本發(fā)明屬于光動力治療技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種光敏劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光動力學(xué)治療(pdt)的原理是，光敏劑吸收特定波長的光后，能將吸收光子所產(chǎn)生的能力轉(zhuǎn)移給周圍的氧原子，使之氧化成活性氧，活性氧再氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸類生物分子，可以對細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。氧氣、光敏劑、一定波長的光是pdt治療的3大要素。

現(xiàn)有的將殼聚糖作為載體制備得到的光敏劑復(fù)合物是光動力學(xué)治療所用的光敏劑。雖然此類光敏劑可以顯著延長光敏劑在體內(nèi)的循環(huán)時間，減少光敏劑自身的用量，提高光敏劑真正聚集在靶細(xì)胞中的比例，但現(xiàn)有的此類光敏劑，在特定的激發(fā)光作用下，無論是否被細(xì)胞攝取，都能產(chǎn)生光動力學(xué)殺傷效果，因此，只適合于光照區(qū)域限定在一個范圍的實體瘤治療。由于淋巴瘤細(xì)胞是彌散分布在血液中的，pdt治療血液瘤，需要對血液進(jìn)行照射，而失去了光照區(qū)域選擇性，這使得上述以殼聚糖為載體的光敏劑，即便具有靶向性和良好的控釋性，也不適合應(yīng)用于血液瘤的治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種光敏劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的光敏劑復(fù)合物靶向性好、安全性高，能夠使光動力學(xué)治療的選擇性不依賴于光照區(qū)域，使光動力學(xué)治療具備細(xì)胞選擇性，能很好的應(yīng)用于血液瘤的治療。

本發(fā)明提供了一種光敏劑復(fù)合物，所述光敏劑復(fù)合物為殼核結(jié)構(gòu)，以殼聚糖為親水骨架，殼聚糖親水骨架內(nèi)部通過酰胺鍵偶聯(lián)疏水化合物，所述疏水化合物與光敏劑偶聯(lián)，形成核結(jié)構(gòu)；殼聚糖親水骨架外部與極性水分子作用，所述殼聚糖親水骨架外部還經(jīng)特異性抗體修飾，形成殼結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的是，所述疏水化合物為多烯類疏水化合物，具有兩個相鄰的羧基。

優(yōu)選的是，所述多烯類疏水化合物含有共軛雙鍵。

優(yōu)選的是，所述多烯類疏水化合物為類胡蘿卜素類化合物。

優(yōu)選的是，所述多烯類疏水化合物為2-羧基類胡蘿卜素。

優(yōu)選的是，所述光敏劑為ce6。

優(yōu)選的是，所述特異性抗體為抗cd19單鏈抗體，編碼抗cd19單鏈抗體的基因核苷酸序列如seqidno:3所示。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述光敏劑復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

1)將殼聚糖與疏水化合物按照質(zhì)量比為(20～30):4混合進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到接枝聚合物，通過透析去除殘留的疏水化合物；

2)將步驟1)所述接枝聚合物溶于極性溶液得到濃度為0.5～1.5mg/ml的接枝聚合物溶液，將光敏劑以20～40μl/min的速度滴加入接枝聚合物溶液中，得到負(fù)載光敏劑的膠束；

3)將步驟2)所述負(fù)載光敏劑的膠束與特異性抗體進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到光敏劑復(fù)合物。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述光敏劑復(fù)合物或上述技術(shù)方案所述制備方法得到的光敏劑復(fù)合物在制備預(yù)防和/或治療急性b淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種光敏劑復(fù)合物。本發(fā)明的光敏劑復(fù)合物為殼核結(jié)構(gòu)，以殼聚糖為親水骨架，殼聚糖親水骨架內(nèi)部通過酰胺鍵偶聯(lián)疏水化合物，所述疏水化合物與光敏劑偶聯(lián)，形成核結(jié)構(gòu)；殼聚糖親水骨架外部與極性水分子作用，形成殼結(jié)構(gòu)；所述殼聚糖親水骨架外部經(jīng)特異性抗體修飾。本發(fā)明的光敏劑復(fù)合物通過殼核結(jié)構(gòu)的設(shè)置，增強了光敏劑的穩(wěn)定性；特異性抗體在殼聚糖親水骨架外部的修飾提升了光敏劑的靶向性。在ph呈中性的整個血液循環(huán)中，所述光敏劑復(fù)合物始終保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，構(gòu)成內(nèi)部核結(jié)構(gòu)的疏水化合物和光敏劑接觸，通過單線態(tài)氧淬滅來抑制光敏劑作用的發(fā)揮；當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部時，疏水基團(tuán)在溶酶體的酸性環(huán)境下(ph5～6)，會從殼聚糖中解離出來，解除了對光敏劑的抑制作用。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的光敏劑復(fù)合物能夠在血液中長時間循環(huán)，具有細(xì)胞依賴性，即血液在體外于特定波長激發(fā)下，只有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的光敏劑復(fù)合物，才能產(chǎn)生單線態(tài)氧，對該細(xì)胞造成毒性，而血液中未被攝取、殘存的光敏劑復(fù)合物不會對血液系統(tǒng)造成損傷，安全性高。

本發(fā)明提供的光敏劑復(fù)合物不需依賴于光照區(qū)域，通過其具備的細(xì)胞依賴性，只有被細(xì)胞攝取的光敏劑才能夠產(chǎn)生光致毒性，本發(fā)明提供的光敏劑復(fù)合物能夠?qū)崿F(xiàn)對急性b淋巴細(xì)胞白血病的預(yù)防和/或治療。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1提供的重組載體構(gòu)建表達(dá)的核酸電泳圖；其中l(wèi)ane1是單鏈抗體(medi-551-scfv)；lane2是重組表達(dá)載體(pet-sumo-medi-551-scfv)；

圖2為本發(fā)明實施例2提供的wb檢測酶切前后所帶標(biāo)簽的切除情況圖；2a為用抗his的抗體檢測產(chǎn)物中的his標(biāo)簽；2b為用抗sumo的抗體檢測產(chǎn)物中的sumo標(biāo)簽；lane1：酶切后，產(chǎn)物經(jīng)ni柱純化的流出液；lane2：酶切前的ni柱純化產(chǎn)物；

圖3為本發(fā)明實施例2提供的酶切前后的sds-page電泳結(jié)果圖；m：marker；lane1：酶切前的ni柱純化產(chǎn)物；lane2：酶切后，產(chǎn)物經(jīng)ni柱純化的流出液；

圖4為本發(fā)明實施例5提供的偶聯(lián)單鏈抗體的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)sephadexg200葡聚糖凝膠的洗脫曲線；

圖5為本發(fā)明實施例5提供的光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)的制備過程以及ph穩(wěn)定性示意圖：5a為光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)的制備路線；5b為光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)的在酸性條件下水解，釋放游離的ce6示意圖；5c為接枝共聚物的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6為本發(fā)明實施例6提供的光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)的uv-vis吸收光譜曲線圖；

圖7為本發(fā)明實施例7提供的光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)的透射電鏡觀察結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實施例8提供的ce6濃度-熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖9為本發(fā)明實施例10提供的臨界膠束濃度(cmc)測定曲線；

圖10為本發(fā)明實施例11提供的光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)的ce6釋放量隨ph的變化；

圖11為本發(fā)明實施例12提供的ce6、car-cs-ce6、anticd19-car-cs-ce6的單線態(tài)氧釋放量檢測；

圖12為本發(fā)明實施例13提供的raji細(xì)胞和pbmc對car-cs-ce6、anticd19-car-cs-ce6的細(xì)胞攝取量隨時間的變化；

圖13為本發(fā)明實施例14提供的mtt檢測car-cs-ce6、anticd19-car-cs-ce6的raji細(xì)胞和pbmc的細(xì)胞毒性；

圖14為本發(fā)明實施例14提供的一種體外自血治療的裝置，a為裝置的主體；b為氧氣注入口；c為輸血器連接口；e和d為led光源的發(fā)光面。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種光敏劑復(fù)合物，所述光敏劑復(fù)合物為殼核結(jié)構(gòu)，以殼聚糖為親水骨架，殼聚糖親水骨架內(nèi)部通過酰胺鍵偶聯(lián)疏水化合物，所述疏水化合物與光敏劑偶聯(lián)，形成核結(jié)構(gòu)；殼聚糖親水骨架外部與極性水分子作用，所述殼聚糖親水骨架外部還經(jīng)特異性抗體修飾，形成殼結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明中，所述光敏劑復(fù)合物能夠形成以接枝聚合物為主體形成的膠束，所述膠束包裹光敏劑；疏水化合物與殼聚糖進(jìn)行酯化反應(yīng)，通過酰胺鍵接枝，得到接枝聚合物，所述接枝聚合物通過疏水化合物的疏水鍵將光敏劑包裹在其內(nèi)部，形成負(fù)載光敏劑的膠束。

在本發(fā)明中，所述膠束能夠提升光敏劑復(fù)合物在水溶液中的分散性。當(dāng)膠束形態(tài)完整時，對于光敏劑特定的激發(fā)波長，具有單線態(tài)氧淬滅效應(yīng)；當(dāng)膠束結(jié)構(gòu)破壞時，對于光敏劑特定的激發(fā)波長，恢復(fù)相應(yīng)的光動力學(xué)效應(yīng)。即只有該膠束進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部時，由于需要經(jīng)過一個溶酶體結(jié)構(gòu)，溶酶體的酸性環(huán)境可以使膠束結(jié)構(gòu)破壞，對于光敏劑特定的激發(fā)波長，才能產(chǎn)生單線態(tài)氧，產(chǎn)生的單線態(tài)氧可以氧化破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)果；當(dāng)該膠束游離分散在血液中時，由于所處環(huán)境為中性，膠束結(jié)構(gòu)保持完整，對于光敏劑特定的激發(fā)波長，不會產(chǎn)生單線態(tài)氧。

本發(fā)明提供的光敏劑復(fù)合物以殼聚糖作為親水骨架，殼聚糖外部的親水部分，是參與細(xì)胞識別和信號傳導(dǎo)的重要分子；殼聚糖內(nèi)部的疏水化合物類似于卵磷脂的長鏈烴基，類似于細(xì)胞膜的組成特點，可以通過胞吞的形式進(jìn)入細(xì)胞。

在本發(fā)明中，所述殼聚糖親水骨架內(nèi)部通過酰胺鍵偶聯(lián)疏水化合物，形成接枝聚合物；所述酰胺鍵是殼聚糖親水骨架內(nèi)部的氨基與疏水化合物通過酯化反應(yīng)形成的；本發(fā)明對鍵合到所屬殼聚糖親水骨架內(nèi)部疏水化合物的數(shù)量沒有特殊的限定。

在本發(fā)明中，所述疏水化合物和光敏劑通過疏水鍵相互作用，形成偶聯(lián)，得到核結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明中，所述疏水化合物優(yōu)選為多烯類化合物，具有至少兩個相鄰的羧基。在本發(fā)明中，所述多烯類疏水化合物結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵。在本發(fā)明中，所述多烯類疏水化合物優(yōu)選為類胡蘿卜素類化合物，更優(yōu)選為番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素或斑蝥黃素。在本發(fā)明中，所述類胡蘿卜素類化合物的作用為當(dāng)和光敏劑通過疏水鍵結(jié)合時，可以吸收光敏劑被特定波長的光激發(fā)后產(chǎn)生的能量，阻止這種能量傳遞給氧原子，從而出現(xiàn)單線態(tài)氧淬滅效應(yīng)。

在本發(fā)明中，所述多烯類疏水化合物還可以為2-羧基類胡蘿卜素。本發(fā)明對所述2-羧基類胡蘿卜素的來源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的2-羧基類胡蘿卜素的市售產(chǎn)品即可。在本發(fā)明中，疏水化合物的兩個相鄰的羧基中，一個羧基用于與親水骨架的殼聚糖形成酰胺鍵相連，另一個羧基在形成的酰胺鍵的鄰位，這種結(jié)構(gòu)在中性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下會發(fā)生水解。

在本發(fā)明中，所述光敏劑優(yōu)選為ce6。所述ce6為疏水性光敏劑，能夠被疏水化合物包裹在接枝聚合物形成的膠束的內(nèi)部形成核結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明中，所述殼聚糖親水骨架外部與極性水分子作用，形成殼結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，所述殼聚糖親水骨架與極性水分子優(yōu)選通過氫鍵相互作用。在本發(fā)明中，所述殼結(jié)構(gòu)類似于水化膜的作用，能夠保護(hù)內(nèi)部的疏水性核結(jié)構(gòu)，增強核結(jié)構(gòu)的水溶性。

在本發(fā)明中，所述殼聚糖親水骨架外部經(jīng)特異性抗體修飾。所述特異性抗體為抗cd19單鏈抗體，編碼抗cd19單鏈抗體的基因核苷酸序列如seqidno:3所示。在本發(fā)明中，所述抗cd19單鏈抗體能夠使得該光敏劑復(fù)合物被表達(dá)cd19的細(xì)胞靶向性攝取。

在本發(fā)明中，所述抗cd19單鏈抗體編碼序列的獲得是：通過drugbank獲得抗cd19抗體(medi-551)的vh序列(如seqidno:1所示)和vl序列(如seqidno:2所示)，再通過一段柔性肽(g4s)3將vl的c端和vh的n端相連，獲得抗cd19的單鏈抗體(medi-551-scfv)的序列(如seqidno:3所示)。seqidno:3所示序列具體為：

本發(fā)明對所述抗cd19單鏈抗體的獲得方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白表達(dá)方式即可。在本發(fā)明中，所述抗cd19單鏈抗體通過構(gòu)建入表達(dá)載體，在宿主菌中表達(dá)獲得。所述表達(dá)載體優(yōu)選為抗pet-sumo中，本發(fā)明對所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的表達(dá)載體構(gòu)建方法即可，如酶切連接方法；具體地，所述雙酶切方法優(yōu)選選用bamhi和hinderiii酶切位點進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。本發(fā)明對所述宿主菌的選擇沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)蛋白表達(dá)菌株即可，本申請優(yōu)選采用大腸桿菌菌株origami2(de3)。

在本發(fā)明中，所述抗cd19單鏈抗體采用發(fā)酵獲得，本發(fā)明對所述發(fā)酵的方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的大腸桿菌發(fā)酵蛋白的常規(guī)方法即可。本發(fā)明優(yōu)選對發(fā)酵得到的蛋白進(jìn)行純化，得到抗cd19單鏈抗體，本發(fā)明對所述蛋白的純化方法也沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白純化方法即可，如鎳柱純化方法。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述光敏劑復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

1)將殼聚糖與疏水化合物按照質(zhì)量比為(20～30):4混合進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到接枝聚合物，通過透析去除殘留的疏水化合物；

2)將步驟1)所述接枝聚合物溶于極性溶液得到濃度為0.5～1.5mg/ml的接枝聚合物溶液，將光敏劑以20～40μl/min的速度滴加入接枝聚合物溶液中，得到負(fù)載光敏劑的膠束；

3)將步驟2)所述負(fù)載光敏劑的膠束與特異性抗體進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到光敏劑復(fù)合物。

本發(fā)明將殼聚糖與疏水化合物按照質(zhì)量比為(20～30):4混合進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到接枝聚合物，通過透析去除殘留的疏水化合物。在本發(fā)明中，所述殼聚糖與疏水化合物的質(zhì)量比優(yōu)選為25：4。在本發(fā)明中，所述酯化反應(yīng)中疏水化合物的其中一個羧基與殼聚糖的2-氨基通過酰胺鍵進(jìn)行連接。本發(fā)明對所述透析的方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)透析方法即可。

得到接枝聚合物后，本發(fā)明將接枝聚合物溶于極性溶液得到濃度為0.5～1.5mg/ml的接枝聚合物溶液，將光敏劑以20～40μl/min的速度滴加入接枝聚合物溶液中，得到負(fù)載光敏劑的膠束；在本發(fā)明中，所述極性溶液優(yōu)選為pbs，本發(fā)明對所述pbs沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)pbs即可。在本發(fā)明中，所述接枝聚合物在極性溶液中的濃度優(yōu)選為1mg/ml，所述光敏劑的滴加速率優(yōu)選為30μl/min。

得到負(fù)載光敏劑的膠束后，本發(fā)明將所述負(fù)載光敏劑的膠束與特異性抗體進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到光敏劑復(fù)合物。在本發(fā)明中，特異性抗體優(yōu)選與膠束中未參與反應(yīng)的殼聚糖中的2-氨基通過酰胺鍵進(jìn)行連接。

具體地，當(dāng)所述光敏劑復(fù)合物中光敏劑為ce6，編碼抗cd19單鏈抗體的基因核苷酸序列如seqidno:3所示，多烯類疏水化合物為2-羧基類胡蘿卜素時，對應(yīng)的光敏劑復(fù)合物的制備方法包括以下步驟：

1)構(gòu)建表達(dá)載體(pet-sumo-medi-551-scfv)以及表達(dá)菌(origami2(de3)/pet-sumo-medi-551-scfv)；

2)利用ni柱純化-酶切-ni柱再純化的方式，獲得相應(yīng)的抗cd19單鏈抗體蛋白(medi-551-scfv)，利用westernblotting聯(lián)合sds-page證明該蛋白得以正確表達(dá)；

3)將2-羧基類胡蘿卜素與殼聚糖進(jìn)行酯化反應(yīng)形成酰胺鍵，得到接枝聚合物：2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖(car-cs)；

4)將所述接枝聚合物與光敏劑進(jìn)行包埋反應(yīng)形成內(nèi)部為2-羧基類胡蘿卜素和光敏劑作用的核結(jié)構(gòu)，外部為親水性殼聚糖的殼結(jié)構(gòu)，得到負(fù)載光敏劑的膠束：2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束(car-cs-ce6)；

5)將單鏈抗體(medi-551-scfv)與步驟4)得到的負(fù)載光敏劑膠束進(jìn)行酯化反應(yīng)形成酰胺鍵，獲得最終產(chǎn)物：抗cd19的單鏈抗體修飾的2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束(anticd19-car-cs-ce6)。

本發(fā)明構(gòu)建表達(dá)載體(pet-sumo-medi-551-scfv)以及表達(dá)菌(origami2(de3)/pet-sumo-medi-551-scfv)。在本發(fā)明中，構(gòu)建表達(dá)載體前，優(yōu)選對抗體的序列進(jìn)行設(shè)計，本發(fā)明所述編碼抗體的序列如seqidno:3所示，所述seqidno:3所示序列的設(shè)計方法為：通過drugbank獲得抗cd19抗體(medi-551)的vh序列(如seqidno:1所示)和vl序列(如seqidno:2所示)，再利用overlappcr的方法，通過一段柔性肽(g4s)3將vl的c端和vh的n端相連得到seqidno:3所示序列。本發(fā)明對所述overlappcr的條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的overlappcr反應(yīng)條件即可。

得到表達(dá)菌后，本發(fā)明利用ni柱純化-酶切-ni柱再純化的方式，獲得相應(yīng)的抗cd19單鏈抗體蛋白(medi-551-scfv)，利用westernblotting聯(lián)合sds-page證明該蛋白得以正確表達(dá)。本發(fā)明對利用表達(dá)菌進(jìn)行抗體蛋白表達(dá)的方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)大腸桿菌培養(yǎng)方法以及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)方法即可。本發(fā)明對所述ni柱純化的方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的ni柱純化方法即可。本發(fā)明對所述酶切方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白酶切方法即可，具體的，本申請表達(dá)得到的蛋白his標(biāo)簽與蛋白之間有sumo酶切位點，本發(fā)明選用sumo酶進(jìn)行酶切，本發(fā)明對所述酶切條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的sumo酶常規(guī)酶切條件即可。

本發(fā)明將2-羧基類胡蘿卜素與殼聚糖進(jìn)行酯化反應(yīng)形成酰胺鍵，得到接枝聚合物：2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖(car-cs)。本發(fā)明對所述2-羧基類胡蘿卜素與殼聚糖的來源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的2-羧基類胡蘿卜素與殼聚糖的常規(guī)市售產(chǎn)品即可。在本發(fā)明中，所述殼聚糖與2-羧基類胡蘿卜素的質(zhì)量比優(yōu)選為(20～30):4，更優(yōu)選為25：4。本發(fā)明對所述酯化反應(yīng)的條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酯化反應(yīng)條件即可。

得到2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖(car-cs)后，本發(fā)明將所述接枝聚合物與光敏劑進(jìn)行包埋反應(yīng)形成內(nèi)部為2-羧基類胡蘿卜素和光敏劑作用的核結(jié)構(gòu)，外部為親水性殼聚糖的殼結(jié)構(gòu)，得到負(fù)載光敏劑膠束：2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束(car-cs-ce6)。在本發(fā)明中，所述2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖與光敏劑的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～20)：1，更優(yōu)選為15：1。在本發(fā)明中，所述光敏劑優(yōu)選為ce6。本發(fā)明對所述包埋反應(yīng)條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的包埋反應(yīng)的常規(guī)方法即可。

得到切除標(biāo)簽表達(dá)正確純化后的目的單鏈抗體和負(fù)載光敏劑膠束后，本發(fā)明將單鏈抗體(medi-551-scfv)與負(fù)載光敏劑膠束進(jìn)行酯化反應(yīng)形成酰胺鍵，獲得最終產(chǎn)物：抗cd19的單鏈抗體修飾的2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束(anticd19-car-cs-ce6)。本發(fā)明對所述酯化反應(yīng)的條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酯化反應(yīng)條件即可。

在本發(fā)明中，所述光敏劑復(fù)合物在ph為中性條件下穩(wěn)定，ph6.5時發(fā)生約30％的解離，ph低于6.0時，解離度逐漸增高，約為80％。

具體的，當(dāng)本發(fā)明的光敏劑復(fù)合物為anticd19-car-cs-ce6時，所述光敏復(fù)合物具有ph敏感性，形成膠束的疏水化合物為2-羧基類胡蘿卜素類似物，其參與反應(yīng)的一端具有2個羧基，通過其中一個羧基形成酰胺鍵共價結(jié)合在主鏈殼聚糖上的，而另一個羧基保持游離狀態(tài)，由于鄰位具有羧基的酰胺鍵在酸性條件下(ph6.0)容易發(fā)生水解，使得該膠束類光敏劑復(fù)合物在ph低于6.0時，因疏水化合物的解離喪失原有的殼核結(jié)構(gòu)，包裹在其中的光敏劑被釋放出來。

光敏劑復(fù)合物anticd19-car-cs-ce6結(jié)構(gòu)穩(wěn)定時，會產(chǎn)生活性氧淬滅效應(yīng)。由于其疏水化合物2-羧基類胡蘿卜素類似物為共軛多烯類疏水化合物，當(dāng)與ce6緊密接觸時，共軛雙鍵能很好的與ce6中的吡咯環(huán)發(fā)生重疊，通過fret效應(yīng)，轉(zhuǎn)移ce6吸收特定波長而產(chǎn)生的能量，從而淬滅ce6的活性氧產(chǎn)量。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述光敏劑復(fù)合物或上述技術(shù)方案所述制備方法得到的光敏劑復(fù)合物在制備預(yù)防和/或治療急性b淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明對所述藥物的劑型沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)藥物劑型即可。在本發(fā)明中，所述藥物的劑型優(yōu)選為凍干粉末，優(yōu)選采用生理鹽水在避光條件下溶解，所述藥物的濃度優(yōu)選為5～10mg/ml。

所述光敏劑復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的過程為：通過表面修飾的抗cd19單鏈抗體，靶向性地定位于表達(dá)cd19的細(xì)胞表面，隨后經(jīng)歷內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，依次被包裹在內(nèi)吞體(ph6.0)，溶酶體(ph5.0)2個細(xì)胞器內(nèi)，在這2個細(xì)胞器的酸性環(huán)境中，該光敏劑復(fù)合物被分解，釋放游離的光敏劑ce6。所述光敏劑復(fù)合物anticd19-car-cs-ce6在血液中，其穩(wěn)定性具有細(xì)胞依賴性的特點，只有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，才能釋放出游離的光敏劑ce6，相對應(yīng)的單線態(tài)氧產(chǎn)量也具有細(xì)胞依賴性特點，即只有被細(xì)胞攝取的光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)，在特定激發(fā)波長下，才能產(chǎn)生單線態(tài)氧。

具體地，為了驗證該光敏劑復(fù)合物的治療過程和效果，本發(fā)明實施具體給予患者服用5～10mg/ml的該光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)，24h后抽取患者一部分血液，于體外進(jìn)行671nm波長的照射，只有進(jìn)入表達(dá)cd19靶細(xì)胞的光敏劑復(fù)合物才能產(chǎn)生單線態(tài)氧，而在血液中未被攝取的光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)不會產(chǎn)生單線態(tài)氧，因此對靶細(xì)胞破壞的同時，不會對血液中的正常細(xì)胞(正常的白細(xì)胞，紅細(xì)胞等)和其他非細(xì)胞成分(血小板，血漿白蛋白等)造成損傷。因此，具有安全性。由于所述光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)能在血液中長時間循環(huán)，所以一次體外自血治療后，殘留的光敏劑復(fù)合物(anticd19-car-cs-ce6)可以在其后的血液循環(huán)中繼續(xù)被靶細(xì)胞攝取，達(dá)到一次給藥，多次治療的效果。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的一種抗cd33單鏈抗體及光敏劑復(fù)合物及其制備方法做進(jìn)一步詳細(xì)的介紹，本發(fā)明的技術(shù)方案包括但不限于以下實施例。

實施例1

medi-551-scfv表達(dá)載體的構(gòu)建：

通過drugbank獲得抗cd19抗體(medi-551)的vh序列(如seqidno:1所示)和vl序列(如seqidno:2所示)，再利用overlappcr的方法，通過一段柔性肽(g4s)3將vl的c端和vh的n端相連，獲得了抗cd19的單鏈抗體(medi-551-scfv)的序列(如seqidno:3所示)，在序列的2端添加上bamhi和hinderiii酶切位點，以酶切酶連的方式插入表達(dá)載體pet-sumo中，經(jīng)過菌落pcr驗證和測序，篩選出正確的重組表達(dá)載體：pet-sumo-medi-551-scfv電泳結(jié)果如圖1所示，其中l(wèi)ane1是單鏈抗體(medi-551-scfv)；lane2是重組表達(dá)載體(pet-sumo-medi-551-scfv)。

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入origami2(de3)，利用50ug/ml的卡那霉素篩選出正確的表達(dá)菌株：origami2(de3)/pet-sumo-medi-551-scfv。

實施例2

medi-551-scfv蛋白的獲得：

將表達(dá)菌株(origami2(de3)/pet-sumo-medi-551-scfv)進(jìn)行2l的大規(guī)模發(fā)酵，提取其胞質(zhì)蛋白，由于該表達(dá)載體得到的目的蛋白其5’端帶有his標(biāo)簽，且其后含有一段sumo酶切位點，因此采用ni柱純化-酶切-ni柱再純化的方式，獲得了相應(yīng)的單鏈抗體(medi-551-scfv)蛋白。

具體步驟如下：

1)收集培養(yǎng)的大腸桿菌，4℃，8000rpm離心30min，獲得細(xì)菌沉淀。

2)將沉淀重懸于20ml含有0.1mg/ml溶菌酶的細(xì)胞裂解液(50mmtris-hcl,0.5mnacl,1％tritonx-100，ph8.0)中，超聲處理10min。

3)將上述混合物于4℃，磁力攪拌30min后，14000rpm離心30min，收集上清液，并用0.22um濾膜過濾。

4)將濾過的上清液上樣預(yù)先用pbs平衡的ni柱，上樣結(jié)束后，用5個柱體積的pbs洗滌。

5)用咪唑濃度依次為10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、500mm的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，每種洗脫濃度收集10管，1ml/管。

6)各管洗脫產(chǎn)物，經(jīng)過sds-page驗證后，確定含有目的蛋白的洗脫組分，并將這些組分合并，獲得5端帶有his標(biāo)簽以及隨后的sumo酶切位點目的蛋白的融合形式。

7)裝于透析帶中，用500mlpbs透析3次，每次12h。

8)得到的透析產(chǎn)物中按100iu/ml加入sumo蛋白酶(該酶同樣含有his標(biāo)簽)，于37℃反應(yīng)10h，反應(yīng)產(chǎn)物再次經(jīng)ni柱吸附，收集流出液，流出液利用超濾管(mwco：50kda)，超濾得到濃縮液，得到濃縮的產(chǎn)物經(jīng)wb驗證(結(jié)果見圖2：2a為用抗his的抗體檢測產(chǎn)物中的his標(biāo)簽；2b為用抗sumo的抗體檢測產(chǎn)物中的sumo標(biāo)簽；lane1：酶切后，產(chǎn)物經(jīng)ni柱純化的流出液；lane2：酶切前的ni柱純化產(chǎn)物)，sds-page驗證(結(jié)果見圖3：m：marker；lane1：酶切后，產(chǎn)物經(jīng)ni柱純化的流出液；lane2：酶切前的ni柱純化產(chǎn)物)。證明正確表達(dá)的目的蛋白的純化標(biāo)簽被有效切除，獲得蛋白質(zhì)的最終序列如seqidno:4所示。

實施例3

2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖(car-cs)的合成

1)稱取殼聚糖50mg，溶于20ml的ddh2o中，稱取2-羧基類胡蘿卜素酸酐8mg，溶于20ml的45℃乙醇中。

2)將以上2種溶液于80℃下混合，用磁力攪拌器250rpm下攪拌過夜。

3)在反應(yīng)混合液中加入250ml冷乙醚產(chǎn)生沉淀，過濾，得到的沉淀再用100ml冷乙醚洗滌數(shù)次。

4)用50mlddh2o復(fù)溶沉淀，反應(yīng)混合物在冰水浴中，用20％naoh調(diào)節(jié)ph至10，抽濾。

5)濾液裝于透析袋(mwco為10000)中，透析液為10％的乙醇溶液，透析3次，去除反應(yīng)中的雜質(zhì)。

6)隨后將透析液更換為ddh2o，再透析2次，去除殘留乙醇。

7)將透析產(chǎn)物凍干。得到深黃色產(chǎn)物2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖(car-cs)。

實施例4

2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束(car-cs-ce6)的合成：

1)稱取2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖15mg，溶于15mlpbs溶液中，于37℃，磁力攪拌過夜，使其完全溶解；稱取ce61mg，溶于600μlthf溶液中，得到ce6溶液。

2)將ce6溶液緩慢滴加到2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖溶液中，控制滴加速率，30μl/min，滴加過程中，全程用磁力攪拌器攪拌混合。

3)滴加完畢后，于37℃繼續(xù)攪拌24h，得到2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束(car-cs-ce6)。

實施例5

抗cd19的單鏈抗體修飾的2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束(anticd19-car-cs-ce6)的合成：

1)于上述制備的膠束溶液中，加入edc溶液(50mg/ml)和nhs溶液(50mg/ml)各0.15ml，室溫孵育20min后，再加入medi-551-scfv溶液(0.16mg/ml)0.15ml，室溫輕輕攪拌1h，

2)反應(yīng)產(chǎn)物通過sephadexg200葡聚糖凝膠柱，用0.01m的pbs(ph7.4)作為洗脫相，以2ml/管收集洗脫液。

3)檢測每管洗脫液中280nm出的吸收值，繪制洗脫曲線，結(jié)果如圖4所示，

4)可以看出，圖中的前后2個洗脫峰，分別對應(yīng)偶聯(lián)抗cd19的單鏈抗體(medi-551-scfv)的膠束，以及未參與反應(yīng)的游離的medi-551-scfv。收集混合并第一個洗脫峰所對應(yīng)管中的洗脫液。

5)合并相經(jīng)過超濾濃縮，得到表面有medi-551-scfv修飾的2-羧基類胡蘿卜素-殼聚糖-ce6膠束。

整個的制備過程以及ph穩(wěn)定性如圖5所示。

實施例6

uv-vis光譜分析：

將anticd19-car-cs-ce6的pbs溶液(濃度為0.01mg/ml)，置于石英皿中，測量其在250-700nm波長范圍內(nèi)的吸光度，繪制uv-vis曲線，結(jié)果如圖6所示。

可以看出，有5個吸收峰，其中，280nm處為蛋白質(zhì)，也就是medi-551-scfv特有的吸收峰；414和664nm兩處為ce6特有的吸收峰；472和501nm兩處為類胡蘿卜素特有的吸收峰；260-320nm范圍內(nèi)，有一個寬泛的吸收帶，和280處的蛋白質(zhì)吸收峰有些重疊，這是殼聚糖衍生物的吸收譜帶。

實施例7

tem檢測

將樣品溶于ddh2o，與3％磷鎢酸按體積比50：1混合染色后，取3μl混合液滴加于覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，待其自然干燥；用透射電鏡觀察其形態(tài)和大小。結(jié)果如圖7所示。

可以看出，制得的膠粒，表面比較光滑，呈現(xiàn)類球形。

實施例8

載藥量和包封率的測定

將用pbs稀釋的以下濃度ce6稀釋液：0.8、1、2、4、5μg/ml，用667nm波長激發(fā)，檢測其715nm處的熒光發(fā)射強度，以組為橫坐標(biāo)，檢測到的相應(yīng)熒光發(fā)射強度為縱坐標(biāo)，繪制ce6濃度-熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線(結(jié)果見圖8)，得到ce6濃度-熒光強度的回歸方程為：i＝0.464c3+1.736(r²＝0.9988)

將500μl納米?；鞈乙河趍illipore超濾離心管(mwco為10kda)，8000rpm離心40min，將濾出液收集后，用pbs稀釋10倍，用671nm波長激發(fā)，檢測其715nm處的熒光發(fā)射強度，再換算為ce6含量，作為ce6游離藥量。

包封率＝(ce6總投藥量-ce6游離藥量)/ce6總投藥量×100；載藥量＝(ce6總投藥量-ce6游離藥量)/納米粒質(zhì)量×100。

結(jié)果表明，包封率為：(64.2±1.6)％；載藥量為：(6.5±1.6)％。

實施例9

平均粒徑和zeta電位的測定

將合成的anticd19-car-cs-ce6溶解于pbs，得到濃度為1mg/ml的溶液。應(yīng)用動態(tài)光散射儀(dls)，測得化合物平均水化粒徑。

結(jié)果顯示，平均粒徑為(35.4±2.4)nm，平均zeta電位為(23.5±1.7)mv。

實施例10

臨界膠束濃度(cmc)測定

采用芘熒光法。將30μmol/l芘的丙酮溶液加入到一系列15ml離心管中，100μl/管，37℃使丙酮完全揮發(fā)，加入5ml不同質(zhì)量濃度(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml)的anticd19-car-cs-ce6溶液，室溫超聲40min，然后65℃水浴恒溫3h，室溫冷卻，靜置12h后，利用波長為334nm激發(fā)，檢測以上溶液在373nm和384nm處的熒光強度比值，以該比值作為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的各溶液中的膠束質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線，結(jié)果如圖9所示，確定載體的cmc的值為2.4μg/l。

實施例11

ce6釋放量隨ph的變化：

1)取6.0ml的anticd19-car-cs-ce6(含1.5mg的ce6)放入6個透析袋中，分別置于6個150ml不同ph的透析液中，透析介質(zhì)為pbs緩沖液中，ph依次為；5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。

2)分別于l、2、3、4、5h取出1.5ml透析液，同時補回相同體積對應(yīng)ph的透析液。

3)將不同時間點取出的透析液，利用激發(fā)波長為671nm的光激發(fā)后，檢測在715nm出的發(fā)射強度。再根據(jù)ce6濃度-熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出對應(yīng)的ce6含量。

4)將測得的ce6含量與總ce6的比值，作為釋放量，以不同的時間點為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的ce6釋放量為縱坐標(biāo)，繪制不同ph環(huán)境下anticd19-car-cs-ce6的釋放量，結(jié)果如圖10所示。

可以看出，ph為7.0和7.5時，釋放量很低，基本不超過10％，且隨時間變化不明顯；而在為6.5時，釋放量隨時間延長而增加，但最終不超過30％；在ph6.0以后，藥物的釋放量就顯著增加，在ph為5.5時，1h后的釋放量達(dá)到60％，而在ph為5.0時，1h后的釋放量即達(dá)到80％。

實施例12

單線態(tài)氧釋放量檢測

利用rno脫色反應(yīng)檢測單線態(tài)氧的釋放量，具體步驟如下：

1)將rno溶于重水(d2o)，配成終濃度為250μm的溶液a。

2)將組氨酸溶于重水(d2o)，配成終濃度為0.03m的溶液b。

3)將溶液a和溶液b按體積比1：3混合，得到溶液c。

4)6.67μm游離的ce6、car-cs-ce6和anticd19-car-cs-ce6，分別溶解在700μl含有1％dmso的重水中，隨后在相應(yīng)的測試組中，加入400μl溶液c，將混合溶液置于石英皿中，立刻檢測440nm處的發(fā)光強度，記為初始發(fā)光強度。

5)用波長為671nm、強度為6j/cm²的光源照射上述石英皿中的溶液30min。并且在此期間，每隔2min檢測440nm的發(fā)光強度。每個時間點的單線態(tài)氧產(chǎn)量的比例為：(初始發(fā)光強度-該時間點的發(fā)光強度)/初始發(fā)光強度×100％。

6)以時間為橫坐標(biāo)，以該時間點的單線態(tài)氧產(chǎn)量比例為縱坐標(biāo)，得到單線態(tài)氧產(chǎn)量曲線。結(jié)果如圖11所示。

可以看出，單純的光敏劑ce6的單線態(tài)氧的釋放量隨時間呈顯著性增加，30min的釋放量達(dá)到85％左右。

car-cs-ce6的單線態(tài)氧釋放量很低，最高不超過20％；anticd19-car-cs-ce6的單線態(tài)氧釋放量更低，最高不超過15％，且沒有時間依賴性，

可能是由于car-cs-ce6膠體中類胡蘿卜素對包裹的ce6有很好的光漂白作用，使ce6吸收相應(yīng)波長所產(chǎn)生的能量，大部分通過fret效應(yīng)傳遞給中類胡蘿卜素，而不是周圍的氧原子，因此單線態(tài)氧的產(chǎn)量大大降低。而在anticd19-car-cs-ce6膠體中，由于外表面有親水性的anticd19修飾，使得膠束的結(jié)構(gòu)更加致密，類胡蘿卜素對ce6的光漂白作用更強，單線態(tài)氧的產(chǎn)量更低。

實施例13

細(xì)胞攝取量測定

由于raji細(xì)胞是已經(jīng)報道的表面高表達(dá)cd19分子的b-all細(xì)胞，而pbmc表面很少有cd19分子的表達(dá)。

1)收集pbs洗滌后的5×107個對數(shù)生長期的raji細(xì)胞，3000rpm離心5min，得到細(xì)胞沉淀，加入1ml細(xì)胞裂解液(0.1mnaoh,1％sds)，得到細(xì)胞裂解產(chǎn)物。

2)將10μl不同劑量的car-cs-ce6和anticd19-car-cs-ce6，加入100μl上述細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，依次得到car-cs-ce6終濃度為0.8、1、2、4、5μg/ml的裂解液混合物，

3)混合物于超聲振蕩40min，然后12000rpm離心30min，取上清。

4)將上清于671nm的激發(fā)波長下，檢測715nm處相應(yīng)濃度的吸光度數(shù)值，得到裂解液中，膠束濃度與吸光值的關(guān)系。

5)將處于對數(shù)生長期的raji細(xì)胞鋪于6孔板的6個孔中，1×106細(xì)胞/孔。

6)24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，加入用pbs稀釋的car-cs-ce6和，再孵育0h、1h、2h、4h、8h、16h、24h。

7)到取樣時間點時，將對應(yīng)孔中的細(xì)胞懸液移至一干凈ep管，3000rpm離心5min，得到細(xì)胞沉淀，經(jīng)pbs洗滌2次后，再根據(jù)步驟1)、3)、4)，得到相應(yīng)的膠束含量。

8)以不同的時間點為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的膠束含量為縱坐標(biāo)，得到2種膠束的raji細(xì)胞攝取量隨時間的變化曲線。

9)采用同樣的方法，得到2種膠束的健康人pbmc攝取量隨時間的變化曲線。結(jié)果如圖12所示。

可以看出，白血病raji細(xì)胞對anticd19-car-cs-ce6的攝取量很高，4h即能達(dá)到40％左右，且有很強的時間依賴性，24h的攝取量約為82％；相比之下，對car-cs-ce6的攝取量很低，攝取量隨時間的增加較為平緩，24h的攝取量僅為30％左右；而正常細(xì)胞對這2種膠束的攝取量都不高，隨時間推移僅有少量變化。

說明，經(jīng)過特異性抗體修飾后，anticd19-car-cs-ce6膠束有很好的白血病細(xì)胞靶向功能，同時，降低在正常細(xì)胞中的聚集。

實施例14

細(xì)胞毒性測定

檢測car-cs-ce6和anticd19-car-cs-ce6對于raji細(xì)胞和健康人pbmc的細(xì)胞毒性，

1)將對數(shù)生長期的raji細(xì)胞鋪96孔板，5000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24h，

2)3000rpm離心5min，吸棄上清，然后，換成無血清的1640培養(yǎng)基，每個細(xì)胞分為3組，每組3復(fù)孔，分別加入pbs、等摩爾量的car-cs-ce6和anticd19-car-cs-ce6。使得ce6終濃度為5ug/ml、

3)于培養(yǎng)箱中避光溫育1h后，換成新鮮的1640+10％fbs培養(yǎng)基，100μl/孔，于培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h。

4)進(jìn)行671nm波長光照射，光照時間為5min，光照能量為9j/cm2。此后，再培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2h。

5)每孔加入11μlmtt溶液(5mg/ml)，孵育4h，3000rpm離心5min，棄上清，每孔加入dmso200μl溶解甲臜，于酶標(biāo)儀570nm處檢測吸光度。細(xì)胞抑制率(％)＝1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100％。

6)用同樣的方法，檢測以上2種膠束對健康人pbmc的細(xì)胞毒性，

結(jié)果如圖13所示?？梢钥闯?，anticd19-car-cs-ce6對raji細(xì)胞有很強的毒性，抑制率高達(dá)90％。而car-cs-ce6對raji細(xì)胞的抑制率相對較低，為50％左右；這2種膠束對于pbmc均顯示出較低的毒性，抑制率為10％左右。由于正常人血中也含有極少量的表達(dá)cd19的前b細(xì)胞，所以anticd19-car-cs-ce6對該部分細(xì)胞也有一定的細(xì)胞毒性，但由于不影響正常造血干細(xì)胞和成熟的b細(xì)胞，所以對于人血中正常成分的影響微乎其微。

這2種膠束表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性與細(xì)胞攝取率結(jié)果一致。說明，抗體修飾后的膠體具有靶向性，從而顯示出，更高效、更有特異性的殺傷力。

實施例15

體外循環(huán)光動力學(xué)治療：

通過一種治療裝置，如圖14所示，可以容納400ml血液，基本材質(zhì)是聚二甲基硅氧烷，具有良好的光學(xué)透明性能。

裝置的主體a，其內(nèi)部尺寸為40cm×40cm×0.25cm的扁平結(jié)構(gòu)，即長和寬均為40cm，厚度為0.25cm。上下2個面為照射面，其側(cè)面有2個端口(b和c)，分別用于注射氧氣，和連接輸血器。

治療裝置的光源為具有相同照射面積(40cm×40cm)的led發(fā)光陣列，光源密度為：每cm²有16個led微型發(fā)光二極管，其發(fā)射波長為671nm。使用時，將2個光源的發(fā)光面(d和e)緊貼著治療主體a的上下2個照射面。

具體治療過程如下：

1)對已經(jīng)檢測出cd19表達(dá)的b-all患者靜脈輸入10mg/kg經(jīng)0.22μm過濾后的anticd19-car-cs-ce6，給藥后，患者需避光24h。

2)抽取患者350ml血液，從c端灌于上述含有50ml抗凝劑的治療裝置中。

3)在b端注射經(jīng)0.22μm過濾后的純氧氣1ml，按順時針3-4次充分混勻。

4)將治療裝置于暗室中，用其光源照射3次，每次照射3min，兩次間隔1min。隨后將照射后的自體血液輸回患者體內(nèi)，作為一次治療。

患者每次給藥后，需要接受一個療程，包括5次治療，兩次治療間隔30min。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>李斯文

<120>一種光敏劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用

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