本發(fā)明屬于醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種載碳青霉烯類抗生素的i型膠原/羥基磷灰石鈣仿生骨。

背景技術(shù)：

慢性創(chuàng)傷性骨髓炎多為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌感染，這些耐藥細(xì)菌可以在細(xì)胞表面產(chǎn)生多糖蛋白復(fù)合物，形成生物膜包裹細(xì)菌，保護(hù)細(xì)菌。要?dú)绫Ｗo(hù)在生物蛋白膜內(nèi)的細(xì)菌，到達(dá)骨髓炎病灶的抗生素必須對(duì)上述致病細(xì)菌敏感，而且病灶局部抗生素濃度必須高于致病菌最低抑菌濃度許多倍，全身靜脈滴注抗生素難以達(dá)到這樣的治療要求。與此同時(shí)，骨髓炎病灶清除后，會(huì)殘留空腔，需要植骨材料填充骨腔。

為了彌補(bǔ)全身用藥的不足，以及同時(shí)達(dá)到植骨的作用。各國學(xué)者對(duì)載抗生素人工骨進(jìn)行了多年研究。目前臨床應(yīng)用較多的載抗生素人工骨是醫(yī)用型caso4，它由全球最大的骨科生物材料生產(chǎn)公司wright研制，其基礎(chǔ)晶體是α-半水硫酸鈣，水溶性抗生素能夠和它結(jié)合成固體植入物，而不影響抗菌效果。因此臨床上多將萬古霉素或慶大霉素與α-半水硫酸鈣混合，制成載萬古霉素/載慶大霉素硫酸鈣人工骨，廣泛應(yīng)用于治療骨髓炎患者。

但是載萬古霉素硫酸鈣人工骨只針對(duì)金黃色葡萄球等革蘭氏陽性菌感染的骨髓炎，載慶大霉素人工骨也只對(duì)普通的非耐藥革蘭氏陰性菌感染骨髓炎有效；對(duì)于耐藥型大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等革蘭氏陰性菌感染的骨髓炎，上述兩種載抗生素人工骨并不敏感，而上述耐藥型革蘭氏陰性菌感染的骨髓炎在臨床上占了將近42％。所以國際上流行通用的載萬古霉素和慶大霉素硫酸鈣人工骨已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了，臨床上治療耐藥型革蘭氏陰性菌感染骨髓炎的需要。為了針對(duì)大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等耐藥型革蘭氏陰性感染的骨髓炎，國內(nèi)外曾有學(xué)者在硫酸鈣人工骨中加入新型抗生素泰能，即亞胺培南/西司他??；因?yàn)閬啺放嗄?西司他丁是碳青霉烯類抗生素，它對(duì)革蘭氏陰性菌敏感，尤其是對(duì)大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等骨髓炎中的耐藥菌臨床有效率達(dá)93％。學(xué)者也希望通過在人工骨中加載亞胺培南，達(dá)到治療耐藥型革蘭氏陰性菌感染骨髓炎的目的。但是，將泰能(亞胺培南/西司他丁)加載至硫酸鈣，合成載抗生素硫酸鈣人工骨并不簡單。因?yàn)?，亞胺培南與α-半水硫酸鈣混合后不能凝固成型，而是變成粉末；而粉末狀載亞胺培南硫酸鈣人工骨放置于患者骨髓炎病灶中，一經(jīng)骨髓腔內(nèi)血液沖刷，立即流失；無法達(dá)到緩釋抗生素，治療骨髓炎的效果。

其次，載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨還有一個(gè)致命缺點(diǎn)就是：其人工骨的化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)與人類天然骨組織并不一致，并不能替代自身骨組織植骨。因?yàn)?，人類自身天然骨組織由有機(jī)大分子i型膠原蛋白和無機(jī)礦物質(zhì)羥基磷灰石鈣晶體生物礦化組成；羥基磷灰石鈣晶體呈片狀鑲嵌在膠原纖維中，沿著膠原纖維的長軸縱向生物礦化。而美國wright公司所研發(fā)的載抗生素半水硫酸鈣人工骨，其分子方程式為1/2h2o.caso4，只是單純的無機(jī)物，不含有有機(jī)大分子i型膠原蛋白，更不用說i型膠原蛋白與羥基磷灰石鈣生物礦化的分子結(jié)構(gòu)；無論是其化學(xué)成分，還是分子結(jié)構(gòu)都與天然骨組織相去甚遠(yuǎn)。而且當(dāng)臨床應(yīng)用載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨，填充骨髓炎病灶清除后的骨缺損時(shí)；半水硫酸鈣在人體內(nèi)水解，1/2h2o.caso4＝〉1/2h2o+ca²⁺+so4^2-，分解為鈣離子和硫酸根離子。當(dāng)抗生素硫酸鈣完全水解后，仍然會(huì)留下空腔。所以為了填充殘留的空腔，又不得不取患者自體髂骨植骨，增加患者創(chuàng)傷和痛苦。

因此，目前臨床上所用的載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨，既不能對(duì)耐藥型革蘭氏陰性致病菌敏感，又不符合天然骨組織的化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)，故已經(jīng)滿足不了臨床上治療骨髓炎的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨，其化學(xué)成分和分子機(jī)構(gòu)與人類天然骨組織不符；而且無法加載針對(duì)耐藥型革蘭氏陰性致病菌敏感的碳青霉烯類抗生素。本發(fā)明模擬人體內(nèi)生物礦化，合成i型膠原/羥基磷灰石仿生骨，并加載碳青霉烯類抗生素，從而形成載碳青霉烯類抗生素的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨。其化學(xué)成分和分子機(jī)構(gòu)與天然骨組織一致，并能釋放出對(duì)骨髓炎耐藥型革蘭氏陰性致病菌敏感的碳青霉烯類抗生素。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明載碳青霉烯類抗生素的i型膠原/羥基磷灰石鈣仿生骨，主要由碳青霉烯類抗生素加載在i型膠原/羥基磷灰石鈣仿生骨上構(gòu)成，其中i型膠原/羥基磷灰石鈣仿生骨采用i型膠原蛋白與羥基磷灰石鈣生物礦化而成；

進(jìn)一步地，碳青霉烯類抗生素包括亞胺培南-西司他丁、美羅培南、厄他培南或比阿培南。

進(jìn)一步地，碳青霉烯類抗生素與i型膠原/羥基磷灰石鈣仿生骨的質(zhì)量比例是7～10:100。

進(jìn)一步地，i型膠原蛋白與羥基磷灰石鈣的質(zhì)量比例是0.5～1:4。

上述載碳青霉烯類抗生素的i型膠原/羥基磷灰石鈣仿生骨，采用以下方法制備而成：

步驟(1)、i型膠原蛋白的制備

將富含i型膠原蛋白的動(dòng)物組織破碎后進(jìn)行酶解或酸解，得到所需的i型膠原蛋白溶液；所述的富含i型膠原蛋白的動(dòng)物組織可以采用大鼠尾巴肌腱、豬皮、豬骨、跟腱；

酶解的條件是：破碎后的動(dòng)物組織與胃蛋白酶的質(zhì)量比為1g：60～200mg；酶解溫度為20～32℃，酶解時(shí)間為5～8天。

酸解的條件是：破碎后的動(dòng)物組織與醋酸的質(zhì)量體積比為1g：50～100ml；酸解溫度為20～25℃，醋酸濃度為0.5m～1.5m，酸解時(shí)間為7～10天。

步驟(2)、i型膠原蛋白膠體的制備

將步驟(1)獲得的i型膠原蛋白溶液，放入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)1～2小時(shí)后，i型膠原蛋白自組裝成果凍樣膠體；最后將膠體放置在去離子水中浸泡，反復(fù)沖洗洗去多余的戊二醛，得到i型膠原蛋白膠體；

i型膠原蛋白與戊二醛的質(zhì)量體積比：1g：10～20ml。

交聯(lián)溫度為20～25℃。

步驟(3)、生物礦化：

將步驟(2)獲得的i型膠原膠體浸泡在礦化液中，進(jìn)行生物礦化，礦化7～9天后得到i型膠原/羥基磷灰石仿生骨；

礦化液采用以下方法制備：

特制的鈣液25ml倒入燒杯中，滴入paa濃度350ug/ml；滴加1m的hcl，調(diào)節(jié)ph至7.4。然后緩慢滴入磷液25ml，約16滴/分鐘。

25ml鈣液由以下組分構(gòu)成：10mmcacl2.2h2o、150mmnacl、50mmtris、0.02％nan3；

25ml磷化液由6mmna2hpo4構(gòu)成；

步驟(4)、加載抗生素

將i型膠原/羥基磷灰石仿生骨，浸泡在碳青霉烯類抗生素溶液中，30℃～38℃靜置24～48h，從而形成載碳青霉烯類抗生素i型膠原/羥基磷灰石仿生骨。

本發(fā)明的有益效果是：

1)人類自身骨組織是由有機(jī)大分子i型膠原蛋白和無機(jī)羥基磷灰石鈣組成，在分子結(jié)構(gòu)上，羥基磷灰石鈣晶體是以i型膠原蛋白纖維為模板，鑲嵌在膠原纖維分子間隙，沿著膠原纖維的長軸縱向礦化生長。而本發(fā)明，先是合成與人類自身骨組織中i型膠原蛋白纖維的d-band結(jié)構(gòu)一致的，i型膠原蛋白膠體。然后，模擬生物礦化，羥基磷灰石晶體沿著膠原蛋白纖維礦化生長，最終形成生物礦化仿生骨。其化學(xué)成分和分子結(jié)構(gòu)與人類自身骨組織一致，可以作為植骨材料，填充骨髓病灶清除后殘留的空腔。

2)針對(duì)耐藥型革蘭氏陰性致病菌感染的難治型骨髓炎，將藥敏高度敏感的碳青霉烯類抗生素與人工骨結(jié)合；載碳青霉烯類抗生素的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨，可以緩釋出碳青霉烯類抗生素，抑制大腸桿菌等耐藥型革蘭氏陰性致病菌的感染，從而彌補(bǔ)了目前臨床上使用的載萬古霉素/慶大霉素硫酸鈣人工骨，不能涵蓋骨髓炎所有菌譜的缺點(diǎn)。

附圖說明

圖1為膠原蛋白sds－page圖，其中左邊：蛋白marer，中間：新鮮膠原蛋白原液，右邊：室溫放置過夜樣品；

圖2為i型膠原蛋白膠體的透射電子顯微鏡圖；

圖3為i型膠原/羥基磷灰石仿生骨的電子衍射圖；

圖4為i型膠原/羥基磷灰石仿生骨的透射電子顯微鏡圖；

圖5為加載有亞胺培南的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨的抑菌圈。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的分析。

實(shí)施例1：

1.i型膠原蛋白的制備：超凈臺(tái)操作取大鼠尾巴洗凈，75％的酒精浸泡5分鐘。將尾巴剪開，去掉皮毛，并剪成小段，抽出銀色的尾巴肌腱。將尾鍵剪斷置于平皿中，滅菌生理鹽水浸泡。吸去生理鹽水。將尾鍵置于平皿中剪碎，轉(zhuǎn)移至滅菌過的注射器瓶中。按每克尾鍵50ml的比例，加入0.1％的醋酸溶液。搖晃，將尾鍵分散于醋酸溶液中，4℃放置一星期。離心4000r/min，20分鐘。在醋酸溶液的酸解下，尾巴肌腱水解成膠凍狀凝膠，冰箱4℃保存。將酸解鼠尾膠原蛋白進(jìn)行sds-page檢測，結(jié)果顯示：i型膠原蛋白原液在相對(duì)分子量130kda附近有明顯條帶，另一條帶的相對(duì)分子量高于170kda(圖1)。

圖1所示，i型膠原蛋白原液在相對(duì)分子量130kda附近有明顯條帶，另一條帶的相對(duì)分子量高于170kda。

2.i型膠原蛋白膠體的制備：將i型膠原蛋白溶液，經(jīng)氨氣擴(kuò)散1小時(shí)，然后再放入0.05％戊二醛進(jìn)行交聯(lián)；交聯(lián)1小時(shí)后，i型膠原蛋白自組裝成半透明果凍樣膠體；最后將膠體放置在去離子水中浸泡1小時(shí)，接著再反復(fù)沖洗3遍，洗去多余的戊二醛，完成i型膠原蛋白膠體的制備。其膠體在透射電子顯微鏡下顯示：膠體內(nèi)部的膠原纖維具有特征性明暗間隔周期性條紋結(jié)構(gòu)，即d-band結(jié)構(gòu)。膠原染色d-band結(jié)構(gòu)周期為67nm，膠原分子長度為300nm；螺紋距長度為40nm，疊長度為27nm。此膠原纖維的d-band結(jié)構(gòu)與，天然骨組織的i型膠原蛋白纖維的d-band結(jié)構(gòu)一致(圖2)。

圖2透射電子顯微鏡顯示：膠體內(nèi)部的膠原纖維具有特征性明暗間隔周期性條紋結(jié)構(gòu)，即d-band結(jié)構(gòu)。膠原染色d-band結(jié)構(gòu)周期為67nm，膠原分子長度為300nm；螺紋距長度為40nm，疊長度為27nm。與天然骨組織的i型膠原蛋白纖維的d-band結(jié)構(gòu)一致。

3.礦化液的配置：

25ml鈣液：10mmcacl2.2h2o+150mmnacl+50mm.tris+0.02％nan3；25ml磷液：6mmna2hpo4；鈣液25ml倒入燒杯中，滴入paa濃度350ug/ml；滴加1m的hcl，調(diào)節(jié)ph至7.4。然后緩慢滴入磷液，約16滴/分鐘。

4.生物礦化：吸取已經(jīng)配好的礦化液倒入小培養(yǎng)皿中，將鼠尾i型膠原膠體浸泡在礦化液中，進(jìn)行生物礦化；礦化7天，顏色加深至乳白色，從而形成i型膠原/羥基磷灰石仿生骨。電子衍射圖像顯示：此時(shí)的膠原礦化已經(jīng)完成，羥基磷灰石鈣晶體形成，每個(gè)亮環(huán)對(duì)應(yīng)一個(gè)晶面依次是002,211,004(圖3)。在透射電子顯微鏡下顯示：黑色羥基磷灰石晶體，嵌入膠原蛋白纖維縱向生長，其分子結(jié)構(gòu)與人類自身骨組織一致(圖4)。

5.加載亞胺培南/西司他?。喝啺放嗄?西司他丁70mg，溶于10ml去離子水。將i型膠原/羥基磷灰石仿生骨，浸泡在亞胺培南/西司他丁溶液中，靜置在38度恒溫箱中一天；亞胺培南/西司他丁加載至i型膠原/羥基磷灰石仿生骨中，從而形成載亞胺培南i型膠原/羥基磷灰石仿生骨。抑菌圈實(shí)驗(yàn)顯示：將載亞胺培南i型膠原/羥基磷灰石仿生骨放置在耐藥型革蘭氏陰性菌大腸桿菌的培養(yǎng)基中，在載亞胺培南i型膠原/羥基磷灰石仿生骨周圍形成抑菌圈，抑菌圈直徑3.6cm(見圖5)。在模擬體液緩釋實(shí)驗(yàn)中：載亞胺培南i型膠原/羥基磷灰石仿生骨，緩釋的亞胺培南藥物濃度為2.5ug/ml,是亞胺培南/西司他丁對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度0.125ug/ml的20倍，遠(yuǎn)大于最低抑菌濃度。

實(shí)施例2-4

將實(shí)施例1中亞胺培南/西司他丁分別更換為美羅培南、厄他培南或比阿培南，最終分別制備得到載美羅培南的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨、載厄他培南的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨、載比阿培南的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨；其抑菌效果如下：

將載美羅培南的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨,放置在耐藥型革蘭氏陰性菌大腸桿菌的培養(yǎng)基中，在載美羅培南i型膠原/羥基磷灰石仿生骨周圍形成抑菌圈,抑菌圈直徑約2.7cm。

將載厄他培南的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨,放置在耐藥型革蘭氏陰性菌大腸桿菌的培養(yǎng)基中，在載厄他培南i型膠原/羥基磷灰石仿生骨周圍形成抑菌圈,抑菌圈直徑約1.3cm。

將載比阿培南的i型膠原/羥基磷灰石仿生骨,放置在耐藥型革蘭氏陰性菌大腸桿菌的培養(yǎng)基中，在載比阿培南i型膠原/羥基磷灰石仿生骨周圍形成抑菌圈,抑菌圈直徑約3.4cm。

上述實(shí)施例并非是對(duì)于本發(fā)明的限制，本發(fā)明并非僅限于上述實(shí)施例，只要符合本發(fā)明要求，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。