本發(fā)明屬于靜電紡絲復(fù)合納米纖維的制備領(lǐng)域，具體涉及一種絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的制備方法。

背景技術(shù)：

絲素蛋白是由蠶繭脫膠而來(lái)，是一種天然的蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透氣、無(wú)免疫原性等優(yōu)異的性能，被廣泛的應(yīng)用于皮膚、骨、軟骨、肌腱、神經(jīng)導(dǎo)管等組織的修復(fù)和再生。

采用靜電紡絲技術(shù)制備出的支架材料能夠有效的仿生人體細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)，能夠有效的解決材料的生物相容性，調(diào)控生物信號(hào)的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞和組織生長(zhǎng)，促進(jìn)機(jī)體再生與修復(fù)。

石墨烯是一種具有單層碳原子緊密堆積而成的二維蜂窩晶格結(jié)構(gòu)的碳材料，具有高模量、高強(qiáng)度高、良好的導(dǎo)電性等優(yōu)點(diǎn)，而且石墨烯具有較大的比表面積以及良好的生物相容性，使之可以應(yīng)用于生物醫(yī)用領(lǐng)域，且有研究表明石墨烯能夠促進(jìn)各種神經(jīng)種子細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。許多研究將石墨烯或是氧化石墨烯對(duì)絲素蛋白進(jìn)行改性，如專利申請(qǐng)?zhí)朿n201610806923.5：基于氧化石墨烯復(fù)合納米纖維組織工程支架的制備方法，氧化石墨烯的加入雖然能夠使復(fù)合膜力學(xué)性能得到了良好的改善，但是此復(fù)合支架材料導(dǎo)電性較低，神經(jīng)元之間電化學(xué)信號(hào)較弱，不能夠良好的促進(jìn)細(xì)胞的增殖；專利申請(qǐng)?zhí)朿n201510106514.x:一種絲素/石墨烯導(dǎo)電纖維的制備方法，采用部分還原的氧化石墨烯對(duì)絲素蛋白進(jìn)行改性，雖然能夠有效的解決了石墨烯易團(tuán)聚問(wèn)題，有效的改善了絲素蛋白的性能，但是與石墨烯的性能相比還存在一定的差距，主要是用量小而且分散性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的制備方法，該制備方法簡(jiǎn)單易行，原材料資源豐富，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；制得的絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料具有良好的生物相容性、良好的機(jī)械性能，并且通過(guò)加入不同含量的石墨烯，得到了不同性能的復(fù)合納米纖維，滿足不同的組織工程支架的需要。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

1)制備絲素蛋白樣品；

2)將石墨烯乙醇分散液進(jìn)行高速離心，獲得石墨烯；

3)將步驟1)得到的絲素蛋白加入到六氟異丙醇中，攪拌使之完全溶解，得到溶液a；

4)將步驟2)得到的石墨烯用六氟異丙醇轉(zhuǎn)移到溶液a中，超聲分散得到溶液b，其中，溶液b中絲素蛋白的濃度為0.04～0.08g/ml，石墨烯與絲素蛋白的質(zhì)量比1:400～1:100；

5)將溶液b轉(zhuǎn)移至注射器中，通過(guò)調(diào)控靜電紡絲工藝參數(shù)進(jìn)行靜電紡絲，控制電壓8～16kv，接收距離為10～15cm，紡絲速率為0.05～0.2mm/min，接收輥輥速100r/min，紡絲針頭為21號(hào)；

6)將制得的靜電紡絲薄膜放置于無(wú)水乙醇中后處理4h，自然干燥，干燥后儲(chǔ)存在干燥器中，獲得絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料。

上述方案中，步驟1)中制備絲素蛋白樣品的具體步驟為：

1)將蠶絲放入質(zhì)量濃度為0.5％的na2co3的水溶液中煮沸并恒溫2h，除去蠶絲表面的絲膠，取出蠶絲并用去離子水洗滌，置于50℃烘箱中干燥；

2)將干燥后的蠶絲加入到摩爾比為1:8:2的氯化鈣、無(wú)水乙醇和水的70℃三元混合溶液，溶解成絲素蛋白溶液，經(jīng)過(guò)去離子水透析72h除去溶液中的乙醇和氯化鈣，制得絲素蛋白水溶液，再經(jīng)過(guò)-80℃冷凍干燥制得純的絲素蛋白樣品。

上述方案中，步驟1)中所述的蠶絲是桑蠶絲、天蠶絲或蓖麻蠶絲中的一種或是兩種以上任意比例的混合；其用量為nɑ2co3水溶液總質(zhì)量的2～15％。

上述方案中，步驟2)中所述的蠶絲質(zhì)量為三元混合溶液質(zhì)量的5～10％。

上述方案中，步驟2)中石墨烯乙醇分散液濃度為1mg/ml。

上述方案中，步驟3)中溶液a中絲素蛋白的濃度為0.08g/ml。

上述方案中，步驟4)中超聲分散溫度為20～35℃，超聲時(shí)間為2～4h。

上述方案中，步驟5)中21號(hào)紡絲針頭口徑為0.5mm。

上述方案中，所述絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的纖維平均直徑為80-300nm。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基于靜電紡絲法，制備出微納米數(shù)量級(jí)的復(fù)合纖維，使這種絲素蛋白具有良好的生物相容性，同時(shí)又具備石墨烯優(yōu)良的生物活性、力學(xué)機(jī)械性能，可以應(yīng)用于皮膚、軟骨、神經(jīng)導(dǎo)管等組織再生、修復(fù)領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1得到產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

圖2為實(shí)施例2得到產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

圖3為實(shí)施例3得到產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

圖4為絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的拉曼光譜圖。其中a、b、c分別代表實(shí)施例1、2、3產(chǎn)物的拉曼光譜圖，說(shuō)明石墨烯成功的復(fù)合在絲素蛋白纖維中。

圖5為雪旺細(xì)胞在絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料增殖情況。其中a、b、c分別代表實(shí)施例1、2、3產(chǎn)物的在培養(yǎng)時(shí)間分別為1、3、5天的od值，說(shuō)明石墨烯含量的增加能夠有效的促進(jìn)雪旺細(xì)胞在絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的增殖。

圖6、圖7、圖8分別為雪旺細(xì)胞在實(shí)施例1、2、3得到產(chǎn)物上的粘附掃描電鏡圖。說(shuō)明石墨烯含量的增加能夠有效的促進(jìn)雪旺細(xì)胞在絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的增殖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的制備方法，所述方法包括如下步驟：

先將30g蠶繭加入到1l0.5％nɑ2co3水溶液中，煮沸40min并恒溫2h，重復(fù)處理三次，用去離子水充分洗凈，洗凈后置于50℃干燥箱中恒溫烘干，得到脫膠后的蠶絲。將干燥后的蠶絲加入到摩爾比為1:8:2的氯化鈣、無(wú)水乙醇和水的70℃三元混合溶液，溶解成絲素蛋白溶液，經(jīng)過(guò)去離子水透析72h除去溶液中的乙醇和氯化鈣，制得絲素蛋白水溶液，再經(jīng)過(guò)-80℃冷凍干燥制得純的絲素蛋白樣品。

將0.32g絲素蛋白溶于4ml六氟異丙醇中，攪拌至完全溶解，得到0.08g/ml的絲素蛋白液a，用移液槍取800μl石墨烯乙醇分散液高速離心，吸出乙醇，用六氟異丙醇將離心管內(nèi)的石墨烯轉(zhuǎn)移到絲素蛋白液中，并加入一定量的六氟異丙醇使絲素蛋白液體積至6ml，超聲60min，最終得到石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量比為1:400的溶液b，溶液b中絲素蛋白的濃度為0.06g/ml。

將所述的紡絲液注入10ml注射器中進(jìn)行靜電紡絲，工藝條件為：紡絲電壓16kv，推速0.05mm/min，接收距離12cm，輥速100r/min。將所得的靜電紡絲膜用無(wú)水乙醇處理4h，隨后置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，獲得絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料。

通過(guò)本發(fā)明的上述方法制備的絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料，纖維平均直徑為280nm。

實(shí)施例2

稱取按照實(shí)施例1中制備的絲素蛋白0.32g溶于4ml六氟異丙醇中，攪拌至完全溶解，得到0.08g/ml的絲素蛋白液a，用移液槍取1.6ml石墨烯乙醇分散液高速離心，吸出乙醇，用六氟異丙醇將離心管內(nèi)的石墨烯轉(zhuǎn)移到絲素蛋白液中，并加入一定量的六氟異丙醇使絲素蛋白液至6ml，超聲60min，最終得到石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量比為1:200的0.06g/ml絲素蛋白紡絲液b，將所述的紡絲液注入10ml注射器中進(jìn)行靜電紡絲，工藝條件為：紡絲電壓16kv，推速0.05mm/min，接收距離12cm，輥速100r/min。將所得的靜電紡絲膜用無(wú)水乙醇處理4h，隨后置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，獲得絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料。

通過(guò)本發(fā)明的上述方法制備的絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料，纖維平均直徑為110nm。

實(shí)施例3

稱取按照實(shí)施例1中制備的絲素蛋白0.32g溶于4ml六氟異丙醇中，攪拌至完全溶解，得到0.08g/ml的絲素蛋白液a，用移液槍取3.2ml石墨烯乙醇分散液高速離心，吸出乙醇，用六氟異丙醇將離心管內(nèi)的石墨烯轉(zhuǎn)移到絲素蛋白液中，并加入一定量的六氟異丙醇使絲素蛋白液至6ml，超聲60min，最終得到石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量比為1:100的0.06g/ml絲素蛋白紡絲液b，將所述的紡絲液注入10ml注射器中進(jìn)行靜電紡絲，工藝條件為：紡絲電壓16kv，推速0.05mm/min，接收距離12cm，輥速100r/min。將所得的靜電紡絲膜用無(wú)水乙醇處理4h，隨后置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，獲得絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料。

通過(guò)本發(fā)明的上述方法制備的絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料，纖維平均直徑為90nm。

表1為絲素蛋白/石墨烯復(fù)合納米纖維支架材料的機(jī)械力學(xué)性能數(shù)據(jù)。其中a、b、c分別代表實(shí)施例1、2、3產(chǎn)物樣品，說(shuō)明石墨烯含量的增加能夠有效的改善絲素蛋白的機(jī)械力學(xué)性能。

對(duì)比例1

本對(duì)比例和實(shí)施例1大致相同，不同的是改變了石墨烯的含量，使石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量比分別1:600并進(jìn)行力學(xué)性能和導(dǎo)電性的對(duì)比，結(jié)果如表1所示。

對(duì)比例2

本對(duì)比例和實(shí)施例1大致相同，不同的是改變了石墨烯的含量，使石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量比分別1:50并進(jìn)行力學(xué)性能和導(dǎo)電性的對(duì)比，結(jié)果如表1所示。

表1

由上表力學(xué)性能以及導(dǎo)電性數(shù)據(jù)可知，當(dāng)石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量比在1：400～1:100范圍內(nèi)，隨著石墨烯含量的增加絲素蛋白/石墨烯復(fù)合纖維支架材料的力學(xué)性能以及導(dǎo)電性能逐漸增強(qiáng)。對(duì)比例1制備出的復(fù)合纖維支架材料的力學(xué)性能以及導(dǎo)電性能與實(shí)施例相比均較小，難以滿足組織工程支架的要求；對(duì)比例2雖然制備出了導(dǎo)電性良好的復(fù)合纖維支架材料，但是其機(jī)械力學(xué)性能與實(shí)施例3相比有所降低，甚至其力學(xué)性能比實(shí)施例2較差，說(shuō)明當(dāng)石墨烯含量過(guò)高時(shí)，復(fù)合纖維支架材料的力學(xué)性能亦難滿足組織工程支架的要求。

對(duì)比例3

與申請(qǐng)?zhí)朿n201610806923.5：基于氧化石墨烯復(fù)合納米纖維組織工程支架的制備方法相在機(jī)械力學(xué)性能上進(jìn)行比較，對(duì)比專利采用靜電紡絲技術(shù)制備氧化石墨烯/絲素蛋白復(fù)合支架材料，與本專利較為類似。當(dāng)氧化石墨烯濃度由0.5mg/ml增大1mg/ml時(shí)，其復(fù)合纖維膜斷裂強(qiáng)度增加10％左右，然而本實(shí)例中同樣的將石墨烯濃度增大到2倍，即當(dāng)石墨烯濃度由0.13mg/ml增大到0.26mg/ml時(shí)其斷裂強(qiáng)度增加了22％；當(dāng)氧化石墨烯濃度由0.5mg/ml增大到2mg/ml時(shí)，其復(fù)合纖維膜力學(xué)性能有所降低，然而本實(shí)例中同樣的將石墨烯濃度增大到4倍，即當(dāng)石墨烯濃度由0.13mg/ml增大到0.52mg/ml時(shí)，其斷裂強(qiáng)度則增加了35％；說(shuō)明石墨烯在改善絲素蛋白機(jī)械力學(xué)性能方面相對(duì)于氧化石墨烯更有優(yōu)勢(shì)。

對(duì)比例4

與cn201510106514.x：一種絲素/石墨烯導(dǎo)電纖維的制備方法在機(jī)械力學(xué)性能以及導(dǎo)電性能上進(jìn)行比較，對(duì)比專利采用靜電紡絲技術(shù)制備部分還原氧化石墨烯/絲素蛋白復(fù)合支架材料，與本專利較為類似。當(dāng)部分還原氧化石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1:50時(shí)，其斷裂強(qiáng)度為2.7mpa左右，其導(dǎo)電率大約為7.0ms/cm；本實(shí)施例中當(dāng)石墨烯與絲素蛋白質(zhì)量比為1:100時(shí)，其斷裂強(qiáng)度為3.1mpa，其導(dǎo)電率為11.68ms/cm，較少比例含量的石墨烯在力學(xué)性能以及導(dǎo)電性能就要強(qiáng)于部分還原氧化石墨烯，說(shuō)明石墨烯相對(duì)與氧化石墨烯更具有較強(qiáng)的力學(xué)性能和導(dǎo)電性能。