實(shí)施例3丹參素骨靶向脂質(zhì)體的表征

3.1丹參素骨靶向脂質(zhì)體(tan-btl)的平均粒徑大小、平均分散系數(shù)及其膜表面zeta電位

將實(shí)施例2新合成的脂質(zhì)體1ml用pbs稀釋一倍，取1ml放入動(dòng)態(tài)光散射粒度檢測(cè)儀(dynamiclightscattering,dls)檢測(cè)其粒徑大小及zeta電位。dls檢測(cè)結(jié)果顯示丹參素骨靶向脂質(zhì)體平均粒徑大小為153nm，平均分散系數(shù)(pdi)為0.230，脂質(zhì)體膜表面電荷為-33.1mv，見(jiàn)表1。

表1丹參素骨靶向脂質(zhì)體(tan-btl)的粒徑、分散系數(shù)及其zeta電位

3.2丹參素骨靶向脂質(zhì)體(tan-btl)的穩(wěn)定性測(cè)定

將實(shí)施例2制備好的丹參素骨靶向脂質(zhì)體放入小管中，并充滿(mǎn)氬氣進(jìn)行保護(hù)，4℃冰箱放置，分別在1天、8天、15天、30天及45天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)利用dls檢測(cè)其粒徑大小，檢測(cè)其是否發(fā)生聚集和沉淀。dls跟蹤測(cè)試丹參素骨靶向脂質(zhì)體粒徑變化45天，結(jié)果顯示丹參素骨靶向脂質(zhì)體粒徑大小并未明顯改變，平均分散系數(shù)(polydispersityindex，pdi)也并未發(fā)生明顯改變，說(shuō)明得到的脂質(zhì)體是非常穩(wěn)定的，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2丹參素骨靶向脂質(zhì)體(tan-btl)的放置45天dls穩(wěn)定性測(cè)定

3.3丹參素骨靶向脂質(zhì)體(tan-btl)透射電子顯微鏡(tem)觀察結(jié)果

按照實(shí)施例2的方法制備多個(gè)丹參素骨靶向脂質(zhì)體樣品，加pbs稀釋10倍后，取10μl樣品，以2.0％磷鎢酸負(fù)染，于透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)，每個(gè)樣品在視野中隨機(jī)選取多個(gè)外觀圓形的脂質(zhì)體并測(cè)量其粒徑，計(jì)算其平均粒徑。結(jié)果顯示丹參素骨靶向脂質(zhì)體為大單室球狀，大小比較均勻，外觀較圓整，分散性好，制備多個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)量視野中多處脂質(zhì)體粒徑，得平均粒徑為166±34nm，見(jiàn)圖2-1和2-2。

3.4丹參素骨靶向脂質(zhì)體的體外釋放率表征-新增數(shù)據(jù)結(jié)果

為了研究丹參素骨靶向脂質(zhì)體釋放丹參素的情況，將制備的丹參素骨靶向脂質(zhì)體用pd-10純化柱子進(jìn)行純化后，使用快速蛋白液相系統(tǒng)(fplc)在不同時(shí)間點(diǎn)(0天，1天，3天，5天，7天)監(jiān)控丹參素的釋放情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的丹參素樣品3次。結(jié)果表明丹參素隨時(shí)間從丹參素骨靶向脂質(zhì)體中的累積釋放量隨時(shí)間增加；丹參素骨靶向脂質(zhì)體內(nèi)的丹參素隨時(shí)間減少，見(jiàn)圖3。

3.5丹參素骨靶向脂質(zhì)體的包封率

用fplc法計(jì)算丹參素脂質(zhì)體的包封率。

3.5.1快速蛋白液相色譜(fplc)的丹參素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

將3.2mg丹參素溶于2mlpbs(0.05m，ph7.4)中，得到濃度為1.6mg/ml的丹參素溶液。將此溶液倍比稀釋得到不同濃度(800，400，200，100，50，25，12.5，6.25μg/ml)的丹參素標(biāo)準(zhǔn)溶液，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.2μm濾膜過(guò)濾后，用fplc檢測(cè)其紫外吸收峰面積。以丹參素濃度c對(duì)峰面積a進(jìn)行線(xiàn)性回歸，經(jīng)計(jì)算后得到fplc丹參素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。見(jiàn)圖4。

儀器：fplc，amershambiosciences,usa；流動(dòng)相:0.05mpbs；流速:0.5ml/min,柱子:superdex200；檢測(cè)波長(zhǎng):282nm。

3.5.2丹參素包封率計(jì)算

將100μl新制備的丹參素靶向脂質(zhì)體用pbs(0.05m，ph7.4)稀釋10倍。將稀釋的脂質(zhì)體用0.2μm濾膜過(guò)濾后用fplc檢測(cè)其紫外吸收峰面積。fplc可將制備的脂質(zhì)體中的脂質(zhì)體和丹參素完全分離，見(jiàn)圖5，峰1是丹參素骨靶向脂質(zhì)體，峰2是游離的丹參素。記錄第二個(gè)紫外吸收峰峰面積(即丹參素紫外吸收峰面積)，依據(jù)已制作的fplc丹參素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算游離的丹參素濃度，即可計(jì)算脂質(zhì)體中游離丹參素的含量，進(jìn)而間接計(jì)算包封率。包封率＝(1－游離丹參素/總丹參素)×100％?？捎?jì)算得到丹參素骨靶向脂質(zhì)體的包封率為33.15％。

實(shí)施例4骨靶向脂質(zhì)體的骨靶向特性研究

4.1骨靶向脂質(zhì)體在體外的骨親和力實(shí)驗(yàn)

4.1.1羅丹明b標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體和非靶向脂質(zhì)體的制備

取卵磷脂40mg，膽固醇8.5mg和1.5mg焦磷酸-膽固醇放入圓底燒瓶中，加入3ml的二氯甲烷溶解，然后再加入1ml濃度為10mg/ml羅丹明b的pbs溶液，混勻，其余步驟與實(shí)施例2的制備方法相同。

非靶向脂質(zhì)體的制備遵循相同步驟，只是不加入焦磷酸-膽固醇作為骨靶向分子，以膽固醇代替。

4.1.2骨靶向脂質(zhì)體和非靶向脂質(zhì)體的羥基磷灰石吸附實(shí)驗(yàn)比較

取制備的0.5ml骨靶向脂質(zhì)體和0.5ml非骨靶向脂質(zhì)體分別用pbs稀釋15倍至7.5ml。取5ml稀釋后的骨靶向脂質(zhì)體和5ml非骨靶向脂質(zhì)體作為兩個(gè)樣品，分別向兩個(gè)樣品中加入12.5mg的羥基磷灰石混勻。將混勻的樣品放入37℃水浴箱中緩慢搖晃6小時(shí)。6小時(shí)后將樣品取出離心，1000rpm，3min，將上清液收集并使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定上清液的熒光密度(測(cè)定條件激發(fā)波長(zhǎng)555nm,發(fā)射波長(zhǎng)580nm)，將剩余的羥基磷灰石沉淀用1ml雙蒸水洗滌，再次離心1000rpm，3min，棄去上清液，加入1ml雙蒸水混勻，得到羥基磷灰石的混懸液，取混懸液100μl滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，放在熒光顯微鏡下觀察。用等同體積的雙蒸水按照相同方法及步驟處理作為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖6。

羅丹明b標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體(btl)和非骨靶向脂質(zhì)體(ntl)，加入相同量的羥基磷灰石，經(jīng)吸附實(shí)驗(yàn)后，可見(jiàn)骨靶向脂質(zhì)體上清溶液熒光密度較非骨靶向脂質(zhì)體明顯下降，間接提示骨靶向脂質(zhì)體(btl)較非骨靶向脂質(zhì)體(ntl)對(duì)羥基磷灰石的吸附能力更強(qiáng)，而經(jīng)過(guò)水洗滌的羥基磷灰石粉末，在熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)骨靶向脂質(zhì)體呈現(xiàn)明顯紅色熒光而非骨靶向脂質(zhì)樣品的羥基磷灰石未見(jiàn)熒光，直接提示骨靶向脂質(zhì)體對(duì)羥基磷灰石的具有良好的吸附能力，非骨靶向脂質(zhì)體對(duì)羥基磷灰石基本無(wú)吸附能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明骨靶向?qū)蛭锝沽姿帷懝檀荚谥|(zhì)體對(duì)羥基磷灰石吸附的機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。

4.2骨靶向脂質(zhì)體在體內(nèi)的骨組織吸附實(shí)驗(yàn)

選取12周齡的cd-1雌性小鼠9只隨機(jī)分為3組：羅丹明b標(biāo)記的骨靶向組，非骨靶向組和羅丹明b溶液對(duì)照組。給予小鼠皮下注射鈣黃綠素(10mg/kg)以便對(duì)小鼠體內(nèi)骨形成進(jìn)行熒光標(biāo)記。3天后將小鼠用異氟烷持續(xù)麻醉，用純化的羅丹明b標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體、非骨靶向的脂質(zhì)體以及等濃度的羅丹明b溶液分別局部注射于各組小鼠的兩側(cè)股骨中段位置(50μl/股骨)，脂質(zhì)體注射24小時(shí)后，處死小鼠。取小鼠股骨遠(yuǎn)端和脛骨上段放入20％濃度的蔗糖溶液中浸泡一小時(shí)，而后轉(zhuǎn)入30％蔗糖溶液中浸泡48小時(shí)。股骨遠(yuǎn)端和脛骨上段在梯度蔗糖溶液中脫水。將脫水后的股骨遠(yuǎn)端和脛骨上段用鋁箔包裹置入二丙醇中，然后快速放入干冰中冷凍30分鐘，棄去二丙醇，將骨頭置于-80℃冰箱凍存，用于冰凍切片備用。冰凍切片時(shí)使用neg-50冷凍包埋劑對(duì)骨頭包埋后進(jìn)行冰凍切片。骨冰凍切片厚度為10μm，然后用帶有dapi染色的封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察，分別切換不同濾光片觀察骨內(nèi)不同熒光并拍照記錄。

結(jié)果見(jiàn)圖7，(a)中箭頭指向骨靶向脂質(zhì)體與鈣黃綠素?zé)晒庵睾系牟课弧?b)中箭頭指向羅丹明標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體出現(xiàn)在皮質(zhì)骨的骨凹陷中。鈣黃綠素(綠色熒光，常用的骨生長(zhǎng)熒光標(biāo)記物)，dapi(藍(lán)色熒光，常用的細(xì)胞核染色染料)。

冰凍切片結(jié)果可見(jiàn)鈣黃綠素在骨形成部位(骨生長(zhǎng)板)沉積，而羅丹明b標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體(攜帶紅色熒光)也大量吸附在骨生長(zhǎng)板。紫色熒光為羅丹明b與鈣黃綠素兩種熒光重合的部位,提示骨靶向脂質(zhì)體可吸附在骨生長(zhǎng)活躍位點(diǎn)。骨靶向脂質(zhì)體不僅在生長(zhǎng)活躍部位分布，還可吸附于體內(nèi)骨小梁表面以及出現(xiàn)皮質(zhì)骨的骨凹陷中，骨靶向脂質(zhì)體在骨中多種部位均可分布，且并不是在骨骼中彌漫分布。

4.3骨靶向脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)骨折部位的分布

4.3.1按照前述羅丹明b標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體的制備方法制備irdye800cw標(biāo)記的非骨靶向脂質(zhì)體,和帶有不同含量比率骨靶向?qū)蛭锏墓前邢蛑|(zhì)體(骨靶向?qū)蛭锓謩e占膽固醇固定總量15％，30％，60％)。

4.3.2irdye800cw標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體在cd-1小鼠骨折部位的分布及滯留

18只cd-1小鼠行骨折手術(shù)并隨機(jī)分為5組。分別在骨折手術(shù)5天后將各組藥物局部注射至3只小鼠股骨骨折部位，等量的irdye800cw溶液注射到同樣部位作為對(duì)照，另外3只小鼠由尾靜脈整體注射irdye800cw標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體。

所有小鼠在注射前和注射后每天使用熒光成像系統(tǒng)持續(xù)監(jiān)控觀察脂質(zhì)體在體內(nèi)的分布情況。

結(jié)果見(jiàn)圖8-1～8-6，圖8-1是irdye800cw標(biāo)記的非靶向脂質(zhì)體局部注射小鼠骨折部位后體內(nèi)熒光成像跟蹤；圖8-2是irdye800cw標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體(骨靶向?qū)蛭?×10^-6m，占膽固醇固定總量的15％)在小鼠骨折部位局部注射后體內(nèi)熒光成像跟蹤；圖8-3是irdye800cw標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體(骨靶向?qū)蛭?×10^-6m，占膽固醇固定總量的30％)在小鼠骨折部位局部注射后體內(nèi)熒光成像跟蹤；圖8-4是irdye800cw標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體(骨靶向?qū)蛭?×10^-6m，占膽固醇固定總量的60％)在小鼠骨折部位局部注射后體內(nèi)熒光成像跟蹤；圖8-5是等量irdye800cw溶液在骨折部位局部注射后體內(nèi)熒光成像跟蹤；圖8-6是irdye800cw標(biāo)記的骨靶向脂質(zhì)體(骨靶向?qū)蛭?×10^-6m，占膽固醇固定總量的15％)在骨折小鼠尾靜脈整體注射后體內(nèi)熒光成像跟蹤；圖像使用li-cor體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)的ird800通道獲得(li-cor,inc,lincoln,ne)。

研究結(jié)果說(shuō)明，骨靶向脂質(zhì)體比非靶向脂質(zhì)體和熒光溶液對(duì)照具有更長(zhǎng)的滯留時(shí)間和更集中的體內(nèi)分布。骨靶向脂質(zhì)體增加焦磷酸-膽固醇在總的膽固醇中的比例能夠增加更長(zhǎng)的滯留時(shí)間，但是實(shí)驗(yàn)中最高的焦磷酸-膽固醇的比例(60％)并不能提供最長(zhǎng)的滯留時(shí)間，焦磷酸-膽固醇在總膽固醇中的比例為30％時(shí)可提供最長(zhǎng)的滯留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)20天。

實(shí)施例5丹參素骨靶向脂質(zhì)體的藥效學(xué)評(píng)價(jià)

5.1建立骨折愈合延遲的動(dòng)物模型

選用18只spf級(jí)12周齡的雌性cd-1小鼠，小鼠隨機(jī)分為4組，其中18只小鼠分別預(yù)先給予潑尼松口服灌胃3周，潑尼松低劑量組(gc-l,6mg/kg/d,n＝8)；潑尼松中劑量組(gc-m,9mg/kg/d,n＝8)；潑尼松高劑量組(gc-h,12mg/kg/d,n＝8)

7只正常同周齡的小鼠作為正常對(duì)照組(control,n＝7)。潑尼松給藥3周后，除健康對(duì)照組小鼠外，所有小鼠實(shí)施股骨內(nèi)固定閉合性骨折手術(shù)，手術(shù)后給藥組小鼠繼續(xù)給予各個(gè)劑量潑尼松8w，手術(shù)后使用小動(dòng)物x射線(xiàn)影像系統(tǒng)每4天拍照一次跟蹤觀察記錄。實(shí)驗(yàn)如下表3所示：

表3糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的骨折延遲愈合動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

小鼠骨折愈合情況見(jiàn)圖9，9mg/kg和12mg/kg潑尼松能夠有效的延遲骨折愈合的過(guò)程選用12mg/kg潑尼松誘導(dǎo)的骨折愈合延遲小鼠模型用于丹參素骨靶向脂質(zhì)體藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

5.2丹參素骨靶向脂質(zhì)體對(duì)骨折延遲愈合模型小鼠骨折骨痂形成的影響

選取50只spf級(jí)12周齡cd-1小鼠隨機(jī)分為5組，分別為丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療組(saa-btl，等量丹參素5mg/kg/w)，丹參素非靶向脂質(zhì)體治療組(saa-ntl，等量丹參素5mg/kg/w)，丹參素溶液治療組(saa,5mg/kg/w)，糖皮質(zhì)激素模型組(gc)以及正常對(duì)照組(control)，各組小鼠(除正常對(duì)照組外)均口服灌胃潑尼松12mg/kg/d共39天，潑尼松給藥三周后各組小鼠進(jìn)行股骨內(nèi)固定閉合性骨折手術(shù)。手術(shù)后三天，各組小鼠分別給予各治療藥物局部注射于股骨骨折處，之后每周給藥一次，每周使用x射線(xiàn)影像系統(tǒng)跟蹤觀察，骨折手術(shù)后18天處死小鼠，取小鼠骨折的股骨進(jìn)行顯微ct掃描分析，測(cè)定其骨痂形成的大小，將骨痂部位脫鈣染色后，使用形態(tài)計(jì)量學(xué)半定量分析骨痂中的骨與軟骨的構(gòu)成。

表4丹參素骨靶向脂質(zhì)體藥效學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖10是各組骨折小鼠的骨痂x射線(xiàn)影像分析圖；圖11是各組骨折小鼠的骨痂病理染色圖像，(a)為骨折部位骨痂的番紅o-固綠染色病理圖像；(b)為骨折部位骨痂的h&e染色病理圖像；(c)為病理圖像中分析的范圍的選取圖示；(d)為骨痂中骨與軟骨構(gòu)成半定量分析參數(shù)；圖12是各組骨折小鼠的骨痂顯微ct圖像，a：正面完整的骨折部位骨痂顯微ct三維圖像；b:骨折部位骨痂縱向切面顯微ct三維圖像；c:骨折部位骨痂橫向切面顯微ct三維圖像。

表4骨折小鼠的骨痂顯微ct參數(shù)分析—小鼠骨折后18天

^*p<0.05vscontrol,^#p<0.05vsgc,^##p<0.01vsgc.tv,組織體積；bv,骨體積；bs,骨表面；conn.d,骨連接密度；bmc,骨礦含量。

顯微ct對(duì)骨折處骨痂進(jìn)行定量分析結(jié)果顯示gc模型組與對(duì)照組相比，骨折處骨痂骨體積百分?jǐn)?shù)明顯降低，而丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療組的骨折處骨痂骨體積百分?jǐn)?shù)較gc模型組明顯增高57％，同時(shí)骨表面百分?jǐn)?shù)和骨連接密度以及骨礦含量均明顯較模型組提高。病理圖像分析顯示，丹參素骨靶向脂質(zhì)體顯著提高模型小鼠骨折后骨痂中骨的百分?jǐn)?shù)，降低軟骨占骨痂的百分?jǐn)?shù)，提高骨痂中軟骨骨痂向骨性骨痂的轉(zhuǎn)化。丹參素骨靶向脂質(zhì)體能夠在骨折早期增加小鼠骨折后骨痂的形成，有效加快骨折愈合的進(jìn)程。

5.3丹參素骨靶向脂質(zhì)體對(duì)骨折延遲愈合模型小鼠骨折愈合和骨生物力學(xué)的影響研究

為更好的評(píng)價(jià)丹參素骨靶向脂質(zhì)體對(duì)骨折愈合的影響，我們將丹參素骨靶向脂質(zhì)體的治療時(shí)間延長(zhǎng)到9周，并用x射線(xiàn)影像系統(tǒng)持續(xù)觀察骨折的愈合過(guò)程。

23只spf級(jí)12周齡的雌性cd-1小鼠隨機(jī)分為3組，糖皮質(zhì)激素組(gc,12mg/kg/d,n＝8)；丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療組(tan-btl，等量丹參素5mg/kg/w,n＝8)以及正常對(duì)照組(control,n＝7)。各組小鼠(除正常對(duì)照組外)均口服灌胃潑尼松12mg/kg/d12周，潑尼松給藥三周后各組小鼠進(jìn)行股骨內(nèi)固定閉合性骨折手術(shù)。手術(shù)后三天，丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療組小鼠給予股骨骨折處局部注射丹參素骨靶向脂質(zhì)體，以后每周注射一次，給藥9周。小鼠骨折愈合過(guò)程使用小動(dòng)物x射線(xiàn)影像系統(tǒng)每4天拍照一次跟蹤觀察記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取小鼠愈合的股骨進(jìn)行生物力學(xué)的測(cè)試，測(cè)定股骨的力學(xué)性能。

x光影像結(jié)果顯示骨折后第42天，gc模型組小鼠骨折出存有大量骨痂骨痂。而丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療組骨折處骨痂消失，骨折愈合過(guò)程基本完成，恢復(fù)正常骨骼形態(tài)。骨折后第64天，gc模型組小鼠骨折處仍存在少量骨痂。丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療組小鼠骨折完全愈合時(shí)間較gc模型骨折小鼠提前22天以上，愈合時(shí)間至少提前52％，見(jiàn)圖13。

股骨生物力學(xué)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示骨折后第64天，gc模型組小鼠股骨剛性系(stiffness)、最大載荷應(yīng)力(ultimatestress)、彈性載荷應(yīng)力(yieldstress)以及彎曲模量(flexuralmodulus)均明顯較正常骨折小鼠降低。而丹參素骨靶向脂質(zhì)體治療組與gc模型組相比，小鼠股骨剛性系數(shù)、最大載荷應(yīng)力、彈性載荷應(yīng)力以及彎曲模量均明顯增加，顯著改善使用gc的小鼠的骨生物力學(xué)性能，見(jiàn)圖14。

5.4丹參素骨靶向脂質(zhì)體體外對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用研究

從小鼠骨髓中分離并培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，并把得到的細(xì)胞分為正常細(xì)胞對(duì)照組，成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)組，丹參素骨靶向脂質(zhì)體組(等量丹參素1μm)，未裝載藥物脂質(zhì)體組和丹參素溶液對(duì)照組(1μm)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)后分別加入各個(gè)處理試劑處理細(xì)胞，每3天換液一次，給藥處理7天后，收集各組細(xì)胞，用堿性磷酸酶(alp)測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖15.

結(jié)果表明成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)組細(xì)胞堿性磷酸酶較正常組明顯增高，丹參素骨靶向脂質(zhì)體組和丹參素溶液組堿性磷酸酶活性也明顯增加，而未裝載藥物脂質(zhì)體組沒(méi)有明顯變化。而且丹參素骨靶向脂質(zhì)體組堿性磷酸酶活性較丹參素溶液組明顯增加。這說(shuō)明，丹參素骨靶向脂質(zhì)體起作用的分子是丹參素，而不是裝載丹參素的脂質(zhì)體，而且將丹參素制備成為丹參素骨靶向脂質(zhì)體可以增強(qiáng)丹參素對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨作用的活性。