本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種半胱氨酸雙加氧酶，該酶的直接催化產(chǎn)物半胱亞磺酸，及該酶基因的新用途。

背景技術(shù)：

母乳是嬰兒成長(zhǎng)最自然、最安全、最完整的天然食物，為嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育提供最佳的營(yíng)養(yǎng)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)65.3％的哺乳期婦女為6月齡內(nèi)的嬰兒提供配方奶粉喂養(yǎng)，其中絕大多數(shù)(86.2％)是由于母乳不足(widespreadusageofinfantformulainchina：amajorpublichealthproblem，birth41(4)：339-343，2014)。人類乳腺發(fā)育不良致母乳不足對(duì)嬰兒發(fā)育和人口質(zhì)量具有長(zhǎng)遠(yuǎn)影響。

另?yè)?jù)研究表明，仔豬斷奶前的生長(zhǎng)速度及成活率與哺乳母豬乳腺發(fā)育程度密切相關(guān)，哺乳母豬泌乳不足是仔豬死亡的重要原因之一。山羊生產(chǎn)中也存在母羊泌乳不足造成羔羊發(fā)育不良和死亡的問(wèn)題。對(duì)于奶牛，乳腺發(fā)育程度更是影響其乳產(chǎn)量和泌乳壽命的主要決定性因素。

半胱氨酸雙加氧酶(cysteinedioxygenase，cdo)是一種非血紅素類單亞鐵核心離子金屬酶，能催化半胱氨酸加一分子氧生成半胱亞磺酸(cysteinesulfinicacid，csa)。半胱亞磺酸在半胱亞磺酸脫羧酶(csad)作用下生成亞?；撬岵⑦M(jìn)一步轉(zhuǎn)化為?；撬?。小鼠、大鼠、豬、牛和人的cdo基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)規(guī)律和功能高度相似，均由5個(gè)外顯子構(gòu)成，均編碼200個(gè)氨基酸，其蛋白氨基酸序列同源性高于90％。已有報(bào)道cdo基因缺陷會(huì)引起自主免疫性疾病(abnormalsulphuroxidationinsystemiclupuserythematosus，lancet339(8784)：25-26，1992)和神經(jīng)性疾病(阿茲海默癥和帕金森綜合癥)(plasmacysteineandsulphatelevelsinpatientswithmotorneurone，parkinson′sandalzheimer′sdisease，neuroscilett110(1-2)：216-220，1990)。此外，cdo可能與腫瘤抑制相關(guān)(cysteinedioxygenase1isatumorsuppressorgenesilencedbypromotermethylationinmultiplehumancancers，plosone7(9)：e44951，2012；frequentinactivationofcysteinedioxygenasetype1contributestosurvivalofbreastcancercellsandresistancetoanthracyclines，clincancerres19(12)：3201-3211，2013)。

目前cdo相關(guān)的研究主要集中在?；撬岬暮铣杉芭；撬岬墓δ苷{(diào)控。cdo的直接催化產(chǎn)物半胱亞磺酸的生物學(xué)功能尚未見(jiàn)報(bào)道。尚未見(jiàn)半胱氨酸雙加氧酶及其催化產(chǎn)物半胱亞磺酸與乳腺發(fā)育相關(guān)的研究和報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種半胱氨酸雙加氧酶，該酶的直接催化產(chǎn)物半胱亞磺酸，及該酶基因的新用途，具體為半胱氨酸雙加氧酶及其基因，以及其直接催化產(chǎn)物半胱亞磺酸與哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)，能夠促進(jìn)乳腺導(dǎo)管延伸和分枝，促進(jìn)泌乳，可作為治療乳腺發(fā)育不良的一種手段。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

1.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產(chǎn)物半胱亞磺酸在制備促進(jìn)乳腺導(dǎo)管發(fā)育的藥物中的應(yīng)用。

2.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產(chǎn)物半胱亞磺酸在制備促進(jìn)泌乳的藥物中的應(yīng)用。

3.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產(chǎn)物半胱亞磺酸在制備預(yù)防或治療乳腺發(fā)育不良的藥物中的應(yīng)用。

4.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產(chǎn)物半胱亞磺酸在制備促進(jìn)乳腺導(dǎo)管延伸與分枝的藥物中的應(yīng)用。

5.半胱氨酸雙加氧酶基因、半胱氨酸雙加氧酶或其催化產(chǎn)物半胱亞磺酸在制備促進(jìn)乳腺腺泡發(fā)育的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述藥物以哺乳動(dòng)物為治療對(duì)象。

優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物為人、豬、牛、綿羊、山羊、小鼠或大鼠。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)將雌性小鼠cdo基因敲除后發(fā)現(xiàn)乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)發(fā)育嚴(yán)重受損，由于乳腺發(fā)育不良導(dǎo)致泌乳不足，所育后代發(fā)育受阻或死亡；而為青春期cdo基因敲除雌鼠補(bǔ)充cdo的直接催化產(chǎn)物半胱亞磺酸后，其乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)發(fā)育得到部分恢復(fù)。對(duì)野生型小鼠(cdo未敲除)，補(bǔ)充一定劑量半胱亞磺酸后乳腺導(dǎo)管發(fā)育明顯加快(導(dǎo)管延伸加快、分枝增多)。本發(fā)明的研究表明，cdo通過(guò)其催化產(chǎn)物半胱亞磺酸促進(jìn)哺乳動(dòng)物乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)發(fā)育，為乳腺發(fā)育不良的預(yù)防和治療及提高哺乳動(dòng)物泌乳能力提供了新的思路。

附圖說(shuō)明

圖1為cdo蛋白在小鼠各組織器官及乳腺中的westernblot分析結(jié)果；a圖中1-9依次為cdo蛋白在心臟、肝臟、脾、肺、腎、下丘腦、垂體、卵巢、乳腺中的相對(duì)表達(dá)量；b圖中1-7依次為小鼠在21日齡、6周齡、12周齡、妊娠14.5天、泌乳第一天、泌乳第7天、乳腺退化期的cdo蛋白相對(duì)表達(dá)水平；

圖2為cdo基因敲除小鼠信息；圖中a為cdo基因結(jié)構(gòu)及cas9n靶點(diǎn)示意圖；b圖為試驗(yàn)中采用的cdo突變小鼠dna測(cè)序結(jié)果(cdo基因編碼區(qū)dna序列缺失83bp，從編碼區(qū)第42位至第124位堿基缺失)；c圖為cdo突變小鼠dnasanger測(cè)序峰圖；d圖為cdo基因突變小鼠乳腺cdo蛋白表達(dá)驗(yàn)證(cdo和csad抗體來(lái)自abcam公司)；

圖3cdo敲除(cdo^-/-)及野生型(cdo^+/+)雌性小鼠乳腺全組織染色結(jié)果；具體為21日齡(21day)、6周齡(6week)、12周齡(12week)野生型(cdo^+/+)小鼠和cdo敲除(cdo^-/-)小鼠乳腺全組織染色結(jié)果；

圖4半胱亞磺酸(csa)、?；撬?taurine)及半胱氨酸鹽酸鹽(cysteine-cl)對(duì)乳腺導(dǎo)管發(fā)育的影響。

圖5為半胱亞磺酸(csa)促進(jìn)野生型小鼠乳腺導(dǎo)管延伸和分枝染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只作為示例，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

相關(guān)哺乳動(dòng)物cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)：

小鼠cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)nm_033037；

大鼠cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)nm_052809；

人cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)nm_001323565、nm_001801、nm_001323566、nm_001323567；

牛cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)nm_001034465；

山羊cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)xm_005685043；

綿羊cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)xm_015096777；

豬cdo基因mrna序列ncbi登錄號(hào)nm_001167643。

實(shí)施例1

采用westernblot方法對(duì)6周齡雌性小鼠各組織器官中cdo蛋白表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明cdo在乳腺中高表達(dá)(表達(dá)量?jī)H次于肝臟)，而在下丘腦、垂體和卵巢等內(nèi)分泌器官中表達(dá)量很低(圖1中a圖)；與現(xiàn)有相關(guān)報(bào)道吻合。對(duì)不同發(fā)育期雌性小鼠乳腺組織中cdo蛋白進(jìn)行westernblot定量分析發(fā)現(xiàn)，在各發(fā)育期乳腺組織中cdo蛋白表達(dá)量呈明顯規(guī)律性變化。在青春期到成年發(fā)育期間(3周齡-12周齡，此時(shí)乳腺導(dǎo)管快速延伸并大量分枝)乳腺中cdo呈現(xiàn)高水平表達(dá)，而在妊娠期和泌乳期(此時(shí)乳腺腺泡大量分化)乳腺中cdo表達(dá)量顯著降低，而泌乳期結(jié)束后乳腺退化期(此時(shí)乳腺腺泡退化，乳腺逐漸恢復(fù)到妊娠前狀態(tài))cdo蛋白又重新恢復(fù)到妊娠前的表達(dá)水平(圖1中b圖)。cdo蛋白在乳腺導(dǎo)管延伸和分枝發(fā)育期高表達(dá)，而乳腺腺泡發(fā)育期低表達(dá)的規(guī)律恰好符合乳腺“未孕-懷孕-泌乳-退化”的循環(huán)發(fā)育規(guī)律，提示cdo可能與乳腺導(dǎo)管延伸與分枝密切相關(guān)。

實(shí)施例2

為了揭示cdo對(duì)乳腺發(fā)育的調(diào)控作用，我們利用crispr/cas9技術(shù)，在cdo基因第一外顯子編碼區(qū)設(shè)置兩個(gè)反向縮短的sgrna靶點(diǎn)(圖2中a圖)配合cas9n(d10a)切刻酶，避免了脫靶的發(fā)生。利用t7轉(zhuǎn)錄試劑盒(mmessagemachinet7kit，life公司)合成cas9n基因mrna，利用t7高效轉(zhuǎn)錄試劑盒(hiscribe^tmt7highyieldrnasynthesiskit，neb)合成兩個(gè)sgrna。通過(guò)小鼠受精卵顯微注射cas9nmrna(60ng/μl)和兩個(gè)sgrna(20ng/μl)并胚胎移植獲得cdo基因移碼突變小鼠(圖2中b圖和c圖)。經(jīng)擴(kuò)繁獲得純合突變(cdo基因敲除)個(gè)體，通過(guò)westernblot驗(yàn)證cdo敲除小鼠乳腺中cdo蛋白表達(dá)缺失(圖2中d圖)。

實(shí)施例3

經(jīng)過(guò)仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)cdo基因敲除雌鼠所育后代發(fā)育不良，且不能存活，但將其后代寄養(yǎng)于哺乳期野生型(cdo未敲除)雌鼠后正常存活，并健康發(fā)育。說(shuō)明cdo基因敲除雌鼠泌乳不足至后代發(fā)育不良并死亡。進(jìn)一步進(jìn)行乳腺全組織染色，實(shí)驗(yàn)步驟包括：采集小鼠第四對(duì)乳腺在玻片上鋪平，于卡諾固定液(酒精∶氯仿∶冰醋酸＝6∶3∶1體積比)中固定過(guò)夜，然后在體積分?jǐn)?shù)70％的酒精中平衡5分鐘，置于醋酸洋紅染液中染色2小時(shí)，酒精梯度(80％-90％-95％-100％)脫水(每級(jí)10分鐘)，二甲苯透明10分鐘，中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明，同窩的野生型(cdo^+/+)雌鼠乳腺發(fā)育正常，而cdo敲除(cdo^-/-)雌鼠乳腺導(dǎo)管延伸明顯變慢，而且分枝也顯著減少。

實(shí)施例4

根據(jù)半胱氨酸代謝途徑分析，cdo敲除后，一方面會(huì)導(dǎo)致半胱亞磺酸(csa)和?；撬?taurine)合成障礙，另一方面半胱氨酸(cysteine)向下代謝受阻而在細(xì)胞中積累。課題組分別對(duì)青春期cdo基因敲除(cdo^-/-)和野生型(cdo^+/+)雌鼠通過(guò)腹腔注射補(bǔ)充半胱亞磺酸(csa)、?；撬?taurine)或過(guò)量的半胱氨酸鹽酸鹽(cysteine-cl)，分析這些物質(zhì)對(duì)乳腺發(fā)育的影響。具體方法為：對(duì)21日齡至35日齡cdo敲除(cdo^-/-)雌鼠通過(guò)腹腔注射csa(100mg/kg體重/天)或taurine(100mg/kg體重/天)；對(duì)21日齡至35日齡野生型(cdo^+/+)雌鼠通過(guò)腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8％nacl(每天0.2ml對(duì)照)、taurine(100mg/kg體重/天)、csa(100mg/kg體重/天)或cysteine-cl(200mg/kg體重/天)后乳腺全組織染色(染色步驟同實(shí)施例3)；csa、taurine和cysteine-cl分別用0.8％的nacl溶解。結(jié)果見(jiàn)圖4，連續(xù)補(bǔ)償csa(從21日齡～35日齡，100mg/kg體重/天)，不但能明顯改善cdo基因敲除雌鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育不良的問(wèn)題，而且也顯著促進(jìn)野生型小鼠乳腺導(dǎo)管的延伸和分枝發(fā)育，而?；撬釋?duì)照處理并無(wú)明顯變化；過(guò)量的半胱氨酸鹽酸鹽(200mg/kg體重/天，從21日齡～35日齡)處理，也不影響野生型雌鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育。以上結(jié)果表明cdo主要通過(guò)其下游產(chǎn)物半胱亞磺酸調(diào)控乳腺導(dǎo)管發(fā)育。

實(shí)施例5

為了進(jìn)一步驗(yàn)證半胱亞磺酸促進(jìn)乳腺導(dǎo)管發(fā)育的功能，課題組對(duì)21日齡至42日齡野生型(cdo^+/+)小鼠每天通過(guò)腹腔注射補(bǔ)充半胱亞磺酸(100mg/kg體重)或?qū)φ仗幚?質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8％nacl)，43日齡采集第四對(duì)乳腺組織進(jìn)行全組織染色。結(jié)果見(jiàn)圖5，圖的結(jié)果表明csa處理小鼠相對(duì)于對(duì)照組(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8％nacl)，乳腺導(dǎo)管延伸明顯加快、分枝顯著增多，csa能顯著促進(jìn)野生型小鼠乳腺導(dǎo)管延伸和分枝發(fā)育。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)的范圍當(dāng)中。