本發(fā)明涉及發(fā)中藥微生物發(fā)酵制劑，具體來說是一種中藥微生物發(fā)酵制劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腦血栓形成是腦梗死最常見的類型。是腦動脈主干或皮質(zhì)支動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管增厚、管腔狹窄閉塞和血栓形成，引起腦局部血流減少或供血中斷，腦組織缺血缺氧導(dǎo)致軟化壞死出現(xiàn)局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；該疾病隨年齡增長病死率明顯上升，平均病死率為25％左右，常見死因是腦疝、多臟器衰竭、繼發(fā)感染及心肺功能不全幸存者中病殘率亦較高，大約20％的幸存者在1～2年內(nèi)再次復(fù)發(fā)。

目前西醫(yī)臨床上防治腦血栓的方法主要是急性期內(nèi)溶栓抗凝抗水腫治療，所用藥物副作用大且復(fù)發(fā)率高，中醫(yī)臨床使用的藥物同樣存在上述缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述問題，提供一種副作用小、利用率高、不易復(fù)發(fā)的中藥微生物發(fā)酵制劑及其制備方法和應(yīng)用，可以有效預(yù)防和治療高血壓、腦動脈硬化、腦萎縮、腦血栓及其后遺癥。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種中藥微生物發(fā)酵制劑，將側(cè)耳與中藥原料藥混合發(fā)酵所得，所述中藥原料藥按重量份數(shù)計(jì)：川穹10-100份，丹參10-100份，三七10-100份，天麻10-100份，白芷10-100份，銀杏葉10-100份，葛根10-100份，蠶蛹10-100份，安息香10-100份，石菖蒲10-100份，僵蠶6-60份，郁金6-60份，羚羊角6-60份，人工牛黃6-60份，羅布麻6-60份，茯苓6-60份，桂枝6-60份，甘草6-60份，毛冬青6-60份，地龍6-60份，牛膝6-60份，姜黃4-40份，桃仁4-40份，蔓刑子4-40份，黃芪4-40份，路路通4-40份，人參4-40份，黃苓4-40份，獨(dú)活4-40份，石斛4-40份，冰片2-20份，穿山甲2-20份，血謁2-20份，水蛭2-20份，珍珠2-20份，大黃2-20份，琥珀2-20份，麻黃2-20份，朱砂2-20份，遠(yuǎn)志2-20份，全蝎2-20份，麝香2-20份；側(cè)耳占中藥原料藥質(zhì)量的5％-10％；

所述側(cè)耳為pleurotussp.，已于2014年4月14日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為cgmccno.9060。

上述側(cè)耳已在cn105412739a(申請?zhí)?01410480058.0,申請日2014年09月18日)中公布。

本發(fā)明中藥原料藥的重量份數(shù)優(yōu)選為：川穹50-100份，丹參50-100份，三七50-100份，天麻50-100份，白芷50-100份，銀杏葉50-100份，葛根50-100份，蠶蛹50-100份，安息香50-100份，石菖蒲50-100份，僵蠶30-60份，郁金30-60份，羚羊角30-60份，人工牛黃30-60份，羅布麻30-60份，茯苓30-60份，桂枝30-60份，甘草30-60份，毛冬青30-60份，地龍30-60份，牛膝30-60份，姜黃20-40份，桃仁20-40份，蔓刑子20-40份，黃芪20-40份，路路通20-40份，人參20-40份，黃苓20-40份，獨(dú)活20-40份，石斛20-40份，冰片10-20份，穿山甲10-20份，血謁10-20份，水蛭10-20份，珍珠10-20份，大黃10-20份，琥珀10-20份，麻黃10-20份，朱砂10-20份，遠(yuǎn)志10-20份，全蝎10-20份，麝香10-20份。

本發(fā)明中藥原料藥的重量數(shù)最優(yōu)選為：川穹100g，丹參100g，三七100g，天麻100g，白芷100g，銀杏葉100g，葛根100g，蠶蛹100g，安息香100g，石菖蒲100g，僵蠶60g，郁金60g，羚羊角60g，人工牛黃60g，羅布麻60g，茯苓60g，桂枝60g，甘草60g，毛冬青60g，地龍60g，牛膝60g，姜黃40g，桃仁40g，蔓刑子40g，黃芪40g，路路通40g，人參40g，黃苓40g，獨(dú)活40g，石斛40g，冰片20g，穿山甲20g，血謁20g，水蛭20g，珍珠20g，大黃20g，琥珀20g，麻黃20g，朱砂20g，遠(yuǎn)志20g，全蝎20g，麝香20g。

所述中藥微生物發(fā)酵制劑的制備方法為：

(1)按重量份數(shù)計(jì)，取川穹10-100份，丹參10-100份，三七10-100份，天麻10-100份，白芷10-100份，銀杏葉10-100份，葛根10-100份，蠶蛹10-100份，安息香10-100份，石菖蒲10-100份，僵蠶6-60份，郁金6-60份，羚羊角6-60份，人工牛黃6-60份，羅布麻6-60份，茯苓6-60份，桂枝6-60份，甘草6-60份，毛冬青6-60份，地龍6-60份，牛膝6-60份，姜黃4-40份，桃仁4-40份，蔓刑子4-40份，黃芪4-40份，路路通4-40份，人參4-40份，黃苓4-40份，獨(dú)活4-40份，石斛4-40份，冰片2-20份，穿山甲2-20份，血謁2-20份，水蛭2-20份，珍珠2-20份，大黃2-20份，琥珀2-20份，麻黃2-20份，朱砂2-20份，遠(yuǎn)志2-20份，全蝎2-20份，麝香2-20份的中藥原料藥混合，待用；

(2)取步驟(1)的中藥原料混合物與側(cè)耳混合發(fā)酵后,得到發(fā)酵物,將發(fā)酵物干燥、磨成細(xì)粉即得到中藥微生物發(fā)酵制劑；

所述步驟(2)側(cè)耳接種量為中藥原料的5％-10％，并在溫度為37-65℃、濕度為80％-98％條件下發(fā)酵1-7天，得到中藥微生物發(fā)酵制劑。

所述側(cè)耳(pleurotussp.)，已于2014年4月14日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為cgmccno.9060。

所述中藥微生物發(fā)酵制劑可制成散劑、片劑、丸劑、膠丸、膠囊劑、乳劑、糖漿或口服液。

所述中藥微生物發(fā)酵制劑的應(yīng)用：作為制備預(yù)防或治療高血壓、腦動脈硬化、腦萎縮、腦血栓、腦梗塞及其后遺癥的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的發(fā)酵中藥制劑是參照君臣佐使的中藥組方原則所設(shè)計(jì)的現(xiàn)代中藥。采用的原料藥的功效如下所示：

川穹中的川穹嗪能擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，改善心肌的血氧供應(yīng)，并降低心肌的耗氧量；可擴(kuò)張腦血管，降低血管阻力，顯著增加腦及肢體血流量，改善微循環(huán)；能降低血小板表面活性，抑制血小板凝集，預(yù)防血栓的形成。

天麻可鎮(zhèn)靜、降壓、增加冠狀動脈血流量、促進(jìn)腦血流、降低腦血管阻力，增加耐缺氧力和對心肌缺血有保護(hù)作用。天麻尤其對多種原因所致眩暈有良效，同時治療老年人多發(fā)的高血壓。

上述中藥中川穹，丹參，三七，天麻，白芷，銀杏葉，葛根，蠶蛹，安息香和石菖蒲作為主藥，其他藥物作為輔藥；主要和輔藥混合可更有效的提高各自成分的作用；同時可將輔藥中各類成分按照6:4:2的質(zhì)量比例混合，即輔藥1：輔藥2：輔藥3為6:4:2，其中輔藥1為僵蠶，郁金，羚羊角，人工牛黃，羅布麻，茯苓，桂枝，甘草，毛冬青，地龍和牛膝；輔藥2為姜黃，桃仁，蔓刑子，黃芪，路路通，人參，黃苓，獨(dú)活和石斛；輔藥3為冰片，穿山甲，血謁，水蛭，珍珠，大黃，琥珀，麻黃，朱砂，遠(yuǎn)志，全蝎和麝香；將中藥按照10:6:4:2的科學(xué)配伍比例，可有效將各中藥成分間的相輔相成作用發(fā)揮極致，進(jìn)而再將微生物在其中進(jìn)行發(fā)酵，所得發(fā)酵物在經(jīng)側(cè)耳發(fā)酵后吸取中藥同時發(fā)酵產(chǎn)生的有益物質(zhì)能夠更好的作為預(yù)防或治療高血壓、腦動脈硬化、腦萎縮、腦血栓、腦梗塞及其后遺癥的藥物；所述后遺癥指偏癱(半身不遂)、四肢麻木、語言障礙、頭痛、頭暈、眼花、耳鳴、失眠、反應(yīng)遲鈍、應(yīng)激差、記憶力減退等。

本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明提供的中藥微生物發(fā)酵制劑具有活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)、消腫降壓、鎮(zhèn)靜安神、扶正固本中和調(diào)理的作用。

2.本發(fā)明為純發(fā)酵微生物中藥制劑，無毒無副作用，安全可靠；另外，本發(fā)明在繼承中藥炮制學(xué)發(fā)酵法基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代生物工程的發(fā)酵技術(shù)，利用側(cè)耳對中藥材進(jìn)行發(fā)酵處理，增加了藥物的療效和利用率。

3.多味藥材科學(xué)配伍，溫寒互補(bǔ)，能調(diào)養(yǎng)五臟，凈化血液，充盈氣血，清除血管垃圾并能有效預(yù)防復(fù)發(fā)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的具體數(shù)據(jù)絕非僅限于這些實(shí)施例。

一、藥物制備

實(shí)施例1

1.按重量份數(shù)計(jì)，取川穹50份，丹參50份，三七50份，天麻50份，白芷50份，銀杏葉50份，葛根50份，蠶蛹50份，安息香50份，石菖蒲50份，僵蠶30份，郁金30份，羚羊角30份，人工牛黃30份，羅布麻30份，茯苓30份，桂枝30份，甘草30份，毛冬青30份，地龍30份，牛膝30份，姜黃20份，桃仁20份，蔓刑子20份，黃芪20份，路路通20份，人參20份，黃苓20份，獨(dú)活20份，石斛20份，冰片10份，穿山甲10份，血謁10份，水蛭10份，珍珠10份，大黃10份，琥珀10份，麻黃10份，朱砂10份，遠(yuǎn)志10份，全蝎10份，麝香10份的中藥原料混合粉碎，過100目篩，制成中藥混合細(xì)粉,待用；

2.側(cè)耳活化：采用接種環(huán)挑取側(cè)耳菌絲接于pda固體培養(yǎng)基,在20℃、培養(yǎng)120小時，得到側(cè)耳純培養(yǎng)單菌落。

3.將上述活化的側(cè)耳接種到步驟1中藥原料中，并在溫度為60℃、濕度為98％條件下發(fā)酵7天，得到發(fā)酵產(chǎn)物，活化的側(cè)耳占中藥原料質(zhì)量的10％。

4.將上述發(fā)酵產(chǎn)物烘干、粉碎，過100目篩，所得細(xì)粉為中藥微生物發(fā)酵制劑。

所述側(cè)耳(pleurotussp.)，已于2014年4月14日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為cgmccno.9060，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

實(shí)施例2

1.按重量份數(shù)計(jì)，取川穹100份，丹參100份，三七100份，天麻100份，白芷100份，銀杏葉100份，葛根100份，蠶蛹100份，安息香100份，石菖蒲100份，僵蠶60份，郁金60份，羚羊角60份，人工牛黃60份，羅布麻60份，茯苓60份，桂枝60份，甘草60份，毛冬青60份，地龍60份，牛膝60份，姜黃40份，桃仁40份，蔓刑子40份，黃芪40份，路路通40份，人參40份，黃苓40份，獨(dú)活40份，石斛40份，冰片20份，穿山甲20份，血謁20份，水蛭20份，珍珠20份，大黃20份，琥珀20份，麻黃20份，朱砂20份，遠(yuǎn)志20份，全蝎20份，麝香20份的中藥原料混合粉碎，過110目篩，制成中藥混合細(xì)粉,待用；

2.側(cè)耳活化：采用接種環(huán)挑取側(cè)耳菌絲接于pda固體培養(yǎng)基,在35℃、培養(yǎng)70小時，得到側(cè)耳純培養(yǎng)單菌落。

3.將上述活化的側(cè)耳接種到步驟1中藥原料中，并在溫度為65℃、濕度為98％條件下發(fā)酵5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物，活化的側(cè)耳占中藥原料質(zhì)量的5％。

4.上述發(fā)酵產(chǎn)物烘干、粉碎，過100目篩，所得細(xì)粉為中藥微生物發(fā)酵制劑。

所述側(cè)耳(pleurotussp.)，已于2014年4月14日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為cgmccno.9060，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

二、臨床前試驗(yàn)

1.急性毒性試驗(yàn)(小白鼠最大耐受量)：

觀察本實(shí)驗(yàn)提供的中藥微生物發(fā)酵制劑以小白鼠所能接受的最大劑量灌胃給藥產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況，測定小白鼠的最大耐受劑量，為臨床用藥的安全性體統(tǒng)動物急性毒性實(shí)驗(yàn)參考。

受試藥物為上述實(shí)施例1制備的散劑，將其用蒸餾水配制成37.5％濃度(g/ml)供試驗(yàn)用。受試動物為昆明種封閉群小白鼠，體重18-22g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：遼實(shí)條合字1號與遼實(shí)質(zhì)合字008。

(1)取小白鼠20只，雌雄各半，禁食不禁水17小時，稱體重；

(2)按劑量1ml/20gbw的容積24小時內(nèi)給藥兩次，間隔8小時，相當(dāng)每次劑量為18.75g/kg，日累積劑量為37.5g/kg，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察7天；

結(jié)果受試動物健康，未發(fā)現(xiàn)受試動物死亡或由藥物中毒引起的異常變化。即表明本發(fā)明提供的制劑小白鼠灌胃給藥的最大耐受量大于或等于37.5g/kg·日，大于或等于臨床承認(rèn)每日試用量0.2g/kg·日的187.5倍，參照中藥急性毒性實(shí)驗(yàn)要求(中華人民共和國衛(wèi)生部：新藥審批辦法《有關(guān)中藥部分的修訂和補(bǔ)充規(guī)定》，1992年9月1日起施行)，臨床試用4g/次，日服2-3次是安全的。

2.小白鼠凝血時間的影響的測定：

受試藥物與受試動物同上，受試藥物用蒸餾水配置成20％濃度(g/ml)供試驗(yàn)用。

(1)取雄性小白鼠44只，4禁食不禁水17小時，稱體重，隨機(jī)分為4組，每組11只；

(2)按下表1劑量灌胃給藥，每天一次，連續(xù)給藥3天(不超過動物所能接受的最大容積1ml/20g)；

(3)末次給藥后1小時，剪尾尖取血(徐叔云等，藥理實(shí)驗(yàn)方法字，人民衛(wèi)生出版社，1982第一版，835)，取血前禁食不禁水17小時，干棉球拭去第一滴血，再以清潔載玻片取一大滴血液，直徑約5-10mm，立即開始計(jì)時，2min后，每隔30s，用潔凈干燥的針頭，自血滴邊緣向中心輕輕挑動血滴一次，并觀察有無纖維蛋白絲被挑起，直至有纖維蛋白絲被挑起為止，記錄自血液流出至有纖維蛋白絲被挑起的時間為凝血時間。同時取血，常規(guī)方法做血小板計(jì)數(shù)，以各組平均凝血時間和平均血小板數(shù)分別以調(diào)和平均法和t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較各組的差異顯著性。

表1中藥微生物發(fā)酵制劑對小白鼠凝血時間及血小板數(shù)的影響檢測結(jié)果

***p＜0.001(與對照組比較)

由上表可見，本發(fā)明所提供的中藥微生物發(fā)酵制劑能非常明顯地降低血小板數(shù)，并有一定延長凝血時間的傾向。目前實(shí)驗(yàn)室多以抗凝血作用和對血小板數(shù)目的影響作為防治腦血栓等疾病藥物的輔助藥效學(xué)指標(biāo)，本實(shí)施例結(jié)果表明，本發(fā)明提供的中藥微生物發(fā)酵制劑能非常明顯的降低血小板數(shù)目，并有一定的抗凝血傾向(延長了凝血時間)。

三、臨床試驗(yàn)

受試藥物為實(shí)施例1制備的散劑，4g/次，每天2次，飯前溫開水沖服，治療期間患者均未使用其他治療手段。受試患者為腦血栓(或多發(fā)性，伴隨或不伴隨腦梗塞或腦萎縮)患者200例，患者均不同程度伴隨偏癱(半身不遂)、四肢麻木、語言障礙、頭痛、頭暈、眼花、耳鳴、失眠、反應(yīng)遲鈍、應(yīng)激差、記憶力減退、高血壓等癥狀。

臨床療效：按下述臨床療效判斷標(biāo)準(zhǔn)，200例患者中，153例患者治愈，其中150例患者2月內(nèi)治愈，另外3例患者3-4月治愈；顯效41例，有效2例，無效4例；治愈率76.5％，有效率98.0％，且用藥過程中和回訪中均未發(fā)現(xiàn)明顯副作用、無復(fù)發(fā)。

血栓臨床療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：①臨床治愈：臨床癥狀消失，功能活動恢復(fù)正常；②顯效：臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)；③有效：臨床癥狀部分好轉(zhuǎn)；④無效：臨床癥狀體征無改變。

四、典型病例

病例1

高某，女，農(nóng)民，患腦血栓，半身不遂，伴隨頭痛頭暈耳鳴，四肢麻木等癥，服藥四個月后頭痛頭暈、四肢麻木、半身不遂癥狀消失，血栓消失，一年未復(fù)發(fā)。

病例2

李某，女，58歲，小學(xué)教師，患有腦動脈硬化，腦血栓，伴隨頭痛、頭暈眼花、記憶力減退、反應(yīng)遲鈍，用藥三個月后血栓消失，頭痛、頭暈眼花癥狀消失，記憶力有所提高，大腦思維活動能力明顯好轉(zhuǎn)，能夠正常工作。

病例3

孫某，男，60歲，工人，多發(fā)性腦血栓，腦萎縮，腦梗塞，伴隨頭痛、頭暈、失眠，大腦應(yīng)激差，半身不遂，口眼歪斜，用藥2個月后復(fù)診精神狀態(tài)良好，自感精力充沛，睡眠得到改善，頭痛頭暈癥狀消失，血栓、萎縮消失，連續(xù)服藥3個月后，大腦應(yīng)激明顯改善，病癥基本消失，可以做到生活自理。