本發(fā)明涉及川陳皮素的新用途，尤其涉及川陳皮素在預防或治療心衰藥物中的應用。

背景技術(shù)：

慢性心衰(chronicheartfailure)是指心臟功能異常導致心臟泵血量不能滿足代謝需要的一種病理生理狀態(tài)，病因有心臟負荷過重、心肌舒張受限致、感染病毒和貧血等。慢性心衰伴隨著心肌重構(gòu)的發(fā)生，心肌重構(gòu)是導致心衰的基本基制。

川陳皮素來源于蕓香科川橘，主要由醇提、萃取、層析、結(jié)晶等工序獲得。川陳皮素具有的藥效作用有：抗細胞凝集、抗血栓形成、抗癌、抗真菌、抗炎、抗過敏、抗膽堿脂酶和抗癲癇，同時川陳皮素還是碳水化合物代謝的促進劑。

現(xiàn)有的慢性心衰治療藥物多種多樣，有利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和地高辛等；但未見報道，川陳皮素具有治療慢性心衰的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種川陳皮素在預防或治療心衰藥物中的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：川陳皮素在預防或治療心衰藥物中的應用。

作為上述技術(shù)方案的改進，所述川陳皮素預防或逆轉(zhuǎn)慢性心衰缺血后的心肌重構(gòu)。

作為上述技術(shù)方案進一步地改進，所述心衰為慢性心衰。

優(yōu)選地，所述心肌重構(gòu)包括心室收縮末期內(nèi)徑的增大，心室射血分數(shù)和心室短軸縮短率的降低，心肌梗死面積的增大以及心肌細胞存活率的降低。

另外，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括川陳皮素和藥學上可接受的載體。

作為上述技術(shù)方案的改進，所述藥物的劑型是注射液或凍干制劑。

在上述技術(shù)方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以為多種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液劑(例如可注射和可輸注溶液劑)、分散劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于預定的給藥方式和治療應用。典型的優(yōu)選組合物為可注射或可輸注溶液劑形式。優(yōu)選的給藥方式是胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))給藥。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物通過腹膜注射給予。還可將輔助性活性化合物摻入到組合物中。

在上述技術(shù)方案中，“藥學上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。藥學上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一個或多個以及它們的組合。在很多情況下，優(yōu)選的是將等滲劑例如糖、多元醇或氯化鈉包括在組合物中。藥學上可接受的載體還可包含少量的能提高抗體或抗體部分的貨架期或有效性的輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。

另外，本發(fā)明還提供所述藥物組合物在預防或治療心衰的應用。

作為上述技術(shù)方案的改進，所述藥物組合物預防或逆轉(zhuǎn)慢性心衰缺血后的心肌重構(gòu)。

作為上述技術(shù)方案進一步地改進，所述心衰為慢性心衰。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供川陳皮素在預防或治療心衰藥物中的應用，本發(fā)明通過構(gòu)建心肌缺血模型和心肌細胞氧葡萄糖剝奪實驗來證實川陳皮素逆轉(zhuǎn)缺血后的心肌重構(gòu)：逆轉(zhuǎn)心室收縮末期內(nèi)徑的增大，逆轉(zhuǎn)心室射血分數(shù)和心室短軸縮短率的降低，降低心肌梗死的面積以及激活心肌細胞存活，川陳皮素具有治療慢性心衰的作用；川陳皮素可以作為治療慢性心衰的藥物。

附圖說明

圖1顯示本發(fā)明實施例1中大鼠結(jié)扎前的冠狀動脈左前降支；

圖2顯示本發(fā)明實施例1中大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎后心電圖ⅱ導聯(lián)出現(xiàn)st段抬高；

圖3為顯示本發(fā)明實施例1中大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎后遠端心肌組織變灰白；

圖4為本發(fā)明實施例1中的超聲心動圖；

圖5為本發(fā)明實施例1中左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率的柱狀圖；圖5a為左室射血分數(shù)的柱狀圖，圖5b為左室短軸縮短率的柱狀圖；其中，ns表示p>0.05，*表示p<0.05，***表示p<0.001；

圖6為本發(fā)明實施例1中左室收縮末期內(nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑的柱狀圖；圖6a為左室收縮末期內(nèi)徑的柱狀圖，圖6b為左室舒張末期內(nèi)徑的柱狀圖；其中，ns表示p>0.05，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；

圖7為本發(fā)明實施例2中大鼠心肌的ttc染色圖；

圖8為本發(fā)明實施例2中大鼠心肌梗死面積百分數(shù)的柱狀圖；其中，**表示p<0.01，***表示p<0.001；

圖9為本發(fā)明實施例3中心肌細胞氧葡萄糖剝奪實驗的散點圖；其中，橫坐標為annexinv標記的綠熒光,縱坐標為pi標記的紅熒光，propidiumiodide為碘化丙錠；nob-5um表示該實驗組中川陳皮素加入的濃度為5um，nob-10um表示該實驗組中川陳皮素加入的濃度為10um，nob-20um表示該實驗組中川陳皮素加入的濃度為20um，nob-40um表示該實驗組中川陳皮素加入的濃度為40um，nob-80um表示該實驗組中川陳皮素加入的濃度為80um，以下類同；

圖10為本發(fā)明實施例3中心肌細胞氧葡萄糖剝奪實驗的統(tǒng)計圖；其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具體實施方式

為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例、附表和附圖對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1川陳皮素對心室的影響

將60只sd大鼠隨機分為6組：①假手術(shù)組(sham)n＝10(大鼠冠狀動脈左前降支只穿線，不結(jié)扎，0.5％吐溫生理鹽水溶液腹腔注射)；②梗死組(ami)n＝10(大鼠冠狀動脈左前降支進行結(jié)扎后，0.5％吐溫生理鹽水溶液腹腔注射)；③川陳皮素低劑量組(ami+nob-l)n＝10(大鼠冠狀動脈左前降支進行結(jié)扎后，川陳皮素7.5mg/kg腹腔注射)；④川陳皮素中劑量組(ami+nob-m)n＝10(大鼠冠狀動脈左前降支進行結(jié)扎后，川陳皮素15mg/kg腹腔注射)；⑤川陳皮素高劑量組(ami+nob-h)n＝10(大鼠冠狀動脈左前降支進行結(jié)扎后，川陳皮素30mg/kg腹腔注射)；⑥依那普利組(ami+enalapril)n＝10(大鼠冠狀動脈左前降支進行結(jié)扎后，依那普利10mg/kg灌胃)；21d實驗結(jié)束后，行超聲心動圖檢查心臟功能。

1.大鼠心肌缺血模型建立

將實驗用雄性sd大鼠稱重，用10％水合氯醛，按(300mg/kg)劑量腹腔注射麻醉。將動物仰臥，固定于實驗臺上，連上心電圖儀，用ⅱ導聯(lián)記錄心電圖。然后進行氣管插管，連接小動物呼吸機，正壓通氣，設置頻率為70次/min，呼吸氣時比為5：4，潮氣量約15ml/kg。于左胸第3～4肋間消毒、切開皮膚，鈍性分離肌層，開胸，剪開心包，暴露心臟左心室和左心耳，可見左心室冠狀動脈自左心耳緣中部向下走行于左心室前壁(見圖1)。在左心耳與肺動脈圓錐間，以左冠狀動脈主干為標志，用6-0號縫線針穿刺結(jié)扎冠狀動脈左前降支。觀察心電圖，以心電圖ⅱ導聯(lián)出現(xiàn)st段抬高(見圖2)及肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域以下組織變灰白等心肌缺血表現(xiàn)確定為結(jié)扎成功的指標(見圖3)。假手術(shù)組(sham)除不結(jié)扎冠狀動脈外，其余操作相同。

2.超聲心動圖檢查

實驗結(jié)束前一天進行m型超聲心動圖檢測。采用加拿大visualsonics產(chǎn)的vevo2100高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)(rmv707b探頭，頻率設置為23mhz或30mhz，探測深度為10～15mm)和連接15l8高頻探頭西門子超聲儀(contrastpulsesequencingtm，sequoia512，siemens，germany)。大鼠在2％異氟烷吸入麻醉下仰臥位固定于37℃恒溫加熱板上，四肢與心電圖電極相連用于監(jiān)測心率并記錄ecg心電圖。左胸前化學脫毛膏脫毛以減少超聲干擾，在胸廓表面涂抹超聲波導聲劑以優(yōu)化心腔環(huán)境，進行超聲檢測。m型超聲心動圖的測量：探頭置于小鼠胸骨前，獲取胸骨旁長軸、短軸視野。左室短軸切面，于乳頭肌水平應用m型超聲記錄左心室運動曲線，測量左室舒張末期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimension，diastolic；lvidd)和左室收縮末期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimension，systolic；lvids)，通過最大和最小橫截面積和厚度計算左室舒張末容積(leftventricularend-systolicvolumes，lvesv)和左室收縮末容積(leftventricularend-diastolicvolumeslvedv)，左室射血分數(shù)(leftventricularejectionfraction，lvef)、左室短軸縮短率(fractionalshortening，lvfs)。相關(guān)計算公式如下：

lvef(％)＝(lvedv-lvesv)/lvedv×100％

lvfs(％)＝[(lvidd-lvids)/lvidd]×100％

如圖4～6所示，梗死組相對假手術(shù)組而言，左室射血分數(shù)及短軸縮短率明顯下降、左室舒張末期內(nèi)徑和左室收縮末期內(nèi)徑增大；川陳皮素中、高劑量組以及依那普利組相對梗死組而言，能顯著性提高左室射血分數(shù)及短軸縮短率、降低左室收縮末期內(nèi)徑增大的幅度，降低左室舒張末期內(nèi)徑增大幅度的效果不顯著；說明川陳皮素主要改善其心肌收縮功能。

實施例2ttc染色法測定大鼠心肌梗死面積

正常心肌細胞含有脫氫酶，在nadh存在的條件下，能將無色的氧化型染料氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride，簡稱ttc)還原成紅色的ttc，而使活體心肌染色。心肌梗死一定時間后，細胞中脫氫酶因細胞膜損傷而釋放丟失，不能再使ttc還原染色，故梗死的心肌不能被染色。因此可把不被染色的梗死區(qū)與染色的正常心肌分離，用稱量法或平面切片的面積求積法估計心肌梗死范圍。計算公式為：心肌梗死面積(％)＝∑(每片梗死心肌面積/該片心肌面積×該片心肌重量)/左心室重量×100％。

大鼠完成實施例1中行超聲心動圖檢查心臟功能后被處死，取心臟，做ttc染色，檢測心肌的梗死面積，具體操作如下：

1)取材：用1％戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，將下腔靜脈剪斷，從主動脈弓灌洗心臟，迅速取出心臟，用冷的pbs將殘留的血液沖洗干凈；

2)修剪心臟：沿冠狀溝切除心房和右心室，留下左心室稱重，記錄；

3)切片：將左心室置于-20℃冰箱速凍20min左右，待組織稍變硬后將左心室自心尖至心底部橫切成4片，每片厚1～2mm。每片稱重，并記錄；

4)染色：將心臟切片置于用棕色瓶盛裝的預熱至37℃的1％ttc磷酸鹽緩沖液(ph＝7.4，重復用兩次)中，37℃孵箱中避光孵育15min。不時翻動瓶子使心肌組織均勻接觸到染色液。待染色結(jié)束后梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，非梗死區(qū)呈深紅色；

5)固定：將染色后的心肌切片置于4％多聚甲醛中固定30min；

6)拍照：用佳能數(shù)碼相機拍照，將心肌組織由心底向心尖排列好后進行數(shù)碼拍照

7)結(jié)果分析：運用image-proplus圖像分析軟件測量不同染色區(qū)的面積。心肌梗死的程度以梗死區(qū)重量(呈現(xiàn)白色的部分)與左心室的重量的百分比表示。

圖7的原圖為彩色圖，彩色圖中能清晰顯示心肌梗死染色后呈現(xiàn)出的白色，梗死組相對假手術(shù)組而言，心肌梗死呈現(xiàn)白色的面積比較大；川陳皮素劑量組以及依那普利組相對梗死組而言，心肌梗死呈現(xiàn)白色的面積比較小。圖8中量化了大鼠心肌梗死面積百分數(shù)，梗死組相對假手術(shù)組而言，心肌梗死面積百分數(shù)比較大；川陳皮素劑量組以及依那普利組相對梗死組而言，心肌梗死面積百分數(shù)比較小。

綜合實施例1和2中的實驗，依那普利組(enalapril)為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，是一種治療慢性心衰的藥物；川陳皮素中劑量組(ami+nob-m)與依那普利組(ami+enalapril)具有相近治療慢性心衰的效果。

實施例3川陳皮素對氧葡萄糖剝奪后心肌細胞存活的影響

體外采用h9c2心肌細胞氧葡萄糖剝奪實驗模擬心肌缺血模型。氧葡萄糖剝奪實驗：細胞生長至80％～90％密度時，進行氧葡萄糖剝奪處理。將細胞取出后，先棄去原有的培養(yǎng)基，用無糖ebss培養(yǎng)基清洗細胞3遍，再加入適量無糖ebss培養(yǎng)基，放置于37℃三氣缺氧(n2：co2：o2＝94％：5％：1％)培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧孵育至預定時間。

annexv/pi雙染檢測細胞凋亡率

實驗結(jié)束后各組細胞采用0.25％胰消化酶消化并收集細胞，用異硫氰酸熒光素(fitc)標記的連接素(annexinv-fitc)和pi雙染(按照annexinv-fitc試劑盒說明書進行)。立即在488nm的激發(fā)波長下，用流式細胞儀檢測1×10⁴個細胞。pi發(fā)射熒光約623nm(紅色熒光)，fitc發(fā)射熒光約520nm(綠色熒光)，用cellqest軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到散點圖(見圖9)和統(tǒng)計結(jié)果圖(見圖10)。

如圖9和圖10所示，結(jié)果顯示川陳皮素明顯改善氧葡萄糖剝奪引起的心肌細胞凋亡，呈劑量依賴性。

最后所應當說明的是，以上實施例用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。