本發(fā)明涉及中藥組合物領域，具體涉及一種用于治療結直腸癌前病變的中藥組合物及其藥物制劑。

背景技術：

隨我國結直腸癌(colorectalcancer,crc)發(fā)病率迅速上升，嚴重威脅民眾健康。一項大型臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，結直腸癌的發(fā)病率已躍升至女性惡性腫瘤發(fā)病率第四位、男性第五位。結直腸癌的發(fā)生是由遺傳和環(huán)境等諸多因素相互作用所致，涉及多基因、多階段的復雜過程。腸黏膜上皮經(jīng)歷了“無上皮內(nèi)瘤變—不確定上皮內(nèi)瘤變—低級別上皮內(nèi)瘤變—高級別上皮內(nèi)瘤變—癌”的癌變過程，是長期的、漸進的、由量變到質變的過程，結直腸癌前病變階段，是預防結直腸癌發(fā)生的重要時機，有效治療結直腸癌前病變已經(jīng)成為結直腸癌二級預防的重要課題。

結直腸癌前病變是一個連續(xù)的過程，其指病變處于細胞再生與腫瘤之間的交界狀態(tài)，是病理學定義。癌前病變第4版who指南(2012年)明確指出將“上皮內(nèi)瘤變”一詞包含所有浸潤性癌的癌前病變，不論其是否存在傳統(tǒng)腫瘤的形態(tài)學特點，結直腸癌前病變包括錯構瘤相關性異型增生、炎性腸病相關性異型增生(包括絨毛狀粘液增多性異型增生、腺瘤性異型增生、鋸齒狀異型增生)、無蒂鋸齒狀息肉/腺瘤(不伴異型增生或伴異型增生)、腺瘤(包括傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤和普通型腺瘤)等。有資料顯示80％以上的結直腸癌系由結直腸腺瘤演變而來，多發(fā)性腺瘤的癌變率可達14％-40％。是結直腸癌發(fā)生前重要的臨床過程。

祖國學上并無明確的“結直腸癌前疾病”、“結直腸癌前病變”對應的病名，但根據(jù)其臨床癥狀，常常歸于“痢疾”、“泄瀉”、“腹痛”、“便秘”范疇。腸腑乃傳導之府，主津液代謝、傳導糟粕。機體代謝紊亂，氣血運行不暢，易生痰濕，腸腑亦是痰濕聚集之地?！峨s病源流犀燭·泄瀉源流》中云：“濕盛則飧泄，乃獨由于濕耳？不知風寒熱虛，雖皆能為病，茍脾強無濕，四者均不得而干之，何自成瀉？是泄雖有風寒熱虛之不同，要未有不原于濕者也?！辈C的關鍵在于濕邪偏勝。濕熱侵襲腸腑，導致氣機不暢，津液停滯，痰濁內(nèi)生。《明醫(yī)雜著·痰飲》所曰：“痰屬濕熱乃津液所化。”痰由水濕津液停聚凝結而成,質地稠厚者為痰。痰濁內(nèi)伏，黏滯膠著，逐步構成腸腑內(nèi)環(huán)境的重要物質基礎。痰濁為有形之邪，在體內(nèi)隨氣升降，無處不到。痰停聚腸腑，則腑氣不降，導致大便傳導功能失常。痰邪久作，存何變異？其致病可阻滯氣血運行、影響水液代謝，致病廣泛、變化多端。明·皇甫中《明醫(yī)指掌·痢疾》云“痢之作也，非一朝一夕之故……蓋平素飲食不節(jié)，將息失宜，油膩生冷恣供口腹，醉之以酒……以致氣血俱傷，飲食停積，濕熱熏蒸，化為穢濁……臟不受病而病其腑，故大腸受之?！薄鹅`樞·刺節(jié)真邪篇》云：“有所節(jié)，氣歸之，衛(wèi)氣留之，不得反，津液久留，合而為腸瘤”。津液流結便是痰濁，津結痰凝即為瘤。“痰”逐漸蓄積、黏滯膠著、穢濁腐敗、存毒變異，形成“痰毒”(癌前病變)?！疤刀尽彪m可經(jīng)手術方法祛除，但是腸腔內(nèi)環(huán)境尚未改善，痰濁再次蓄積，導致“痰毒”反復發(fā)作，進而形成“痰結”(癌)。由此可見，痰濁內(nèi)蘊是結直腸癌前病變的腸腔內(nèi)環(huán)境改變的表現(xiàn)，是結直腸癌前病變發(fā)生的重要物質基礎，痰邪蘊久導致腸毒積聚是結直腸癌前病變的主要病機。

在治療學方面，目前尚未形成一套理想的治療方案。西醫(yī)仍然以腸鏡下摘除為主要治療手段。但是，即使手術摘除腺瘤后，仍有30％以上患者將會長出新的腺瘤，對長期穩(wěn)定的治療并無積極的預防作用，且沒能解決此病反復復發(fā)、癌變率高的臨床難題。

中醫(yī)藥在治療結直腸癌前病變方面具有一定的優(yōu)越性，不僅可以多途徑、多靶點調(diào)節(jié)結直腸癌前病變患者的炎癥因子水平，并有改善預后、治療復發(fā)的作用，而且副作用小，無藥物依賴性，安全性較好。目前尚無文獻報道用于治療該類疾病，并且副作用小、不易復發(fā)的中藥組合物及其藥物制劑。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種副作用小、不易復發(fā)的治療結直腸癌前病變的中藥組合物及其藥物制劑，以及該中藥組合物或藥物制劑在制備預防或治療結直腸癌前病變藥物或保健食品中的應用。

發(fā)明人在長期的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，由法半夏、制南星、生大黃、重樓、黃連等藥物組成的中藥組合物重在清化痰濁、通腑排毒，可明顯改善結直腸癌前病變的臨床癥狀，降低炎癥因子水平，并改善預后。進一步研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組方可以通過多途徑、多靶點改善炎癥分子水平，逆轉結直腸腸黏膜癌變進程。臨床應用于治療結直腸癌前病變，尤其是痰濕型結直腸癌前病變具有良好的療效。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種預防或治療結直腸癌前病變的中藥組合物，該中藥組合物是由如下重量份的原料藥組成：

法半夏5-15份，生大黃3-9份，制南星5-15份，重樓10-30份，黃連3-15份。

進一步，本發(fā)明的優(yōu)選的中藥組合物是由如下重量份的原料藥組成：法半夏10份，生大黃3份，制南星10份，重樓15份，黃連6份。

在該中藥組合物中，法半夏和生大黃共為君藥，制南星為臣藥，重樓和黃連共為佐藥。

本發(fā)明的第二方面，提供了以上述預防或治療結直腸癌前病變的中藥組合物作為活性成份的藥物制劑，該藥物制劑是采用本領域常規(guī)制備方法制備成藥劑學上的常用劑型。

該治療結直腸癌前病變作為活性成分的藥物制劑是顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、膠囊劑、口服液或滴丸劑。

進一步，本發(fā)明的藥物制劑可用以下方法制備得到：

(a)稱取各藥材組份，混合后在容器內(nèi)浸泡2小時以上，常壓煎煮，濾出藥液，得到中藥組合物的水提取物；

(b)在水提取物中加入藥學上可接受的載體，采用本領域常規(guī)制備方法制得。

本發(fā)明的第三方面，是提供了上述的中藥組合物和藥物制劑在制備預防或治療結直腸癌前病變藥物或保健食品中的應用。

本發(fā)明的給藥量是治療有效量，例如每天約2克/千克體-約5.5克/千克體重，較佳的劑量是約3克/千克體重-約4克/千克體重。一般用藥時間為6-24月，較佳的為6-18月，更佳的為12-18月。當然，用藥時間還要考慮給藥途徑、病人健康狀況，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

此外，本發(fā)明的中藥組合物可以作為唯一活性成份用于預防或治療結直腸癌前病變，也還可與其他治療劑一起使用，其他治療劑如柳氮磺胺吡啶、拜阿司匹林等。

本發(fā)明所述的結直腸癌前病變是現(xiàn)代醫(yī)學病名，是病理學分期，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、便秘、痢疾、慢性腹痛、體重減輕等，并可進一步誘導結直腸癌的發(fā)生等。祖國醫(yī)學上并無明確的“結直腸癌前疾病”、“結直腸癌前病變”對應的病名，但根據(jù)其臨床癥狀，常常歸于“痢疾”、“泄瀉”、“腹痛”、“便秘”范疇。其病位在腸，其病因病機復雜。

歷代醫(yī)家認為“痰”既是津液代謝的病理產(chǎn)物，又是致病因素。痰濁是機體代謝紊亂的產(chǎn)物，內(nèi)生痰濁，蘊積成毒，機體內(nèi)的代謝產(chǎn)物不能及時排出，進一步損害人體臟腑經(jīng)絡及氣血陰陽。痰濁內(nèi)蘊是結直腸癌前病變的腸腔內(nèi)環(huán)境改變的表現(xiàn)，是結直腸癌前病變發(fā)生的重要物質基礎，痰邪蘊久導致腸毒積聚是結直腸癌前病變的主要病機。本發(fā)明以此原則為依據(jù)，制備的中藥組合物經(jīng)長期臨床實踐證明可以顯著改善患者的臨床癥狀，且毒副作用小，復發(fā)率低，為結直腸癌前病變患者提供一種更好的治療方式。

全方以法半夏、生大黃共為君藥，共奏消痰、通腑之功；臣以制南星消痰化濕，加強消痰功效；佐以重樓、黃連清熱解毒，使以甘草調(diào)和諸藥。全方具有消痰祛濕、通腑解毒、軟堅散結的功效。

本發(fā)明的組方中各項藥物的性味、歸經(jīng)和功用，及常用重量如下：

法半夏：為天南星科植物半夏的塊莖。取凈半夏，大小分開，用水浸泡至內(nèi)無干心，取出；另取甘草適量，加水煎煮二次，合并煎液，倒入用適量水制成的石灰液中，攪勻，加入上述已浸透的半夏，浸泡，每日攪拌1～2次，并保持浸液ph值12以上，至剖面黃色均勻，口嘗微有麻舌感時，取出，洗凈，陰干或烘干，即得。法半夏味辛，性溫。歸脾、胃、肺經(jīng)。功效：燥濕化痰。主治：用于咽喉干燥，痰多咳喘，痰飲眩悸，風痰眩暈，痰厥頭痛。常用量：3～15克。

生大黃：蓼科大黃屬，即原生藥材的飲片。味苦，性寒。歸胃、大腸、肝、脾經(jīng)。功效：功積滯、清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、止血、解毒。主治：治實熱便秘、積滯腹痛、瀉痢不爽、濕熱黃疸、血熱吐衄、目赤、咽腫、腸癰疔瘡、瘀血經(jīng)閉、跌打損傷等。常用量：3～15克。

制南星：為禹南星，又稱會南星、禹州天南星，屬天南星科。藥用部分是它的塊莖。取凈天南星，按大小分別用水浸泡，每日換水2～3次，如起白沫時，換水后加白礬(每100kg天南星，加白礬2kg)，泡一日后，再進行換水，至切開口嘗微有麻舌感時取出天南星。味苦辛，性溫，人肺、肝、脾經(jīng)。功能：燥濕化痰，祛風定驚，消痞散結，消腫鎮(zhèn)痛。主治：寒痰、濕痰及頑痰咳嗽、胸膈脹悶；風痰證，如眩暈、中風痰壅、癲癇及破傷風；癰疽痰核、關節(jié)疼痛等；癌腫。常用量：3～15克。

重樓：為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖。味苦，性微寒；有小毒。歸肝經(jīng)。功效：清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚。主治：疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲咬傷，跌撲傷痛，驚風抽搐。常用量：3～30克。

黃連：味連、川連、雞爪連，屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物。味苦，性寒。歸心經(jīng)、胃經(jīng)、肝經(jīng)、大腸經(jīng)。功效：清熱燥濕，瀉火解毒。主治：胃腸濕熱，嘔吐，瀉痢，高熱神昏，心煩不寐，血熱吐衄，瘡瘍腫毒，膿耳，濕瘡，胃火牙痛。常用量：3～10克。

發(fā)明的作用與效果

本發(fā)明提供的用于治療結直腸癌前病變的中藥組合物，所用原料價廉，制備簡便，使用方便，副作用小，可長期服用，經(jīng)多年臨床應用和藥理研究，對治療結直腸癌前病變具有較好的療效。鑒于結直腸癌前病變患者數(shù)量較大，且預防結直腸癌臨床工作越來越重要，目前臨床激素治療效果欠佳，本發(fā)明提供的中藥復方制劑具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1是空白組、西藥組、中藥組和中西結合組小鼠體質量變化比較(x±s)結果圖。

圖2是各組小鼠nf-kb免疫組化指數(shù)(ihc值)的結果圖。

圖3是各組小鼠il-6免疫組化指數(shù)(ihc值)的結果圖。

圖4是各組小鼠stat3免疫組化指數(shù)(ihc值)的結果圖。

圖5為6w小鼠腸黏膜組織nf-kb、il-6及stat3蛋白表達結果。

圖6為14w小鼠腸黏膜組織nf-kb、il-6及stat3蛋白表達結果。

圖7為18w小鼠腸黏膜組織nf-kb、il-6及stat3蛋白表達結果。

具體實施方式

現(xiàn)結合實施例，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅局限于此。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明實施例所用藥材除另有注明，均可以從中藥材銷售公司獲得。所獲得的藥材除另有注明，均為中藥材飲片。飲片既可以從銷售公司獲得，也可以是獲得后經(jīng)加工而成。

實施例1：中藥組合物的湯劑制備

稱取法半夏10g，生大黃3g，制南星10g，重樓15g，黃連6g。

用水沖洗后于容器內(nèi)浸泡2小時以上，常壓煎煮20分鐘后，濾出藥液，得到本發(fā)明中藥組合物的水煎劑。

實施例2：中藥組合物的顆粒劑制備

稱取稱取法半夏10g，生大黃3g，制南星10g，重樓15g，黃連6g。

用水沖洗后于容器內(nèi)浸泡2小時以上，常壓煎煮30分鐘后，濾出藥液，得到本發(fā)明中藥組合物的水提取物，濃縮后加糊精，糖粉，混勻，以適量70％乙醇制軟材，過1號篩制粒，50℃干燥2小時，干燥顆粒過12～14目篩整粒，分裝，即得。

實施例3：中藥組合物的片劑制備

稱取稱取法半夏10g，生大黃3g，制南星10g，重樓15g，黃連6g。

用水沖洗后于容器內(nèi)浸泡2小時以上，常壓煎煮30分鐘后，濾出藥液，得到本發(fā)明中藥組合物的水提取物，加微晶纖維素、淀粉混勻，加入適量70％乙醇制軟材，過1號篩制粒，50℃干燥2小時，干燥顆粒過12～14目篩整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，即得。

實施例4：臨床觀察效果

病例來源：病例收集自2013年1月至2015年12月間，以結直腸錯構瘤相關性異型增生、炎性腸病相關性異型增生、結直腸鋸齒狀息肉、結直腸腺瘤、潰瘍性結直腸炎、克羅恩病等主訴就診于第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院中醫(yī)科的門診患者。

納入標準：

1.經(jīng)病理學證實，明確診斷符合結直腸癌前病變(結直腸錯構瘤相關性異型增生、炎性腸病相關性異型增生、結直腸鋸齒狀息肉、結直腸腺瘤、潰瘍性結直腸炎、克羅恩病)診斷的病例。

2.接受規(guī)范的中醫(yī)治療(治療時間≥6個月)；

3.臨床相關資料基本齊全。

排除標準：

1.治療、用藥不規(guī)范，治療時間小于6個月。

2.合并有嚴重的心、腦、肺、腎、胃、肝及腫瘤等基礎疾病患者，預期生存期不足6個月。

3.治療過程中，新診斷出其他惡性疾病，如腫瘤、血液病、腎功能不全、肝硬化、消化道出血等疾病。

治療方法：中藥組患者采用本發(fā)明實施例1中的中藥組合物湯劑施治，予患者每日1劑，水煎服，約500ml分早、晚兩次服用，28天為一療程，連續(xù)服用6個療程。對照組患者進行無藥物治療觀察，或常規(guī)西藥抗炎治療。

評價標準：(1)治療有效率：治愈：腸鏡檢查提示腸黏膜病變消失，臨床癥狀和體征均完全消失；好轉：腸鏡顯示腸黏膜病變顯著改善，臨床癥狀和體征均明顯改善或消失；無效：腸鏡檢查腸黏膜、以及臨床癥狀和體征均無改善或者病情惡化。

(2)腸鏡分級情況：0級：腸黏膜基本正常；i級：腸黏膜輕微充血，且血管呈模糊狀態(tài)；ii-iii級：腸黏膜中度充血；iv級：腸黏膜呈現(xiàn)大小不一的斑塊樣潰瘍。

(3)病理分級情況：i級：腸黏膜未出現(xiàn)中性粒細胞浸潤病變；ii級：腸黏膜呈現(xiàn)中度中性粒細胞浸潤病變；iii級：腸黏膜呈現(xiàn)重度中性粒細胞浸潤病變且伴有膿腫，不典型增生；iv級：形成黏膜潰瘍或高級別上皮內(nèi)瘤變。

(4)癥狀積分、病理評分以及內(nèi)鏡評分：在治療前后分別運用uc癥候積分表、病理評分量表(參照pullanrd等人提出的病理組織學評分標準)以及內(nèi)鏡評分量表(改進后baron量表)對兩組的具體治療效果作評價。

療效觀察：

對按上述標準納入的62例患者采用本發(fā)明實施例1中的中藥組合物湯劑施治，予患者每日1劑，水煎服，約500ml分早、晚兩次服用，28天為一療程，連續(xù)服用6個療程。同時對68例未服用中藥的患者進行對照研究。比較觀察兩組的臨床療效。

觀察治療前后患者臨床治療療效(見表1)，以及臨床癥狀積分、病理評分及內(nèi)鏡評分情況(表2)，并檢測結直腸癌發(fā)生過程中信號通路關鍵點(見表3)，采取治療前后對照方式判斷診治效果。

表1兩組臨床療效對比(n[％])

與對照組比較^△p<0.05；*p<0.01

表2治療后兩組癥狀積分、病理評分及內(nèi)鏡評分情況對比

與對照組比較^△p<0.05；*p<0.01

表3信號通路關鍵點nf-kb、il-6、stat3蛋白表達水平變化情況

與對照組比較^δp<0.05；*p<0.01

臨床療效觀察顯示，本發(fā)明中藥組合物干預后，結直腸癌前病變患者在臨床癥狀積分及腸鏡評分、病理評分方面均具有一定程度的改善；且nf-kb、il-6、stat3的表達水平均得到一定程度的逆轉。說明本發(fā)明中藥組合物對結直腸癌前病變患者具有一定的治療作用。

實施例5：本發(fā)明的經(jīng)典個案

患者，男，61歲。1981年曾腸鏡確診潰瘍性結腸炎。2007年10月因腹痛、腹瀉至醫(yī)院行腸鏡檢查，提示：橫結腸近肝區(qū)、生結腸、回盲部見數(shù)個亞蒂或無蒂的息肉。病理：腺瘤樣增生。于腸鏡下行結腸息肉apc圈套治療。術后腹痛、腹瀉、便秘等癥狀緩解。2011年3月復查腸鏡示升結腸、橫結腸多發(fā)息肉20余枚，無蒂，0.2-0.5cm，先后2次行腸鏡下apc治療，病理：腺瘤性增生伴輕度異型增生。為求進一步診治，于2011年9月28日前來就診。

癥見患者形體消瘦，素有便秘，大便3-4天一行，排便困難，胃脘嘈雜，無泛酸、噯氣，喜食高粱厚味之品，口苦口臭，舌紅苔黃膩，脈滑數(shù)。魏教授認為該患者潰瘍性結腸炎病史已二十一年，體內(nèi)痰濁凝聚，日久化熱，煉液再生痰濕，痰濁在體內(nèi)反復滋生、致病，導致患者素有便秘、口干口臭等一派痰濁征象。久而久之，痰聚為毒，形成腺瘤。蓋六腑以通為用，腸腑不通則病理代謝產(chǎn)物在體內(nèi)過度蓄積，痰邪日盛，與濕熱膠結成毒而成息肉。治擬消痰通腑，散結消癰。處方：法半夏10g，生大黃6g，重樓30g，黃連6g，制南星10g。30劑后復診，大便改善，1-2天一行，舌暗紅，苔薄白，脈細。

患者在上方基礎上加減治療，迭用法半夏、制南星消痰化濕，生大黃，重樓、黃連清熱解毒。堅持治療六個月，復查腸鏡升結腸、橫結腸散在息肉，數(shù)量明顯減少，大便正常，納佳、寐安。2012年9月19日復查腸鏡僅見2枚小息肉，再次行apc治療，其余未述明顯不適。繼服前方治療1月，隨訪至今未見復發(fā)。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。

實施例6：本發(fā)明的動物實驗

一、實驗材料

(一)實驗動物及飼養(yǎng)條件

實驗動物：小鼠種屬：c57bl/6；級別：健康清潔級；鼠齡：6周；性別：雄性；體重：20g±2g；來源：上海斯萊克實驗動物有限公司；許可證號碼：scxk(滬)2012-0002；

飼養(yǎng)條件：恒溫：(25±0.5)，相對濕度：(55±5)％，光照恒定，清潔條件下飼養(yǎng)。飼料生產(chǎn)證號：滬飼證(2014)04001；中國科學院上海實驗動物中心研制；上海普路騰生物科技有限公司生產(chǎn)。

(二)實驗藥物

1.本發(fā)明實施例1中的中藥組合物湯劑，命名為“消痰通腑方”。

2.柳氮磺胺吡啶：購自第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院，批號：22140205。

二、實驗方法

(一)實驗動物分組

c57bl/6小鼠90只，分籠飼養(yǎng)，18只/籠。均飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學藥學院動物房空氣層流架上，適應性飼養(yǎng)一周，按隨機數(shù)字表法隨機分為5組，即空白對照組、模型組、西藥組(柳氮磺胺吡啶組)、中藥組(消痰通腑方組)、中西醫(yī)結合組(柳氮磺胺吡啶+消痰通腑方組)。

(二)造模及給藥方法

空白對照組予自由飲用水；

模型組采用經(jīng)典aom/dss模型基礎上改良的“四步三循環(huán)”造模法：aom(12.5mg/kg)腹腔注射(d1)聯(lián)合dss循環(huán)飼喂(dssd1-d7+正常飲水d8-d21為一個循環(huán))反復3個循環(huán)，其中dss濃度為3.5％，同時，模型組給予與空白組等量蒸餾水；

中藥組給予消痰通腑方26g/(kg.d)濃縮液0.2ml/d；

西藥組給予柳氮磺胺吡啶7.8mg/只/天；

中西醫(yī)結合組同時給予消痰通腑方和柳氮磺胺吡啶。

各組小鼠在6w開始給藥，1次/天，連續(xù)12周。

(三)標本采集與處理

各組小鼠在實驗開始后每周稱重。分別于實驗的6w、14w、18w每組隨機選取6只小鼠，眼球取血，靜置2h后離心，取血清，待檢測。然后取遠端結腸(從肛門上8cm至肛門處)，并且將全結腸黏膜層切開，平鋪于平面，用大頭針加以固定，放大鏡觀察其粘膜出現(xiàn)炎癥、潰瘍、息肉、腺瘤的情況和程度。至18w選擇性取材(挑取腺瘤、息肉或潰瘍最明顯處)，平均分成兩部分，其中一部分用0.9％nacl溶液迅速沖洗干凈，然后置于體積10倍于標本的甲醛液中固定，待病理、免疫組化檢測另外一部分迅速放入ep管中，置入液氮保存，準備進行westernblot和realtime-pcr檢測。

(四)觀察方法及指標

1.基本狀態(tài)觀察

造模前及造模過程中，觀察各組小鼠飲食、飲水、精神、毛發(fā)、排便、活動等基本情況；造模開始小鼠每周稱重一次，記錄小鼠體重變化情況。分別于6、14、18周末每組各隨機抽取6只小鼠斷頸處死，取遠端結腸(從肛門上8cm至肛門處)，并且將全結腸黏膜層切開，平鋪于平面，用大頭針加以固定，放大鏡觀察其粘膜出現(xiàn)炎癥、潰瘍、息肉、腺瘤的情況和程度。同時觀察小鼠其他部位狀況，如肝、脾及腹腔部位是否有腫瘤性病變。

2.病理學診斷標準

肉眼觀察見黏膜充血、水腫，血管紋理紊亂、模糊，半月襞增厚，腸管常呈痙攣狀態(tài)可視為炎癥形成；黏膜面變粗糙，粘膜表面呈現(xiàn)大小均衡、彌漫分布的細顆粒，表面組織變脆，出現(xiàn)自然出血或接觸性出血，粘膜腔內(nèi)有黏液性分泌物，即可視為黏膜糜爛；而后進一步發(fā)展，黏膜糜爛同時伴有許多散在分布的白色或黃色小斑，此為隱窩膿腫形成后膿性分泌物附于腺管開口所致的針頭樣、線形或斑片狀潰瘍形成。

病理診斷標準依據(jù)2000年國際癌癥研究機構(iarc)出版的who腫瘤分類《消化系統(tǒng)腫瘤病理學和遺傳學》一書，其中對于胃腸道癌前病變和癌的診斷名稱、定義、標準作出規(guī)定。

3.免疫組化法檢測小鼠腸黏膜上皮組織中nf-kb、il-6、stat3蛋白表達含量

實驗方法：dab顯色，蘇木精復染，封片，光鏡下觀察。細胞核或細胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性，每張切片在250倍顯微鏡下隨機選定3個視野，采用醫(yī)學圖像定量分析系統(tǒng)進行免疫組化圖像中陽性區(qū)域面積和陽性比率以及od值的測定，并計算免疫組化指數(shù)(ihc)，ihc＝陽性面積×od/總面積。

4.westernblot法檢測小鼠腸黏膜上皮組織中nf-kb、il-6、stat3蛋白表達含量

實驗方法：取標本100mg，加入冰預冷的細胞裂解液500u了，組織勻漿，采用憤世疾測定蛋白質含量，制備12％分離膠與4％濃縮膠，sds-聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳，轉印，雜交，堿性磷酸酶顯色，并以β-catin內(nèi)參蛋白作為對照，進行定量分析。

三、實驗結果

(一)小鼠基本狀態(tài)觀察

模型組雄性c57bl/6小鼠接受aom腹腔注射2天后，開始逐漸出現(xiàn)懶動、厭食、大便次數(shù)增多、軟便(不能粘附于肛門的糊狀、半成形大便)。注射7天后癥狀達到高峰：dss第一循環(huán)致炎1周后，造模小鼠表現(xiàn)為懶動、厭食、拱背現(xiàn)象加重，大便次數(shù)增多；3次循環(huán)后，造模小鼠毛色少華、嗜臥扎堆、體質量下降，改為自由飲用普通無菌水后上述外觀體征逐漸緩解。

正常對照組c57bl/6小鼠活動如常，反應機敏，毛發(fā)有光澤，飲食正常，體質量增長，無懶動、腹瀉及便血等異常改變。與模型組比較，中藥組、西藥組、中西醫(yī)結合組腹瀉、肉眼膿便程度較輕且持續(xù)時間較短，動物整體狀態(tài)較好。

(二)小鼠體質量變化

造模開始前各組小鼠體質量無明顯差異(p>0.05)。從6w開始，各組間體質量出現(xiàn)明顯差異(p<0.05)，空白組體質量增長較快，西藥組、中藥組和中西結合組增長較慢，模型組增長最慢。模型組與空白組、中藥組、西藥組、中西結合組與模型組的體質量均存在顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。具體體重變化見表3及圖1。

表3各組小鼠體質量變化(g)

續(xù)表3各組小鼠體質量變化(g)

(三)小鼠結直腸腺瘤成瘤率結果

模型組小鼠最早于14w出現(xiàn)結直腸腺瘤33.3％，平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤1(個)，至18w結直腸發(fā)生率達100％，平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤4.3(個)；西藥組小鼠14w，平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤0.33(個)，至18w，平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤1.83(個)；中藥組小鼠14w平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤0.5(個)，至18w平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤2.5(個)；中西醫(yī)結合組小鼠14w平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤0.33(個)，至18w平均每只小鼠發(fā)現(xiàn)結直腸腺瘤1.5(個)，詳見表4。

表4小鼠結直腸腺瘤成瘤率(發(fā)現(xiàn)腺瘤組數(shù)/腺瘤數(shù))

(四)小鼠腸黏膜免疫組化結果

以細胞核或細胞漿內(nèi)有棕黃色細顆粒為陽性表達。nf-kb、il-6、stat3、aicd在模型組、中藥組、西藥組和中西醫(yī)結合組的陽性表達均增多，表現(xiàn)為染色深且多。

如圖2、圖3、圖4所示，與模型組比較，nf-kb、il-6、stat3、在中藥組、西藥組、中西醫(yī)結合組陽性表達減少，表現(xiàn)為染色顏色變淺且少。

本研究顯示，nf-kb免疫組化指數(shù)在模型組表達升高，與空白組比較，模型組的差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。nf-kb在西藥組、中藥組、中西醫(yī)結合組表達逐漸降低，與模型組比較，西藥組差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)，中藥組和中西醫(yī)結合組nf-kb免疫組化指數(shù)的差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)；與西藥組比較，中藥組和中西醫(yī)結合組nf-kb免疫組化指數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；與中西醫(yī)結合組比較，中藥組nf-kb免疫組化指數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)，詳見表5和圖2。

il-6免疫組化指數(shù)在模型組表達升高，與空白組比較，模型組的差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。il-6在西藥組、中藥組、中西醫(yī)結合組表達均降低，與模型組比較，西藥組、中藥組和中西醫(yī)結合組il-6免疫組化指數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；與西藥組比較，中藥組il-6免疫組化指數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；與中西醫(yī)結合組比較，中藥組il-6免疫組化指數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，詳見表5和圖3。

stat3免疫組化指數(shù)在模型組表達升高，與空白組比較，模型組stat3免疫組化指數(shù)的差異有模型組的差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。stat3在西藥組、中藥組、中西醫(yī)結合組stat3免疫組化指數(shù)表達均降低，與模型組比較，中藥組和中西醫(yī)結合組stat3免疫組化指數(shù)的差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)；與西藥組比較，中藥組和中西醫(yī)結合組stat3免疫組化指數(shù)的差異均有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)；與中西醫(yī)結合組比較，中藥組stat3免疫組化指數(shù)的差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)，詳見表5和圖4。

表5各組小鼠nf-kb、il-6和stat3免疫組化指數(shù)(ihc值)比較(n＝6，×10^-3)

注：與空白組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01；

(五)westernblot法檢測小鼠腸黏膜組織nf-kb、il-6、stat3蛋白表達水平

1、6w小鼠腸黏膜組織nf-kb、il-6及stat3蛋白表達

6w，aom/dss造模第二個循環(huán)結束。與空白組比較，模型組、西藥組、中藥組、中西醫(yī)結合組的nf-kb表達水平均下調(diào)、il-6、stat3和aicd的表達水平均上調(diào)；與模型組比較，西藥組、中藥組、中西醫(yī)結合組的nf-kb、il-6和stat3表達變化組間差異不明顯(見圖5)。

2、14w小鼠腸黏膜組織nf-kb、il-6、stat3、aicd蛋白表達

14w，aom/dss造模第三循環(huán)結束后一個月。與空白組比較，模型組、西藥組、中藥組和中西醫(yī)結合組nf-kb、il-6、stat3表達水平均上調(diào)；與模型組比較，西藥組和中西醫(yī)結合組nf-kb和il-6表達水平上調(diào)，stat3表達水平下調(diào)；與模型組比較，中藥組nf-kb表達水平上調(diào)，il-6和stat3表達水平下調(diào)；與西藥組比較，中藥組在nf-kb、il-6表達水平下調(diào)，在stat3表達水平上調(diào)；與西藥組比較，中西醫(yī)結合組在nf-kb表達水平下調(diào)，在il-6、stat3表達水平均上調(diào)；與中藥組比較，中西醫(yī)結合組在nf-kb、il-6、stat3表達水平均上調(diào)(見圖6)。

3、18w小鼠腸黏膜組織nf-kb、il-6、stat3蛋白表達

18w，aom/dss造模第三循環(huán)結束后二個月。與空白組比較，模型組nf-kb、il-6表達水平均上調(diào)，但stat3表達水平表達下調(diào)；與模型組比較，西藥組、中藥組和中西醫(yī)結合組nf-kb、stat3表達水平上調(diào)，il-6表達水平下調(diào)；與西藥組比較，中藥組和中西醫(yī)結合組nf-kb表達水平上調(diào)，il-6、stat3表達水平下調(diào)；與中藥組比較，中西醫(yī)結合組nf-kb、il-6和stat3表達水平差異不明顯(見圖7)。

由此可知，相對于西藥組，中藥組小鼠體內(nèi)nf-kb、il-6、stat3的表達水平更低，說明本發(fā)明的中藥組合物對結直腸癌前病變具有比西藥更好的療效，因此，本發(fā)明中藥物組合物對結直腸癌前病變患者具有一定的治療或預防作用。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。