本發(fā)明涉及東哥阿里總生物堿提取物的制備方法，以及東哥阿里總生物堿提取物的制藥新用途，屬于制藥領域。
背景技術：
：高尿酸血癥是指由尿酸代謝障礙所引起的血清尿酸水平增高或尿酸鹽在腎臟部位的沉積和以痛風綜合癥為主的臨床表現(xiàn)。近年來，全球高尿酸血癥的發(fā)病率日益增長。目前全球高尿酸血癥的患病率高達10％～25％。嘌呤代謝紊亂和尿酸鹽排泄減少是誘發(fā)高尿酸血癥的直接原因。高尿酸血癥可以直接導致痛風的發(fā)作，而且也對高脂血癥、高血壓、肥胖以及胰島素抵抗等疾病的發(fā)作有一定的推動作用，故高尿酸血癥已對人類健康產生了嚴重威脅。有研究表明，東革阿里能顯著降低血清尿酸水平和24h尿液排泄尿酸的總量，可以有效緩解和抑制尿酸鈉結晶引起的痛風性關節(jié)炎，對其臨床表現(xiàn)出的關節(jié)腫脹、患處疼痛和肢體功能障礙有較好的緩解作用。目前，東革阿里抗尿酸作用的活性成分和機理還不清楚，治療時仍以水煎等非常傳統(tǒng)的服藥方式為主，由于東革阿里味極苦，導致服藥劑量大患者難以接受，同時，這種服藥方式也具有較大的副作用，常常導致患者出現(xiàn)性欲旺盛和其它心血管不良反應。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種東哥阿里總生物堿提取物的制備方法，以探明東哥阿里抗尿酸的物質基礎，進而減少服用劑量，提高順應性，同時降低不良反應。本發(fā)明提供的制備方法包括以下步驟：1)總生物堿的提?。簩|哥阿里切成薄片，加50～90％乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇至無醇味，放冷后用酸調節(jié)ph為1～4，靜置，離心，上清液用堿調節(jié)ph為8～12，然后加入非極性有機溶劑萃取，回收溶劑并蒸干，得總生物堿粗提取物；2)總生物堿的純化：將總生物堿粗提取物加乙醇溶解，上反相聚合物色譜填充柱，依次用水、20～50％乙醇、70～90％乙醇洗脫，收集70～90％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，真空干燥，粉碎，即得東哥阿里總生物堿提取物。優(yōu)選地，所述制備方法包括以下步驟：1)總生物堿的提?。簩|哥阿里切成薄片，加70％乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇至無醇味，放冷后用酸調節(jié)ph為2，靜置，離心，上清液用堿調節(jié)ph為10，然后加入非極性有機溶劑萃取，回收溶劑并蒸干，得總生物堿粗提取物；2)總生物堿的純化：將總生物堿粗提取物加乙醇溶解，上反相聚合物色譜填充柱，依次用水、30％乙醇、80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，真空干燥，粉碎，即得東哥阿里總生物堿提取物。進一步優(yōu)選地，所述酸為稀硫酸，所述堿為氨水。進一步優(yōu)選地，所述非極性有機溶劑為氯仿。進一步優(yōu)選地，所述反相聚合物色譜為cg161、cg300、mcichp20p、mcichp20y、mcichp20a中的一種。采用上述方法制備得到的東哥阿里總生物堿提取物，該提取物可用于制備抗尿酸藥物。本發(fā)明的有益效果是：1)本發(fā)明制備得到的東哥阿里總生物堿提取物含量達65％以上，收率達0.3％以上，具有較好的產業(yè)化前景。2)本發(fā)明制備得到的東哥阿里總生物堿提取物有降尿酸作用，能促進大鼠尿液中肌酐的排泄，降低肝臟中黃嘌呤氧化酶的活性，同時能降低大鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐水平，提高大鼠尿液中尿酸水平，說明東革阿里提取物有較強的降尿酸作用和促尿酸排泄作用。3)本發(fā)明通過作用機理研究，探明了東哥阿里抗尿酸的物質基礎，進而針對生物堿進行提取、純化，通過除去大量的無效成分，使提取物更有利于制劑成型、減少服用劑量，提高用藥順應性并降低副作用。本發(fā)明制備的東哥阿里總生物堿提取物不會導致性欲旺盛和其它心血管不良反應。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。實施例11)總生物堿的提取：東哥阿里5kg切成薄片，加8倍重量的70％(重量濃度)乙醇回流提取3次，每次1小時(首次提取前浸泡50分鐘)，濾過，合并三次濾液，減壓回收乙醇至無醇味，放冷后用2％(重量濃度)硫酸調節(jié)提取液的ph為2，靜置，離心，取上清液用氨水調節(jié)ph為10，然后加2倍體積量氯仿萃取三次，合并氯仿層，回收氯仿并蒸干，得總生物堿粗提取物0.36kg；2)總生物堿的純化：將總生物堿粗提取物加少量乙醇溶解，上cg161型反相聚合物色譜填充柱(聚苯乙烯樹脂，比表面積900m2/g，平均孔徑150a，三菱化學)，依次用水、30％乙醇、80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，真空干燥，粉碎，即得東哥阿里總生物堿提取物18.5g。實施例21)總生物堿的提取：將東哥阿里5kg切成薄片，加10倍重量的50％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液減壓回收乙醇至無醇味，放冷后用稀硫酸調節(jié)ph為4，靜置，離心，上清液用氨水調節(jié)ph為12，然后加入4倍體積氯仿萃取2次，回收溶劑并蒸干，得總生物堿粗提取物0.45g；2)總生物堿的純化：將總生物堿粗提取物加乙醇溶解，上cg300型反相聚合物色譜填充柱(聚苯乙烯樹脂，比表面積700m2/g，平均孔徑300a，三菱化學)，依次用水、20％乙醇、70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，真空干燥，粉碎，即得東哥阿里總生物堿提取物17.2g。實施例31)總生物堿的提?。簩|哥阿里5kg切成薄片，加5倍重量的90％乙醇回流提取2次，每次1小時，提取液減壓回收乙醇至無醇味，放冷后用稀硫酸調節(jié)ph為1，靜置，離心，上清液用氨水調節(jié)ph為8，然后加入1倍體積氯仿萃取5次，回收溶劑并蒸干，得總生物堿粗提取物0.31kg；2)總生物堿的純化：將總生物堿粗提取物加乙醇溶解，上mcichp20p型反相聚合物色譜填充柱(聚苯乙烯樹脂，平均粒徑120μm，孔徑45nm，三菱化學)，依次用水、50％乙醇、90％乙醇洗脫，收集90％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，真空干燥，粉碎，即得東哥阿里總生物堿提取物14.8g。實施例41)總生物堿的提?。簩|哥阿里5kg切成薄片，加12倍重量的60％乙醇回流提取3小時，提取液減壓回收乙醇至無醇味，放冷后用稀硫酸調節(jié)ph為3，靜置，離心，上清液用氨水調節(jié)ph為9，然后加入3倍體積氯仿萃取2次，回收溶劑并蒸干，得總生物堿粗提取物0.40kg；2)總生物堿的純化：將總生物堿粗提取物加乙醇溶解，上mcichp20y型反相聚合物色譜填充柱(聚苯乙烯樹脂，平均粒徑30μm，孔徑45nm，三菱化學)，依次用水、40％乙醇、80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，真空干燥，粉碎，即得東哥阿里總生物堿提取物16.3g。實施例51)總生物堿的提?。簩|哥阿里5kg切成薄片，加6倍重量的80％乙醇回流提取2次，每次2小時，提取液減壓回收乙醇至無醇味，放冷后用稀硫酸調節(jié)ph為2，靜置，離心，上清液用氨水調節(jié)ph為11，然后加入5倍體積氯仿萃取2次，回收溶劑并蒸干，得總生物堿粗提取物0.33kg；2)總生物堿的純化：將總生物堿粗提取物加乙醇溶解，上mcichp20a型反相聚合物色譜填充柱(聚苯乙烯樹脂，平均粒徑20μm，孔徑45nm，三菱化學)，依次用水、30％乙醇、80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，真空干燥，粉碎，即得東哥阿里總生物堿提取物15.7g。試驗例1總生物堿含量測定：采用非水滴定法測定，方法參照2015年版中國藥典二部咖啡因項下含量測定方法制定，方法具體如下：取本品約0.3g，精密稱定，加醋酐-冰醋酸(5:1)的混合液25ml，微溫使溶解，放冷，加結晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/l)滴定至溶液顯黃色，并將滴定的結果用空白實驗校正。產物收率(％)總生物堿含量(％)實施例10.37078.6實施例20.34466.2實施例30.29668.9實施例40.32672.3實施例40.31474.1試驗例2提取物抗尿酸功效驗證1.實驗方法：將80只sd大鼠隨機分成8組，每組10只，分別為空白組、模型組、陽性對照組、東革阿里總生物堿提取物組(簡稱為提取物組)。將大鼠適應性培養(yǎng)一周后開始造模，除空白對照組外，其他組按7.5g/kg·d酵母膏、100mg/(kg·d)腺嘌呤及15mg/kg·d氧嗪酸鉀(簡稱為造模劑)進行灌胃，大鼠的灌胃體積為1.5ml/100g，連續(xù)灌胃給予造模劑兩周，在第14天時對所有大鼠進行頸靜脈取血，測所有大鼠血清尿酸水平，灌胃造模劑的實驗組間血尿酸水平無顯著差異，且顯著高于空白組(p<0.05)，模型建立成功。高尿酸血癥模型建立后，空白組繼續(xù)灌胃0.5％cmc-na溶液，除空白組以外的其他組繼續(xù)給予造模劑，除模型組外的其他組在造模1h后分別給予相應藥液。陽性對照組灌胃給予大鼠別嘌醇(71mg/kg·d)，提取物組給藥劑量為1.08g/kg·d(按生藥量計)，連續(xù)給藥兩周。一般形態(tài)學觀察：記錄給藥前后小鼠的皮毛、精神狀態(tài)、活動情況、進食、飲水情況以及體重增長情況。尿液中各項指標的檢測：末次給藥后，采用大鼠代謝籠對大鼠進行單籠飼養(yǎng)24h，禁食不禁水，收集24h尿液，記錄大鼠尿量，3500r/min的條件下離心尿液10min，取尿液上清液，用試劑盒檢測尿中cr、un、ua含量。根據(jù)尿ua濃度和尿量計算各組大鼠24hua排泄量，同時進行體重校正。根據(jù)血、尿中ua、cr濃度計算各組大鼠ua排泄分數(shù)(feua)。feua(％)＝(血cr×尿ua)/(血ua×尿cr)×100血清中各項指標的測定：收集各組大鼠24h尿液后，采用0.2％異戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，腹主動脈取血，血樣室溫下放置1h，3500r/min的條件下離心血樣10min，分離血清，采用試劑盒測定血清ua、xod水平，采用全自動生化分析儀測定血清cr、un水平。肝臟中各項指標測定：腹主動脈取血后，迅速取大鼠肝臟，用冷生理鹽水反復沖洗，稱取0.2g肝尖組織，加入1.8ml預冷生理鹽水，在冰水浴中制成10％肝勻漿，2500r/min的條件下離心10min，取肝勻漿上清液，檢測xod活性。2.試驗結果：東革阿里總生物堿提取物對大鼠血清和尿液尿酸水平的影響給予造模劑14天后，模型組血清ua水平與空白組相比，升高極顯著(p＜0.001)，灌胃造模劑的實驗組間血尿酸水平無顯著差異，且顯著高于空白組(p<0.05)，這說明模型建立成功。給藥14天后，結果如表1所示，模型組血清ua水平與空白組相比，升高極顯著(p＜0.001)，模型組尿ua水平與空白組相比，降低極顯著(p＜0.01)，陽性對照組、提取物組血清ua水平與模型組相比，顯著降低(p＜0.05)，說明東革阿里提取物有明顯的降尿酸作用。陽性對照組和提取物組尿ua水平與模型組相比，顯著升高(p＜0.05)，說明東革阿里提取物能促進大鼠尿酸的排泄。表1東革阿里提取物對大鼠血清和尿液尿酸水平的影響(n＝10)組別血尿酸水平(μmol/l)尿尿酸水平(μmol/l)空白組187.05±27.24296.74±29.55模型組253.57±38.08***238.64±12.48**陽性對照組207.22±23.03#308.54±34.16#提取物組219.56±33.05313.44±31.66#相對于空白組，***表示p<0.001，**表示p<0.01，*表示p<0.05；相對于模型組，##表示p<0.01，#表示p<0.05(下同)。東革阿里提取物對血清和尿液肌酐水平的影響表2表明，模型組血cr水平與空白組相比，升高極顯著(p＜0.01)，模型組尿cr水平與空白組相比，明顯降低(p＜0.05)，陽性對照組、提取物組血cr水平與模型組相比，血清cr水平均降低，但無顯著性差異(p＞0.05)，說明造模劑對腎功能有一定的損害。陽性對照組、提取物組尿cr水平與模型組相比，升高極顯著(p＜0.01)。說明東革阿里提取物能促進大鼠肌酐的排泄。表2東革阿里各種提取物對大鼠血清和尿液肌酐水平的影響(m＝10)組別血清肌酐水平(μmol/l)尿肌酐水平(μmol/l)空白組41.33±3.75194.26±33.77模型組60.29±10.17**136.43±12.31*陽性對照組51.42±7.94214.17±27.97##提取物組53.73±5.48217.28±30.37##東革阿里各種提取物對大鼠血清和尿液尿素氮水平的影響表3表明，模型組血un水平與空白組相比，升高顯著(p＜0.05)，模型組尿un水平與空白組相比，降低顯著(p＜0.05)，陽性對照組、提取物組血un水平均低于模型組，但無顯著性差異(p＞0.05)，陽性對照組、提取物組尿un水平均高于模型組，但無顯著性差異(p＞0.05)，說明造模劑能抑制尿素氮的排泄。表3東革阿里各種提取物對大鼠血清和尿液尿素氮水平的影響(n＝10)組別血清尿素氮水平(mmol/l)尿尿素氮水平(pmol/l)空白組3.87±0.5511945.50±2446.83模型組10.04±3.39*4833.95±983.93*陽性對照組7.28±2.907112.84±1780.13提取物組8.05±2.557192.34±1306.89東革阿里提取物對血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響表4表明，與空白組相比，模型組血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性均顯著升高(p＜0.05)，與模型組相比，陽性對照組血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性均顯著降低(p＜0.05)；提取物組血清黃嘌呤氧化酶活性較模型組相比，降低極顯著(p＜0.01)。說明東哥阿里提取物對黃嘌呤氧化酶的有較強的抑制作用。表4東革阿里各種提取物對大鼠血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響(n＝10)組別血清黃嘌呤氧化酶活性(ng/l)肝臟黃嘌呤氧化酶活性(ng/l)空白組40.94±7.1436.44±5.32模型組52.11±4.61*40.22±3.25*陽性對照組41.44±7.37#35.91±3.38#提取物組40.25±6.26##36.71±2.62東革阿里各種提取物對尿酸排泄分數(shù)的影響表5表明，與空白組相比，模型組尿酸排泄分數(shù)明顯降低，但無顯著性差異(p＞0.05)，陽性對照組、提取物組尿酸排泄分數(shù)均高于模型組，但無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。表5東革阿里各種提取物對大鼠24h尿酸排泄分數(shù)的影響(n＝10)組別尿酸排泄分數(shù)(％)空白組35.86±7.85模型組31.49±5.52陽性對照組38.08±8.06提取物組30.74±5.423.結論：本研究采用酵母膏、腺嘌呤、氧嗪酸鉀混合灌胃大鼠進行造模，以尿酸濃度等指標來觀察東革阿里提取物的降尿酸作用。酵母膏屬于高嘌呤食物，它通過增加動物體內的嘌呤含量來增加尿酸含量；腺嘌呤的主要作用是抑制腎臟對尿酸的排泄，從而增加血尿酸濃度；氧嗪酸鉀利用其結構與尿酸的嘌呤環(huán)類似來競爭性結合尿酸酶，抑制尿酸酶的活性，從而增加血尿酸水平。本試驗通過這三種原理來建立慢性高尿酸血癥大鼠模型，在此基礎上通過考察大鼠尿酸的排泄量、體內的尿酸含量以及黃嘌呤氧化酶活性來分析東革阿里提取物降尿酸的作用。在酵母膏、腺嘌呤和氧嗪酸鉀混合灌胃建立的高尿酸血癥模型中，與空白組相比，模型組血清尿酸水平極顯著升高，尿尿酸水平極顯著降低，血清和肝臟中的黃嘌呤氧化酶活性顯著升高，說明高尿酸血癥模型建立成功。別嘌醇灌胃給藥14天后，與模型組大鼠相比，陽性對照組大鼠血清尿酸水平顯著降低，尿液中尿酸水平顯著升高，尿肌酐水平極顯著升高，血清和肝臟中黃嘌呤氧化酶濃度顯著降低，說明別嘌醇降尿酸作用顯著。東革阿里提取物灌胃給藥14天后，與模型組相比，東革阿里提取物有一定的降尿酸作用，能極顯著促進大鼠尿液中肌酐的排泄，顯著降低肝臟中黃嘌呤氧化酶的活性，同時能降低大鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐水平，提高大鼠尿液中尿酸水平，說明東革阿里提取物有較強的降尿酸作用和促尿酸排泄作用。由于東革阿里提取物均能顯著降低黃嘌呤氧化酶活性，且能顯著提高尿液中尿酸、肌酐、尿素氮水平，推測東革阿里可能是通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性和促進尿酸的排泄這兩種方式來降低大鼠尿酸水平。當前第1頁12