本發(fā)明屬于生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及白花菜巴布劑的抗炎、鎮(zhèn)痛活性及其制備方法。
背景技術(shù)：
白花菜(cleomegynandral.)為白花菜科白花菜屬一年生草本植物，在我國田野路邊常有分布，莖葉可食用，生物學(xué)名稱為花柳菜，也稱花菜或菜花，別名五梅草、羊角菜、臭菜等，主要含揮發(fā)油、三萜和黃酮等成分，富含對人體有益的多種微量元素和氨基酸。本發(fā)明將白花菜地上部分用甲醇提取后利用乙酸乙酯精制，得到的浸膏用水溶性高分子材料作為基質(zhì)制備成外用的巴布劑，并對其外觀性狀、初黏力、均勻性等進(jìn)行了考察，測試了體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛活性作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供白花菜巴布劑的抗炎、鎮(zhèn)痛活性及其制備方法。
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)白花菜巴布劑具有抗炎、鎮(zhèn)痛活性。
白花菜巴布劑的制備方法：稱取處方量羧甲基纖維素鈉(cmc-na)，加入適量蒸餾水，水浴加熱溶解，使成20％溶液，再加處方量甘油，攪勻，為a相；同法制得10％pva水溶液和10％明膠水溶液，分別為b相和c相；先將b相和c相混勻，再加入到a相，攪拌均勻后加研細(xì)的微粉硅膠和預(yù)熱的白花菜浸膏，趁熱涂布于無紡布上，置于電熱恒溫干燥箱中，70℃干燥2h，得白花菜巴布劑。
白花菜浸膏的制備方法：取白花菜地上部分20kg，陰干、粉碎，過篩后甲醇冷浸72h，過濾，殘?jiān)^續(xù)用甲醇提取3次，合并濾液與提取液，回收甲醇；將得到的浸膏用乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，得白花菜浸膏。
進(jìn)一步，羧甲基纖維素鈉1.0g、明膠0.8g、聚乙烯醇0.5g和微粉硅膠2.0g。
進(jìn)一步，載藥量為處方中基質(zhì)總量的40％，保濕劑甘油的用量為處方中加入水總體積的1/3。
本發(fā)明的有益效果是白花菜巴布劑具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛活性，可用于治療或緩解關(guān)節(jié)腫痛。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
1材料
1.1儀器
re-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，sg-301初粘性測試儀(蘇州市金戈檢測設(shè)備有限公司)，202-o電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，電子天平(bs224s，京制000000249號，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，kdm型調(diào)溫電熱套(山東省鄄城光明儀器有限公司)，pv-200足趾腫脹儀(成都泰盟軟件公司)，rb-200智能熱板儀(成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn))。
1.2藥品
白花菜(2015年8月上旬采自湖北省孝感，經(jīng)甘肅醫(yī)學(xué)院程亞青教授鑒定為白花菜cleomegynandral.)，甲醇(分析純，天津市百世化工有限公司)，乙酸乙酯(分析純，天津市百世化工有限公司)，15cm×10cm無紡布(揚(yáng)州洋生醫(yī)藥科技有限公司)，聚乙烯醇(實(shí)驗(yàn)試劑，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)，羧甲基纖維素鈉(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，明膠(生化試劑，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，微粉硅膠(青島海洋化工分析廠)，甘油(分析純，天津市百世化工有限公司)，硫化鈉(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，甲醛(分析純，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn))，云南白藥消炎鎮(zhèn)痛膏(云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號zla1520)。
1.3動(dòng)物
雄性wistar大鼠，體重180～220g；清潔級昆明種小鼠，雄性，體重18～22g，均購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號：(甘)2015-0001。
2白花菜浸膏的制備
取白花菜地上部分20kg，陰干、粉碎，過篩后甲醇冷浸72h，過濾，殘?jiān)^續(xù)用甲醇提取3次，合并濾液與提取液，回收甲醇；將得到的浸膏用乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，得白花菜浸膏1kg。
3白花菜巴布劑處方篩選
3.1白花菜巴布劑制備
稱取處方量cmc-na，加入適量蒸餾水，水浴加熱溶解，使成20％溶液，再加處方量甘油，攪勻，為a相；同法制得10％聚乙烯醇(pva)水溶液和10％明膠水溶液，分別為b相和c相；先將b相和c相混勻，再加入到a相，攪拌均勻后加研細(xì)的微粉硅膠和預(yù)熱的白花菜浸膏，趁熱涂布于無紡布上，置于電熱恒溫干燥箱中，70℃干燥2h，得白花菜巴布劑。
3.2白花菜巴布劑處方篩選
采用單因素實(shí)驗(yàn)考察白花菜巴布劑的處方組成及用量，對比了不同比例甘油的保濕效果，測試了不同劑量白花菜浸膏對于巴布劑性能的影響，結(jié)果顯示甘油用量為處方基質(zhì)需水總量的1/3，白花菜浸膏為基質(zhì)總重40％時(shí)，涂展性和保濕性良好并且皮膚殘留少；以初黏力、均勻性、涂展性、皮膚追隨性、氣泡狀態(tài)、透布程度等作為巴布劑質(zhì)量考察指標(biāo)，利用spss統(tǒng)計(jì)軟件安排正交試驗(yàn)并進(jìn)行分析(表1-5)，由表4、5可知，各因素用量的改變對結(jié)果都有顯著影響，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中因素b即pva的用量影響最大，巴布劑最佳處方為a3b2c2d3，cmc-na：pva：明膠：微粉硅膠重量比為1.0：0.8：0.5：2.0。
表1白花菜巴布劑正交實(shí)驗(yàn)因素水平表
表2白花菜巴布劑質(zhì)量考察指標(biāo)及評分標(biāo)準(zhǔn)
表3白花菜巴布劑正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表4白花菜巴布劑正交實(shí)驗(yàn)方差分析
r平方＝0.972(調(diào)整的r平方＝0.959)
表5白花菜巴布劑正交實(shí)驗(yàn)單因素分析
4白花菜巴布劑藥理活性研究
4.1方法
4.1.1造模與分組
大鼠110只，測量給藥前右后足趾容積，于皮下注射2.5％甲醛0.1ml，篩選足趾腫脹度0.3ml以上的大鼠(足趾腫脹度＝致炎后足趾容積-致炎前足趾容積)分為6組，分別為白花菜巴布劑高、中、低劑量組，陽性對照組，陰性對照組和空白對照組，每組至少10只，采用隨機(jī)法進(jìn)行染色編號。
利用智能熱板儀在55±0.5℃條件下，選取舔足時(shí)間5-30s之間的小鼠50只，隨機(jī)分為5組，分別為白花菜巴布劑高、中、低劑量組，陽性對照組和空白對照組，每組10只。
4.1.2脫毛
用剪刀將鼠背部毛剪短，用脫脂棉蘸取10％硫化鈉溶液，輕輕擦拭在剪毛部位，待被毛變?yōu)橄≤浀S色后用紗布蘸取清水擦拭2-3次，直至皮膚裸露，脫毛皮膚面積約2cm2。
4.1.3給藥與測量
將載有白花菜甲醇提取物40％、60％和90％的巴布劑分別剪成1cm2小片，作為高、中、低劑量藥物黏貼于對應(yīng)組大小鼠脫毛背部，用醫(yī)用膠帶固定，陽性對照組給予消炎鎮(zhèn)痛膏1cm2，陰性對照組和空白對照組不給藥。
大鼠每日背部敷貼白花菜巴布劑12小時(shí)，于同一時(shí)間段測量各組大鼠右后足趾容積，每只大鼠測量5次，取平均值，統(tǒng)計(jì)每只大鼠右后足趾容積減小0.3ml需要的時(shí)間；小鼠分別于給藥1、2、3小時(shí)用熱板法測定舔足時(shí)間作為痛閾值，大于60s的按照60s記錄。
利用spss統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，對比、考察藥物的抗炎鎮(zhèn)痛作用。
4.2結(jié)果與分析
陰性對照組致炎大鼠后右后足趾容積減小0.3ml的天數(shù)明顯長于白花菜巴布劑給藥組和陽性對照組，陽性藥物組、白花菜巴布劑各劑量組與陰性對照組均有顯著性差異(表6)，說明白花菜巴布劑對甲醛所致大鼠足腫脹有明顯抑制作用。
表6致炎大鼠足趾容積減小0.3ml的時(shí)間
注：與陰性對照組相比，ap<0.05。
由表7可見，白花菜各劑量組痛閾隨著給藥時(shí)間延長逐漸升高，3小時(shí)舔足時(shí)間最長，并且白花菜各劑量組、陽性藥物組較空白對照組均有顯著性差異，表明白花菜巴布劑能夠發(fā)揮一定的鎮(zhèn)痛作用。
表7給藥后各時(shí)間點(diǎn)小鼠舔足時(shí)間
注：與陰性對照組相比，ap<0.05,bp<0.01。
5討論與結(jié)論
預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，白花菜甲醇提取物經(jīng)乙酸乙酯萃取后得到的浸膏具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用，考慮用于緩解關(guān)節(jié)炎引起的腫痛，因關(guān)節(jié)處血流少，口服給藥需時(shí)較長、需藥量大，而局部敷貼給藥可以使藥物快速達(dá)到病灶，給藥方便，因此決定將白花菜浸膏制備成外用的巴布劑。基質(zhì)配方是巴布劑研究的基礎(chǔ)和核心，是制成優(yōu)良巴布劑的關(guān)鍵[24]，實(shí)驗(yàn)首先通過對比確定了基質(zhì)組成，后又利用正交實(shí)驗(yàn)確定其最佳配比，最終得到膏面平整、色澤均勻，氣泡少，粘性適宜的白花菜巴布劑。
甲醛溶液注射屬于化學(xué)性刺激，可使局部組織血管通透性增強(qiáng)，炎癥液體和蛋白質(zhì)外滲造成水腫，同時(shí)致使白細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素ⅰ、腫瘤壞死因子及前列腺素e等引起發(fā)熱。實(shí)驗(yàn)通過大鼠右后足趾皮下注射2.5％甲醛建立關(guān)節(jié)炎腫脹模型，背部敷貼白花菜巴布劑后考察右后足趾的消腫時(shí)間，與陰性組和空白組對比，揭示白花菜巴布劑的抗炎作用；并采用熱板法對比白花菜給藥組和未給藥組小鼠的痛閾值，評價(jià)其鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果表明，白花菜巴布劑具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛活性，可用于治療或緩解關(guān)節(jié)腫痛。
本發(fā)明將白花菜地上部分的甲醇提取物制備成巴布劑，優(yōu)選最佳處方組成及配比，并對其體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行考察。以初粘力、均勻性、涂展性、皮膚追隨性、氣泡狀態(tài)、透布程度綜合得分為考察指標(biāo)，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)篩選處方組成及最佳配比，并測試白花菜巴布劑對甲醛所致大鼠足腫脹的抗炎作用和對小鼠舔足時(shí)間的影響。藥理活性實(shí)驗(yàn)證明，白花菜巴布劑給藥組與未給藥組相比能夠明顯縮短大鼠腫脹足趾體積減小的時(shí)間，提高小鼠痛閾，差異具有顯著性意義。結(jié)論：最佳處方制備的白花菜巴布劑外觀平整，各項(xiàng)質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)均合格，具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛活性，可用于緩解關(guān)節(jié)腫痛。
以上所述僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施方式而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施方式所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。