本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體，其制備方法及其“三聯(lián)一體化”的抗腫瘤應用。

背景技術(shù)：

熱敏脂質(zhì)體(thermosensitiveliposomes)又稱溫度敏感脂質(zhì)體，是一種能在溫熱條件下釋放藥物的脂質(zhì)體。在高于脂質(zhì)體相變溫度的加熱溫度下，脂質(zhì)體膜由“膠晶態(tài)”轉(zhuǎn)變到液晶結(jié)構(gòu)，通透性增加，其攜帶的藥物迅速釋放于加熱部位而產(chǎn)生熱靶向作用。它有效利用了脂質(zhì)體和熱療的雙重優(yōu)勢，進一步增加了脂質(zhì)體的靶向性，減少了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對脂質(zhì)體的攝取，提高了治療效果，降低了毒性。

熱療(hyperthermia，ht)是通過人為方法提高人體組織溫度來治療腫瘤的一種方法，熱療治療腫瘤的機制主要有以下三種：①對腫瘤組織具有選擇性作用，同樣受熱腫瘤組織的熱反應敏感，溫度較正常組織升高，易被選擇性殺傷②對腫瘤細胞有直接殺傷作用，溫度超過40℃使腫瘤細胞蛋白變性，從而致使腫瘤細胞死亡③刺激腫瘤細胞產(chǎn)生熱休克蛋白，而表達熱休克蛋白的腫瘤細胞對自然殺傷細胞特別敏感，能出現(xiàn)溶解破壞。熱療雖然不能取代手術(shù)、放療或化療作為一種獨立的腫瘤治療方案，但它對化療、放療和手術(shù)等腫瘤治療手段具有明顯的增效和補充作用。

放射治療(radiationtherapy)是通過射線的電離作用引起生物體細胞產(chǎn)生損傷的過程，是治療惡性腫瘤的三大重要手段之一。大約有60％-70％的惡性腫瘤病人需要接受放射治療。根據(jù)腫瘤的生物學行為，一些腫瘤的治療以放射治療為主可達根治目的。對不宜手術(shù)、失去手術(shù)機會、手術(shù)后有腫瘤殘留或可疑腫瘤殘留者，接受放射治療是腫瘤局部控制的重要選擇。目前，增加腫瘤靶區(qū)放射劑量，提高腫瘤局部控制率，降低腫瘤周圍正常組織照射劑量，保存重要臟器正常功能，提高病人的生存質(zhì)量，成為放射治療的主要發(fā)展趨勢。

中空金納米粒屬于金納米顆粒的一種，由于其空腔結(jié)構(gòu)所形成的大吸收截面，故較實心金納米粒具有更高的光熱轉(zhuǎn)換效應，并且具備低毒、小尺寸(直徑30-60nm)、球形形狀、可調(diào)諧的(550-950nm)吸收帶等特性，因此在光熱治療上，中空金納米?？梢杂行娲鷮嵭慕鸺{米粒。此外，金納米材料的光熱治療比化療和放療副反應少得多，基本不損傷正常組織，是一種新的腫瘤熱療技術(shù)，在生物醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的應用前景。另一方面，金納米顆粒在經(jīng)x射線或γ射線照射后，產(chǎn)生強的光電吸收效應和二次電子，加速dna鏈斷裂，因此可以作為放療領(lǐng)域中一類新型的放射增敏劑。

本發(fā)明旨在將腫瘤治療劑與中空金納米粒相結(jié)合，制備出具備光敏感性和溫度敏感性的制劑，有效地聯(lián)合藥物治療、熱療和放療這種“三聯(lián)一體化”治療手段，提高對腫瘤靶向性治療效果并降低單一手段治療的毒副作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體，該制劑能夠作為良好的抗腫瘤藥物載體，通過nir使藥物在腫瘤部位高效釋放，并聯(lián)合熱療和放療作用，提高治療效果。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體制劑的制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體制劑在腫瘤治療中的應用。

本發(fā)明提供如下技術(shù)方案

一種共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體，其特征在于，所述制劑是由熱敏脂質(zhì)體通過擠膜法包載中空金納米粒，再包載腫瘤治療劑制備而成，所述脂質(zhì)體的相變溫度為39.0℃～45.0℃，所述脂質(zhì)體包含二棕櫚?；蚜字?dppc)。

進一步地，所述的熱敏脂質(zhì)體制劑，其特征在于：中空金納米粒與二棕櫚酰基卵磷脂(dppc)的重量比為1～4∶60，脂質(zhì)體的粒徑為150-250nm，電位為-15～-30mv。

進一步地，所述的熱敏脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述中空金納米粒粒徑為30-60nm，最大吸收波長在650-850nm。

進一步地，所述的熱敏脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述腫瘤治療劑選自小分子化學治療藥物、生物蛋白藥物或基因治療相關(guān)藥物。

進一步地，所述的熱敏脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述小分子化學治療藥物選自紫杉醇、鹽酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、順鉑、柔紅霉素、激素類藥物或中藥單體；所述生物蛋白藥物選自利妥昔單抗、貝伐珠單抗或曲妥珠單抗；所述基因藥物選自含報告基因、抗癌基因、細胞因子基因能在真核細胞中重組表達的質(zhì)粒dna，寡聚核苷酸或是小干擾rna。

進一步地，所述的熱敏脂質(zhì)體制劑，其特征在于：所述脂質(zhì)體制劑處方為：

其通過如下方法制備得到：按照處方量稱取dppc、dspe-peg2000，均勻混合后加入有機溶劑溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去有機溶劑成膜，加入濃縮的中空金納米粒溶液水化后，60℃過0.2μm濾膜十幾次，制備出包載中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體；加入處方量阿霉素粉末，在60℃下溶解并攪拌孵育4小時，放冷后透析除去未包載的阿霉素，得到包載阿霉素與中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體制劑。

進一步地，所述的共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體制劑的制備方法包括以下步驟：

(1)100毫升超純水，加入0.5-1ml0.05m檸檬酸鈉溶液和100μl0.4m氯化鈷溶液，氮氣保護；加入0.5-1ml0.1m硼氫化鈉溶液，攪拌15-30min，加入200-500μl1％氯金酸，通空氣攪拌30min，得到中空金納米粒；

(2)分別稱量dppc30-60mg、dspe-mpeg6-15mg，溶解于氯仿5-10ml中，30-40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑制得磷脂膜；

(3)將步驟(1)中制得的中空金納米粒按照處方量，高速離心后除去上清液，使用超純水重分散沉淀的中空金納米粒，水化步驟(2)中制得的磷脂膜，50-60℃過0.2μm濾膜十幾次；加入腫瘤治療劑并溶解，50-60℃攪拌2-6h，放冷后透析或離心除去未包載的腫瘤治療劑，得到共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體制劑。

進一步地，本發(fā)明提供所述的共載中空金納米粒和腫瘤治療劑熱敏脂質(zhì)體在制備抗腫瘤載體方面的應用。所述抗腫瘤載體的給藥途徑為注射、口服或黏膜給藥，應用于腫瘤的藥物治療、熱療聯(lián)合放療的“三聯(lián)一體化”協(xié)同治療。

進一步地，本發(fā)明提供一種共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體在“三聯(lián)一體化”治療中的應用，給予制劑后，以1-5w/cm²的nir照射腫瘤部位，照射時間為2-15min，重復2-4輪；以2-12gy功率的射線照射腫瘤部位，照射時間為3-15min。

本發(fā)明的特點

本發(fā)明的優(yōu)點在于將熱敏脂質(zhì)體與具備較佳光熱轉(zhuǎn)化能力和放療增敏效果的中空金納米粒相結(jié)合，在正常體溫37℃下，僅有不超過20％藥物釋放，而通過nir照射腫瘤部位，中空金納米粒光熱轉(zhuǎn)化，使脂質(zhì)體溫度迅速超過相轉(zhuǎn)變點，快速完全地釋放藥物殺傷腫瘤細胞，并通過中空金納米粒的產(chǎn)熱達到熱療目的。同時中空金納米粒對x射線的強光電吸收效應增強腫瘤對放療的敏感性，實現(xiàn)“三聯(lián)一體化”的協(xié)同治療策略，提高腫瘤治療效果。

本發(fā)明制備得到的包載中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體，通過nir照射可在腫瘤部位釋放藥物達到靶向效果，降低了藥物治療的毒副作用，又通過熱療和放療的進一步殺傷能力，提高了治療效果，這種聯(lián)合治療方式是未來腫瘤治療的主要趨勢之一。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中中空金納米粒的透射電鏡圖。

圖2為本發(fā)明中中空金納米粒的紫外全波長掃描圖。

圖3為幾種金納米材料光熱轉(zhuǎn)化的升溫曲線。

圖4為本發(fā)明中包載中空金納米粒熱敏脂質(zhì)體的透射電鏡圖。

圖5為本發(fā)明中包載中空金納米粒熱敏脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

圖6為包載中空金納米粒與實心金納米粒熱敏脂質(zhì)體的光熱升溫曲線。

圖7為本發(fā)明中包載中空金納米粒熱敏脂質(zhì)體在37℃和42℃溫度下的體外釋放曲線。

圖8為本發(fā)明中包載中空金納米粒熱敏脂質(zhì)體，包載實心金納米粒熱敏脂質(zhì)體，包載阿霉素熱敏脂質(zhì)體和游離阿霉素在mcf-7細胞中的細胞存活率。

圖9本發(fā)明中包載中空金納米粒熱敏脂質(zhì)體，包載實心金納米粒熱敏脂質(zhì)體，包載阿霉素熱敏脂質(zhì)體和游離阿霉素在激光處理后mcf-7細胞的存活率。

圖10本發(fā)明中包載中空金納米粒熱敏脂質(zhì)體，包載實心金納米粒熱敏脂質(zhì)體經(jīng)x射線照射后細胞存活率。

具體實施方式

下面為本專利的實施例，但下述實施例并不限制本專利的權(quán)利范圍。

實施例1：

中空金納米粒的合成與表征

100毫升超純水，加入1ml0.05m檸檬酸鈉溶液和100μl0.4m氯化鈷溶液，氮氣保護；加入1ml0.1m硼氫化鈉溶液，攪拌15min，加入200μl1％氯金酸，通空氣攪拌30min，15000轉(zhuǎn)離心15min，超純水重分散沉淀，得到中空金納米粒；使用透射電鏡和紫外全波長掃描儀對產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果如圖1和圖2。

實施例2：

幾種金納米材料光熱轉(zhuǎn)化能力的比較

按照相關(guān)文獻方法制備得到實心金納米粒、金納米星和中空金納米粒，通過離心濃縮，調(diào)整使其金含量相同；分別從上述溶液中取1ml于石英皿，808nm激光以3w/cm²照射10min，紅外測溫槍每隔1min檢測一次溫度，并以生理鹽水作為對照，結(jié)果如圖3。

實施例3：

按照處方量稱取dppc、dspe-peg2000，均勻混合后加入有機溶劑溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去有機溶劑成膜，加入濃縮的中空金納米粒溶液水化后，60℃過0.2μm濾膜十幾次，制備出包載中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體；加入處方量阿霉素粉末，在60℃下溶解并攪拌孵育4小時，放冷后透析除去未包載的阿霉素，得到包載阿霉素與中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體制劑。

實施例4：

按照處方量稱取dppc、mppc，均勻混合后加入有機溶劑溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去有機溶劑成膜，加入濃縮的中空金納米粒溶液水化后，50℃過0.2μm濾膜十幾次，制備出包載中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體；加入處方量順鉑粉末，在50℃下溶解并攪拌孵育3小時，放冷后透析除去未包載的順鉑，得到包載順鉑與中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體制劑。

實施例5

按照處方量稱取dppc、dspe-peg2000，均勻混合后加入有機溶劑溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去有機溶劑成膜，加入利妥昔單抗的pbs溶液(0.5-2mg/ml)水化后，加入濃縮的中空金納米粒，50℃過0.2μm濾膜十幾次，制備出包載利妥昔單抗與中空金納米粒的熱敏脂質(zhì)體制劑。

實施例6：包載中空金納米粒熱敏脂質(zhì)體的透射電鏡檢測與粒徑分布測定：通過jem透射電子顯微鏡檢測熱敏脂質(zhì)體的形態(tài)，結(jié)果如圖4；通過馬爾文激光粒度儀測定脂質(zhì)體的粒徑分布，脂質(zhì)體平均粒徑為200nm，粒徑分布圖見圖5。

實施例7：包載中空金納米粒與實心金納米粒熱敏脂質(zhì)體的光熱轉(zhuǎn)化能力比較

按照上述工藝制備包載中空金納米粒和實心金納米粒的熱敏脂質(zhì)體，調(diào)整濃度使其金含量相同；分別從上述溶液中取1ml于石英皿，808nm激光以3w/cm²照射10min，紅外測溫槍每隔1min檢測一次溫度，并以pbs(7.4)作為對照，結(jié)果如圖6。

實施例8：共載中空金納米粒和阿霉素的熱敏脂質(zhì)體的體外釋放評價

取包載阿霉素的制劑2ml于透析袋(截留分子量＝7000da)內(nèi)，兩端用棉線扎緊，置于50ml碘量瓶中，各加入釋放介質(zhì)(ph7.4)20ml，分別置于37℃和42℃恒溫水浴振蕩器中，轉(zhuǎn)速為100r/min，分別于0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h每次取樣1ml，補等溫釋放介質(zhì)1ml，樣品于熒光分光光度計檢測，計算藥物釋放量，結(jié)果如圖7。

實施例9：共載中空金納米粒和腫瘤治療劑的熱敏脂質(zhì)體體外抗腫瘤活性評價

(1)單一化療作用

將mcf-7細胞以5000個/孔接種于96孔板中，孵育24h后，將制劑稀釋成不同濃度加入96孔板中，同時以游離阿霉素溶液作為對照組。孵育48h后，取20μl四甲基偶氮唑藍(mtt，5mg/ml)加入各孔內(nèi)，繼續(xù)孵育4h，棄去孔內(nèi)液體，加入dmso150μl，振搖10min使結(jié)晶充分溶解，在570nm波長下用酶標儀測定各樣品的吸光值(odsample)，同時測定空白組od值(odcontrol)，并計算細胞存活率，結(jié)果見圖8。

(2)化療聯(lián)合熱療作用

將mcf-7細胞以5000個/孔接種于96孔板中，孵育24h后，將制劑稀釋成不同濃度加入96孔板中，同時以游離阿霉素溶液作為對照組。孵育6h后，以808nm激光2w/cm²，照射5min，在2h內(nèi)處理4次，繼續(xù)孵育42h，取20μl四甲基偶氮唑藍(mtt，5mg/ml)加入各孔內(nèi)，繼續(xù)孵育4h，棄去孔內(nèi)液體，加入dmso150μl，振搖10min使結(jié)晶充分溶解，在570nm波長下用酶標儀測定各樣品的吸光值(odsample)，同時測定空白組od值(odcontrol)，并計算細胞存活率，結(jié)果見圖9。

(3)放療增敏作用

將mcf-7細胞以5000個/孔接種于96孔板中，孵育24h后，將未包載治療劑的制劑稀釋成不同濃度(以au含量計)加入96孔板中，同時以pbs溶液作為對照組。孵育6h后，以6gay放射線照射5min，繼續(xù)孵育42h，取20μl四甲基偶氮唑藍(mtt，5mg/ml)加入各孔內(nèi)，繼續(xù)孵育4h，棄去孔內(nèi)液體，加入dmso150μl，振搖10min使結(jié)晶充分溶解，在570nm波長下用酶標儀測定各樣品的吸光值(odsample)，同時測定空白組od值(odcontrol)，并計算細胞存活率，結(jié)果見圖10。