本發(fā)明涉及組織蛋白酶抑制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種具有高選擇性的組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑在制備抑制以組織蛋白酶k為靶標(biāo)的疾病藥中的應(yīng)用，所述疾病包括骨質(zhì)疏松、牙齦病(牙齦炎和牙周炎)、佩吉特氏病、代謝性骨病、骨折、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、假體周圍骨質(zhì)溶解、成骨不全、惡性高鈣血癥、多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性骨病和疼痛。

背景技術(shù)：

涉及到異常骨吸收相關(guān)的病癥很多，包括但不限于骨質(zhì)疏松、牙齦病(牙齦炎和牙周炎)、佩吉特氏病、代謝性骨病、骨折、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、假體周圍骨質(zhì)溶解、成骨不全、惡性高鈣血癥、多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性骨病和疼痛。最常見之一是骨質(zhì)疏松，其常見于老年人和絕經(jīng)后婦女。中國50歲以上的人群中，有30％患有骨質(zhì)疏松癥，隨著人均壽命延長，人口老齡化趨勢嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來越高，由此引發(fā)的骨折導(dǎo)致老年患者的病死率和致殘率增高[羅先正,骨質(zhì)疏松癥的流行病學(xué)概況,中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥,17(2):1651-1662,2010]。

骨質(zhì)疏松是由破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成之間的關(guān)系失衡引起的。組織蛋白酶k選擇性地大量表達(dá)于破骨細(xì)胞，其生理作用底物正是在有機(jī)骨基質(zhì)中含量達(dá)95％的ⅰ型膠原，它將完整的三股螺旋體結(jié)構(gòu)膠原蛋白降解成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的纖維碎片，除ⅰ型膠原外，組織蛋白酶k還能降解骨基質(zhì)中的骨橋接素和骨連接素，是破骨細(xì)胞中溶骨活性最強(qiáng)的關(guān)鍵酶。人體組織蛋白酶k基因表達(dá)的變異會導(dǎo)致致密性成骨不全癥，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨脆性增加。采用組織蛋白酶k基因缺失小鼠骨髓培養(yǎng)的離體破骨細(xì)胞不能形成骨吸收陷窩，不能有效降解i型膠原。

組織蛋白酶k是骨質(zhì)疏松藥物的關(guān)鍵靶標(biāo)，臨床前和臨床研究數(shù)據(jù)表明組織蛋白酶k抑制劑對骨吸收的抑制作用可以達(dá)到80％，而不降低骨形成的生物指標(biāo)?；谶@種防治骨質(zhì)疏松策略的4種組織蛋白酶k抑制劑中至少2種的臨床試驗(yàn)失敗，失敗原因與導(dǎo)致非骨骼組織的纖維化有關(guān)。該類抑制劑是以組織蛋白酶k活性位點(diǎn)為靶點(diǎn)的，不僅抑制組織蛋白酶k與藥效相關(guān)的膠原酶活性，同時也抑制酶的其他生理活性。研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶k缺陷鼠除了表現(xiàn)骨骼系統(tǒng)預(yù)期的表型外，還表現(xiàn)肺氣道損傷，易于使肺和皮膚發(fā)生纖維化，甲狀腺球蛋白(tg)釋放甲狀腺素功能障礙，甚至導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶缺陷等，表明活性位點(diǎn)抑制劑可能引起副作用，這為開發(fā)新型的抗骨質(zhì)疏松藥物提出了挑戰(zhàn)。

目前國內(nèi)外catk抑制劑專利均為活性位點(diǎn)抑制劑，尚未有非活性位點(diǎn)抑制劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一方面是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能特異性結(jié)合組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)，選擇性抑制組織蛋白酶k活性的物質(zhì)在制備以組織蛋白酶k為靶標(biāo)的疾病藥中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑在制備以組織蛋白酶k為靶標(biāo)的疾病藥中的應(yīng)用；所述組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑選自：化學(xué)式母核為i、ii或iii所示三環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，所述化合物的可藥用的酯、酰胺或鹽，和包含所述酯或酰胺的鹽或組合物；

其中：c環(huán)選自苯環(huán)和環(huán)己基環(huán)；a環(huán)存在對位和間位雙酮、或五環(huán)和六環(huán)內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)；a環(huán)1,2位取代基選自呋喃環(huán)、吡喃環(huán)、二氫取代呋喃環(huán)和二氫取代吡喃環(huán)。

作為本發(fā)明的一個優(yōu)選例，c環(huán)選自甲基苯環(huán)和二甲基環(huán)己基環(huán)。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑選自a環(huán)或c環(huán)上取代基所形成的酯、酰胺和鹽。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑為丹參酮iia磺酸鈉。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述以組織蛋白酶k為靶標(biāo)的疾病選自骨質(zhì)疏松、牙齦病、佩吉特氏病、代謝性骨病、骨折、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、假體周圍骨質(zhì)溶解、成骨不全、惡性高鈣血癥、多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性骨病和疼痛；所述牙齦病選自牙齦炎和牙周炎。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述以組織蛋白酶k為靶標(biāo)的疾病為骨吸收異常疾病。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述骨吸收異常疾病為骨質(zhì)疏松。

本發(fā)明另一方面提供了一種藥物組合物在制備以組織蛋白酶k為靶標(biāo)的疾病藥中的應(yīng)用，所述藥物組合物包含組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑，所述組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑選自：化學(xué)式母核為i、ii或iii所示三環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，所述化合物的可藥用的酯、酰胺或鹽，和包含所述酯或酰胺的鹽或組合物；

其中：c環(huán)選自苯環(huán)和環(huán)己基環(huán)；a環(huán)存在對位和間位雙酮、或五環(huán)和六環(huán)內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)；a環(huán)1,2位取代基選自呋喃環(huán)、吡喃環(huán)、二氫取代呋喃環(huán)和二氫取代吡喃環(huán)。

作為本發(fā)明的一個優(yōu)選例，所述藥物組合物以所述組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑為唯一活性物質(zhì)。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述以組織蛋白酶k為靶標(biāo)的疾病為骨吸收異常疾病。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明的組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑作用于人體組織蛋白酶k氨基酸序列(1：位于氨基酸序列tyr⁸⁷到gly¹⁰²，2：gly¹⁰⁸到glu¹¹⁸)，藥效學(xué)研究表明，能顯著抑制人破骨細(xì)胞活性，改善雌激素缺失去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠骨結(jié)構(gòu)特征和生理狀態(tài)，包括提高骨密度、改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu)和提高骨組織的生物力學(xué)等，從而具有顯著的抗骨質(zhì)疏松作用，且對大腦學(xué)習(xí)記憶能力無影響。該類抑制劑為抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)提供了新的思路。

附圖說明

圖1：t06作為非活性位點(diǎn)特征。(a)sds-page分析i型膠原降解，(b)膠原降解的ic50圖，(c)sds-page分析明膠的降解活性，(d)sem觀察t06存在和不存在下i型膠原纖維的電鏡圖，(e)i型膠原纖維消化后羥基脯氨酸定量測定，(f)分子對接鑒定t06的對接位點(diǎn)。

圖2：t06和t02對破骨細(xì)胞tracp陽性細(xì)胞和破骨細(xì)胞骨吸收陷窩(a、c)以及破骨細(xì)胞代謝活性和細(xì)胞數(shù)目的影響(b、d)。

圖3：小鼠造模10周的體重變化(a)和臟器系數(shù)(b)。

圖4：t06對子宮系數(shù)(a)及子宮切片(b)包括對子宮面積(c)，子宮腔面積(d)，和子宮腔上皮細(xì)胞厚度(e)的影響。

圖5：t06對去卵巢小鼠股骨(a)和脊椎骨l5(b)骨密度的影響。

圖6：對小鼠骨吸收相關(guān)血清生化rankl和ctx-i的影響。

圖7：t06對小鼠行為影響。(a)曠場實(shí)驗(yàn)，(b)高架十字迷宮，(c)水迷宮第2-5天訓(xùn)練，(d)水迷宮第6天測試。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。

骨質(zhì)疏松的問題與破骨細(xì)胞中組織蛋白酶k活性有著密不可分的關(guān)系，因此能抑制組織蛋白酶k活性的化合物，也就意味著能改善骨質(zhì)疏松所造成的骨質(zhì)丟失和骨折現(xiàn)象。

本發(fā)明所述一種組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑(cathepsinkexositeinhibitor)，該化合物母核結(jié)構(gòu)選自下列中的一種：

較佳地：c環(huán)為甲基苯環(huán)或二甲基環(huán)己基環(huán)；a環(huán)存在對位或間位雙酮，1,2位取代基為呋喃環(huán)和二氫取代呋喃環(huán)。上述a環(huán)和c環(huán)的選擇可以同時或分開選擇。本發(fā)明揭露較佳結(jié)構(gòu)為丹參酮iia磺酸鈉，但并不以此為限。其中丹參酮iia磺酸鈉結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明揭露一種組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑的用途，應(yīng)用于制備抗骨質(zhì)疏松的藥物。本發(fā)明揭露較佳結(jié)構(gòu)為丹參酮iia磺酸鈉，但并不以此為限。以下通過實(shí)驗(yàn)具體說明本發(fā)明應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松的藥效。

實(shí)施例1：新型組織蛋白酶k非活性位點(diǎn)抑制劑的篩選和確證

對丹參中7個單體化合物，i型結(jié)構(gòu)丹參新醌d，ii型結(jié)構(gòu)二氫丹參酮i，丹參酮i，丹參酮iia，隱丹參酮，丹參酮iia磺酸鈉和iii型結(jié)構(gòu)表丹參隱螺內(nèi)酯進(jìn)行了非活性位點(diǎn)抑制劑的篩選。結(jié)構(gòu)如下：

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材與試劑

單體化合物丹參新醌d，二氫丹參酮i，丹參酮i，丹參酮iia，隱丹參酮，丹參酮iia磺酸鈉和表丹參隱螺內(nèi)酯，購買自chemfaces公司；benzyloxycarbonyl-phe-arg-7-amido-4-methylcoumarin(z-fr-mca)購自日本wako公司；硫酸軟骨素a(c4-s)，e-64(l-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和胃蛋白酶購自美國sigma公司；i型膠原購自美國affymetrix公司；微孔過濾濾膜離心管購自amicomillipore公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1膠原纖維降解活性

采用凝膠電泳法(sds-page)，可溶性i型膠原溶解于100mm醋酸鈉緩沖液(ph5.5，包含2.5mmdtt和2.5mmedta)中，最終濃度為0.6mg/ml，依次將catk(最終濃度400nm)、c4-s(最終濃度200nm)和化合物單體(不同濃度抑制劑)加入到含有i型膠原蛋白的反應(yīng)液中，使總反應(yīng)液容量為50μl?；靹?，28℃孵育4小時，取出后加入1μl的100μme64終止反應(yīng)。采用10％的sds-page凝膠電泳分離，卡馬斯亮藍(lán)染色20分鐘，用乙酸-甲醇(4:1)脫色。i型膠原的α1條帶的灰度用genesnap(syngeneinc.frederick，md)軟件進(jìn)行定量分析。非活性位點(diǎn)和活性位點(diǎn)抑制劑均能抑制i型膠原的α1條帶降解。

2.2彈性纖維降解活性

稱取1mg剛果紅彈性纖維蛋白(congo-redelastin)，置于100μl的100mm醋酸鈉緩沖液中(ph5.5，包含2.5mmdtt和2.5mmedta)，加入終濃度為1μm的catk和不同濃度抑制劑，37℃，200轉(zhuǎn)/min搖床，孵育16小時。樣品取出，8000轉(zhuǎn)/min，離心5min，取上清液90μl，490nm波長下檢測熒光信號。計(jì)算公式：抑制率％＝100－(1－vi/v0)。vi和v0分別表示存在和不存在抑制劑情況下的熒光信號。

2.3z-fr-mca底物結(jié)合(活性位點(diǎn))

抑制劑用100mm醋酸鈉緩沖液(ph5.5，包含2.5mmdtt和2.5mmedta)稀釋至濃度為25μm，加入96孔板，最終反應(yīng)容量為1ml。加入終濃度為5nm的catk孵育5分鐘，加入5μl底物1mm/ml的z-fr-mca溶液開始反應(yīng)，檢測熒光信號(發(fā)散光波長460nm，吸收光波長355nm)。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組(無抑制劑)，陽性對照組(e-64，活性位點(diǎn)抑制劑)。計(jì)算公式：抑制率％＝100－(1－vi/v0)。vi和v0分別表示存在和不存在抑制劑情況下的熒光信號。

2.4明膠降解(活性位點(diǎn))

采用凝膠電泳法(sds-page)，可溶性i型膠原在95℃加熱20分鐘得到明膠，溶解在100mm醋酸鈉緩沖液(ph5.5，包含2.5mmdtt和2.5mmedta)，最終濃度為1.8mg/ml，將catk(最終濃度5nm)和單體化合物(最終濃度25μm)加入反應(yīng)液中，使總反應(yīng)液容量50μl?；靹颍?8℃孵育4小時，取出后加入1μl的100μme64終止反應(yīng)。采用10％的sds-page凝膠電泳分離，卡馬斯亮藍(lán)染色20分鐘，用乙酸-甲醇(4:1)脫色。明膠的α1條帶的灰度用genesnap(syngeneinc.frederick，md)軟件進(jìn)行定量分析?；钚晕稽c(diǎn)抑制劑，明膠α1條帶將被抑制，非活性位點(diǎn)抑制劑對明膠降解無抑制作用。

2.5分子對接

計(jì)算機(jī)模擬抑制劑與catk兩個非活性位點(diǎn)對接，進(jìn)一步確證結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合特性。

2.6膠原纖維降解(sem電鏡)

sem電鏡用來觀察膠原纖維在catk干預(yù)前后的區(qū)別。1mg鼠i型膠原纖維和1μm的catk共同孵育在37℃搖床，震蕩過夜。被降解的膠原纖維在sem掃描電鏡(heliosnanolab650fei)下觀察形態(tài)變化。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對選取的7個丹參化合物進(jìn)行組織蛋白酶k活性篩選，組織蛋白酶k抑制劑具有抑制膠原纖維蛋白和彈性纖維蛋白降解活性，z-fr-mca和明膠降解活性是活性位點(diǎn)抑制劑的合成和生理底物，用于初期篩選活性位點(diǎn)抑制劑。

表1丹參中不同化合物的組織蛋白酶k活性

^*二氫丹參酮i和丹參酮iia磺酸鈉分別與odanacatib比較，p＜0.05；^#二氫丹參酮i與丹參酮iia磺酸鈉比較，p＜0.05。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)，丹參酮iia磺酸鈉具有最強(qiáng)的膠原纖維降解活性(ic50為2.7±0.2μm)和彈性纖維降解活性(ic50為6.8±1.4μm)，接近目前臨床效果最佳的，處于iii期臨床研究的組織蛋白酶k抑制劑odanacatib，同時丹參酮iia磺酸鈉不顯示z-fr-mca活性和明膠降解活性(表1和圖1中a-c)，表明丹參酮iia磺酸鈉為非活性位點(diǎn)抑制劑。同時電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)丹參酮iia磺酸鈉抑制了catk對膠原纖維的消化，羥基脯氨酸定量測定驗(yàn)證了該結(jié)果(圖1中d-e)。采用分子對接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參酮iia磺酸鈉與人組織蛋白酶k的結(jié)合，最佳的結(jié)合方式見圖1中f，形成氫鍵結(jié)合位點(diǎn)為met97和glu94，tyr87與磺酸根基團(tuán)結(jié)合。

ii型結(jié)構(gòu)中二氫丹參酮i的膠原纖維降解活性僅次于丹參酮iia磺酸鈉，彈性纖維降解活性與丹參酮iia磺酸鈉無顯著差異，但同時顯示具有一定的z-fr-mca和明膠降解活性，與丹參酮iia磺酸鈉有顯著差異，有可能二氫丹參酮i同時與活性位點(diǎn)和非活性位點(diǎn)結(jié)合。丹參酮i和丹參酮iia的彈性纖維降解活性強(qiáng)于膠原降解活性，顯示一定的z-fr-mca活性。i型結(jié)構(gòu)的丹參新醌d和iii型結(jié)構(gòu)的表丹參隱螺內(nèi)酯膠原纖維降解和彈性纖維降解活性不顯著，且同時顯示一定的z-fr-mca和明膠降解活性。

實(shí)施例2：組織蛋白酶k抑制劑t06對破骨細(xì)胞骨吸收的影響

破骨細(xì)胞表達(dá)豐富的胞漿內(nèi)酶系統(tǒng)，在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化的過程中有一系列的標(biāo)志性蛋白質(zhì)產(chǎn)生，可以作為破骨細(xì)胞的識別及其分化階段的標(biāo)志。其中，分化后的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞所表達(dá)的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase，trap)被認(rèn)為是破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶。本實(shí)驗(yàn)采用骨髓誘導(dǎo)破骨細(xì)胞模型，考察t02，t06對破骨細(xì)胞分化，trap活性的影響。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材與試劑

動物：新生1-2天的同窩sd小鼠5只，雌雄不限，體重7-8g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

丹參酮iia磺酸鈉：使用時以去離子水溶解稀釋；rankl、m-scf購自美國sigma公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1破骨細(xì)胞培養(yǎng)

取新生3天的sd小鼠脛骨，培養(yǎng)基沖洗骨髓腔以收集骨髓細(xì)胞，加入等量ficoll試劑分離骨髓單核細(xì)胞，用含有25ng/mlm-csf、25ng/mlrankl的細(xì)胞因子和10％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3天換液1次，6天后破骨細(xì)胞分化成熟。

2.2破骨細(xì)胞活性研究

(1)破骨細(xì)胞tracp活性；成熟破骨細(xì)胞以1×10⁵/ml接種于96孔板內(nèi)，換加不同濃度t06(0.1,.0.5,1.0,10.0μm)，陰性對照組加不含藥物的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，取移出的培養(yǎng)基20μl，依據(jù)tracp試劑盒分光光度法測定破骨細(xì)胞活性。測定trap的活性，以對硝基苯酚溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，trap活性用每孔的破骨細(xì)胞生成的對硝基苯酚的nmol數(shù)表示。

(2)破骨細(xì)胞活力；細(xì)胞成熟后，以1×10⁵/ml接種于96孔板，提前置入牛股骨骨片，加入具有潛在抑制catk活性的1μmt06。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，取100μl培養(yǎng)基，加入20μlcelltriter-blue試劑，輕輕晃10s混勻，37℃孵育30min，熒光分光光度計(jì)檢測(發(fā)散光波長560nm，吸收光波長590nm)。選擇對細(xì)胞活力沒有毒性的濃度范圍進(jìn)行破骨細(xì)胞活性測試。

(3)破骨細(xì)胞數(shù)目和tracp陽性細(xì)胞數(shù)目；成熟破骨細(xì)胞以1×10⁵/ml接種于96孔板內(nèi)，加入1μmt06的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，提前培養(yǎng)48h后，移出培養(yǎng)基至另一孔板待測tracp活性。依據(jù)tracp染色試劑盒對破骨細(xì)胞細(xì)胞核染色，計(jì)算tracp陽性破骨細(xì)胞數(shù)目。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用骨髓細(xì)胞與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞模型，考察組織蛋白酶k抑制劑對破骨細(xì)胞分化和trap活性的作用，如表2所示。骨髓細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)8天后發(fā)育為成熟的破骨細(xì)胞，經(jīng)1-10μm的t06和10μmt02藥物作用48h后，抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)活性被明顯抑制(p＜0.05)。

表2t06對骨髓源性破骨細(xì)胞的影響(n＝10，)

*p＜0.05，**p＜0.01vscontrol。

丹參酮iia磺酸鈉在1μm時完全抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，圖2中a顯示tracp染色的破骨細(xì)胞和甲苯胺藍(lán)染色的骨吸收陷窩。在對照組中，可以發(fā)現(xiàn)較長和深的骨印跡和骨陷窩，1μmt06組只有較小和淺的骨陷窩，證明1μm丹參酮iia磺酸鈉能顯著減少骨吸收表面。然而，破骨細(xì)胞的代謝活力測定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物對破骨細(xì)胞沒有毒性作用，不能顯著減少tracp染色陽性破骨細(xì)胞的數(shù)目(圖2中b)。圖2中c-d顯示二氫丹參酮i對破骨細(xì)胞代謝活力無顯著影響，對tracp陽性細(xì)胞數(shù)目無顯著影響，但對骨吸收表面面積具有一定的抑制作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明丹參酮iia磺酸鈉是個理想的抗骨吸收藥物。

實(shí)施例3：組織蛋白酶k抑制劑t06對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的影響

1實(shí)驗(yàn)材料

動物：c57bl6小鼠由加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物提供。動物分籠飼養(yǎng)(3～4只/籠)于空調(diào)溫室內(nèi)，溫度21±2℃，濕度40～60％；用顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2實(shí)驗(yàn)方法

動物分組：將雌性c57bl6小鼠30只(18-22g)，按體重隨機(jī)分為3組，每組10只，包括假手術(shù)組(sham，灌胃生理鹽水10ml/kg)，骨質(zhì)疏松模型組(ovx，給生理鹽水10ml/kg)和t06(40mg/kg/d)3個組?；謴?fù)5天后，連續(xù)灌胃給藥12周。

造模方法：手術(shù)臺上異氟烷麻醉，在背部切開兩個0.5cm大小的切口，分離肌肉，剪開后取出雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組切開背部后將不做任何處理，縫合創(chuàng)口，消毒；手術(shù)組將雙側(cè)卵巢結(jié)扎后切除，縫合創(chuàng)口，消毒。

觀察指標(biāo)：

(1)體重：每周稱量小鼠一次體重。

(2)臟器系數(shù)：小鼠處死后，迅速剝離其心、肝、脾、肺、腎和子宮的附屬組織及脂肪，隨即進(jìn)行稱重。臟器系數(shù)公式：臟器系數(shù)＝臟器重量(mg)/體重(g)，對子宮切片觀察。

(3)血清tgf-β，ctx-i和rankl

眼眶取血，置于抗凝劑肝素鈉管中，以3000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，分離血清，凍于-80℃?zhèn)溆?。依?jù)試劑盒方法檢測。

(4)骨密度和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)

小鼠處死后，剝離左側(cè)股骨，剔除骨周圍附屬組織，用生理鹽水擦洗干凈，用錫箔紙包好，-80℃凍存，用于μct檢測骨組織參數(shù)。

(5)行為學(xué)和記憶學(xué)習(xí)能力

小鼠在處死前，進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，高架十字迷宮和水迷宮實(shí)驗(yàn)，用于評價小鼠的一般行為和學(xué)習(xí)記憶能力。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1對體重和主要臟器系數(shù)的影響

如表3所示，造模第一周后，ovx和ovx+t06的體重就顯著高于正常sham組，造模結(jié)束后，去卵巢模型組小鼠體重增加值明顯高于sham組，t06的體重增加量與模型組相比較無顯著性差異。

如圖3中b所示，去卵巢模型組小鼠各主要臟器系數(shù)(心、肝、脾、肺、腎)明顯低于sham組，ovx和ovx+t06相比較主要臟器系數(shù)(心、肝、脾、肺、腎)無顯著性變化。

3.2對子宮的影響

造模12周后，取出子宮稱重，發(fā)現(xiàn)ovx和ovx+t06組的小鼠子宮萎縮，無顯著差異，兩組子宮系數(shù)顯著低于sham組，顯示了t06明顯的子宮增生副作用。

對子宮切片觀察發(fā)現(xiàn)，ovx和ovx+t06組小鼠子宮腔顯著縮小，子宮面積顯著減少，子宮腔上皮細(xì)胞厚度顯著減少。去卵巢后，雌激素缺失導(dǎo)致子宮發(fā)育受阻，出現(xiàn)萎縮，子宮上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得緊密，子宮腔上皮細(xì)胞不明顯，出現(xiàn)斷裂等。

3.3對骨密度和骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)影響

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過μct掃描骨骼后，ovx組股骨和脊椎骨l5段的骨密度(bmd)均顯著降低(p＜0.05)。ovx+t06相比較ovx組，股骨骨密度有顯著改善(p＜0.05)，l5骨密度有一定改善，無顯著差異(圖5)。

表3的結(jié)果顯示，與正常組比較，ovx組顯示，股骨bv/tv比例(bv/tv％)降低48％，骨小梁數(shù)目(tb.n)降低43％，骨小梁厚度(tb.th)降低8％，骨小梁間隙(tb.sp)增大50％，骨連接密度(conn.dn)降低至57％。脊椎骨l5，與股骨相似，bv/tv比例顯著降低(p＜0.001)，骨小梁數(shù)目(tb.n)顯著降低(p＜0.05)，骨小梁間隙(tb.sp)顯著增大(p＜0.05)，骨連接密度(conn.dn)顯著降低(p＜0.01)。

相對于去卵巢模型組(ovx)，ovx+t06的股骨指標(biāo)，bv/tv比例顯著增大(p＜0.001)，骨小梁數(shù)目(tb.n)顯著增多(p＜0.05)，骨小梁厚度增大(p＜0.05)，骨小梁間隙(tb.sp)顯著減小(p＜0.05)，骨連接密度(conn.dn)顯著增大(p＜0.01)。脊椎骨l5段各個指標(biāo)無顯著變化。

表3t06對股骨和脊椎骨l5去卵巢小鼠骨計(jì)量參數(shù)的影響

3.4對血清生化指標(biāo)的影響

rankl參與破骨細(xì)胞形成、分化、融合、生存、激活、成熟的全過程，opg競爭性抑制rankl與前破骨細(xì)胞上的受體rank結(jié)合，opg/rankl比例降低，將抑制骨吸收。ctx-i為i型膠原最終降解產(chǎn)物，直接反映了骨膠原的降解狀態(tài)。圖6結(jié)果顯示，與ovx組比較，ovx+t06中血清rankl(p＜0.001)和磷ctx-i水平顯著降低(p＜0.05)。說明t06具有較強(qiáng)抑制骨吸收作用。

3.5對行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響

三組小鼠進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，5分鐘的總活動距離、平均速度無顯著差異，說明小鼠活動能力基本相同。與sham組比較，小鼠探索內(nèi)部區(qū)域的時間顯著較少(p＜0.01)。高架十字迷宮顯示，三組小鼠在造模前后，在開放手臂和密閉手臂的停留時間和出入次數(shù)均無顯著差異。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，訓(xùn)練2-5天，ovx和ovx+t06小鼠每天尋找到水底平臺所需要的時間減少，但游泳的距離越來越短，說明小鼠獲得了一定的學(xué)習(xí)記憶能力。第6天，ovx和ovx+t06組小鼠通過陰性平臺的次數(shù)和平臺所在區(qū)間的時間均無顯著差異。三種行為模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ovx和ovx+t06均無差異，說明catk抑制劑t06對ovx小鼠學(xué)習(xí)記憶能力并無影響。

結(jié)論

我們通過高通量篩選得到非活性位點(diǎn)抑制劑丹參酮iia磺酸鈉，考察了t02和t06對破骨細(xì)胞骨吸收活性(破骨細(xì)胞生長數(shù)量和trap活性)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抑制劑在體外具有較好的體外抑制骨吸收作用。同時，我們采用去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型來考察抗骨質(zhì)疏松作用，結(jié)果該化合物對雌激素缺失骨質(zhì)疏松具有較好的活性，且對小鼠體重和各器官系數(shù)無影響，對子宮系數(shù)和切片研究發(fā)現(xiàn)無雌激素樣作用，未發(fā)現(xiàn)像雌激素治療法導(dǎo)致體重降低、子宮增生等副作用，未出現(xiàn)catk缺失導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力缺失的副作用。因此，我們相信非活性位點(diǎn)抑制劑丹參酮iia磺酸鈉具有進(jìn)一步開發(fā)為抗骨質(zhì)疏松藥物的潛力和應(yīng)用前景。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。