本發(fā)明涉及納米技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米材料具有獨(dú)特的物理-化學(xué)性質(zhì)，近年來，基于納米材料的疾病診斷和治療開始受到人們的關(guān)注。納米材料常用的癌癥治療方式為光熱治療和化學(xué)治療，熱療和化療的協(xié)同應(yīng)用可以有效增強(qiáng)治療效果。為了達(dá)到精準(zhǔn)治療，一般將診斷和治療相結(jié)合。表面增強(qiáng)拉曼光譜(sers)具有靈敏度高、抗光漂白性好等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于細(xì)胞成像、癌癥診斷等方面。金納米顆粒生物相容性好，具有較高的sers活性和光熱性質(zhì)，在sers成像和光熱治療方面具有潛在的應(yīng)用前景。然而，金納米顆粒容易發(fā)生團(tuán)聚，sers效應(yīng)受環(huán)境影響較大；而且比表面積小，無法高效負(fù)載藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于，提供一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，所述復(fù)合材料同時具有sers成像、光熱治療、藥物治療三重功效，可有效實現(xiàn)診斷和治療的協(xié)同功能。

一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料，包括金納米顆粒核、金屬-有機(jī)骨架外殼和核酸適配體，所述金納米顆粒包覆于金屬-有機(jī)骨架外殼內(nèi)，所述核酸適配體接枝于金屬-有機(jī)骨架外殼表面。

本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料，引入4-巰基苯甲酸，4-巰基苯甲酸以去質(zhì)子的形式通過巰基端與金納米顆粒結(jié)合；4-巰基苯甲酸分子上的苯環(huán)通過金納米顆粒的增強(qiáng)作用可以產(chǎn)生良好的sers信號，具有拉曼標(biāo)記功能；4-巰基苯甲酸分子上的羧基可與金屬-有機(jī)骨架的前驅(qū)體cu²⁺絡(luò)合，具有橋連作用；因而，4-巰基苯甲酸的引入既提供了拉曼信號源，又提供了后續(xù)金屬-有機(jī)骨架修飾的結(jié)合位點(diǎn)，因此該合成方法具有集合成與修飾為一體的優(yōu)點(diǎn)，避免了合成材料后再修飾拉曼標(biāo)記分子的繁瑣。通過4-巰基苯甲酸的橋連作用將金屬-有機(jī)骨架包覆于金納米顆粒的表面，避免了裸金納米顆粒團(tuán)聚引起拉曼信號重現(xiàn)性差的問題，提高復(fù)合材料的穩(wěn)定性，保證sers成像；并且，金屬離子及有機(jī)配體的作用位點(diǎn)能夠與特定的化合物分子等客體作用，有效負(fù)載藥物等，此外，金屬-有機(jī)骨架外殼具有多孔性，有效提高了復(fù)合材料的載藥率。金屬-有機(jī)骨架表面殘留的羧基與核酸適配體上的氨基通過羧基-氨基縮合反應(yīng)，使核酸適配體通過化學(xué)鍵固定接枝于金屬-有機(jī)骨架，從而使所述復(fù)合材料能作用于蛋白質(zhì)、小分子化合物、細(xì)胞膜表面受體等靶標(biāo)，使復(fù)合材料具有優(yōu)異的生物相容性及靶向識別性能。此外，該復(fù)合材料在近紅外存在吸收，可以將吸收的近紅外光能轉(zhuǎn)化為熱量，從而可以對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行光熱治療。

進(jìn)一步地，所述核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的粒徑為40-55nm。所述復(fù)合材料為納米級尺寸，能有效進(jìn)入細(xì)胞成像，且納米尺寸的比表面積大，對藥物的吸附量更大。

進(jìn)一步地，所述金納米顆粒的尺寸為40-50nm；所述金屬-有機(jī)骨架是銅和均苯三甲酸配位組裝的金屬-有機(jī)骨架；所述核酸適配體為抗肺癌細(xì)胞a549適配體，其堿基序列為5'-nh2-(ch2)6-ggttgcatgccgtggggaggggggtgggttttatagcgtactcag-3'。

進(jìn)一步地，所述金屬-有機(jī)骨架外殼的厚度為2-3nm。

一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟：

s1：采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備金納米顆粒；

s2：向步驟s1制得的金納米顆粒的溶液中加入巰基化試劑，攪拌反應(yīng)后，離心分離得到巰基修飾的金納米顆粒；

s3：將步驟s2制備得到的巰基修飾的金納米顆粒分散于醇類溶劑中，加入乙酸銅，超聲后離心分離取沉淀物再分散于醇類溶劑中，加入均苯三甲酸，超聲進(jìn)行配位反應(yīng)，離心分離得到核殼型復(fù)合材料；

s4：將步驟s3制得的核殼型復(fù)合材料分散于tris-hcl緩沖液中，加入交聯(lián)劑，攪拌反應(yīng)后，離心分離得到沉淀物，將沉淀物加入含有核酸適配體的pbs溶液中，低溫反應(yīng)后，離心分離得到核酸適配體修飾的核殼型復(fù)合材料。

進(jìn)一步地，步驟s2中，所述巰基化試劑為4-巰基苯甲酸。

進(jìn)一步地，步驟s4中，所述交聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺。

進(jìn)一步地，步驟s2中，所述金納米顆粒在水中的分散濃度為50mg/l；所述金納米顆粒與巰基化試劑的質(zhì)量比為0.6:1。

進(jìn)一步地，步驟s3中，所述巰基修飾的金納米顆粒在醇類溶劑中的分散濃度為300mg/l；所述巰基修飾的金納米顆粒、乙酸銅、均苯三甲酸的質(zhì)量比為0.03:1:1。

進(jìn)一步地，步驟s4中，所述核殼型復(fù)合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為0.24:2:1。

本發(fā)明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在癌細(xì)胞靶向成像中的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞為a549細(xì)胞。

本發(fā)明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在光熱治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在抗腫瘤藥物負(fù)載及緩釋中的應(yīng)用，所述的抗腫瘤藥物為阿霉素、紫杉酮、喜樹堿、酞菁、表柔比星、柔紅霉素、甲氨蝶呤中的一種物質(zhì)或多種的混合物。所述復(fù)合材料中的金屬-有機(jī)骨架，具有多孔性，且比表面積大，當(dāng)特定的客體分子的空間立體尺寸與金屬-有機(jī)骨架的尺寸相匹配時，且金屬-有機(jī)骨架中的金屬離子和有機(jī)配體與所述客體分子之間通過配位作用或π-π作用，使所述復(fù)合材料可有效負(fù)載大量的特定藥物。并且，所述金屬-有機(jī)骨架暴露的羧基等作用位點(diǎn)還可進(jìn)一步修飾其他適配體或抗體等識別元素，進(jìn)一步為所述復(fù)合材料提供靶向性能。

本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料，引入4-巰基苯甲酸，4-巰基苯甲酸以去質(zhì)子的形式通過巰基端與金納米顆粒結(jié)合；4-巰基苯甲酸分子上的苯環(huán)通過金納米顆粒的增強(qiáng)作用可以產(chǎn)生良好的sers信號，具有拉曼標(biāo)記功能；4-巰基苯甲酸分子上的羧基可與金屬-有機(jī)骨架的前驅(qū)體cu²⁺絡(luò)合，具有橋連作用。4-巰基苯甲酸的引入既提供了拉曼信號源，又提供了后續(xù)mofs修飾的結(jié)合位點(diǎn)，因此該合成方法集合成與修飾為一體的優(yōu)點(diǎn)，避免了合成材料后再修飾拉曼標(biāo)記分子的繁瑣。所述核酸適配體修飾核殼復(fù)合材料的具有光熱治療的功效。

所述復(fù)合材料表面修飾核酸適配體，能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合；所述金屬-有機(jī)框架的金屬位點(diǎn)能夠有效與藥物中的氨基或羧基基團(tuán)進(jìn)行配位，從而對特定藥物的負(fù)載，實現(xiàn)藥物治療；并且采用均苯三甲酸作為有機(jī)配體，增加比表面積，提高吸附性能，能夠提高藥物負(fù)載率。因而，所述核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料可通過sers進(jìn)行診斷，并能夠負(fù)載藥物進(jìn)行治療，實現(xiàn)診斷和治療的協(xié)同功能，為疾病的早期診斷和治療等領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)。

并且，所述金屬-有機(jī)框架包覆于金納米顆粒的表面，避免了金納米顆粒的自發(fā)團(tuán)聚，提高了金納米顆粒的穩(wěn)定性。

為了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的合成示意圖；

圖2為本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的透射電鏡掃描圖；

圖3為本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在不同濃度的nacl溶液中的拉曼光譜圖；

圖4為本發(fā)明的不同濃度的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在激光照射下的升溫速率圖；

圖5為本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的藥物體外釋放曲線圖；

圖6為本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料對a549細(xì)胞和beas-2b細(xì)胞的sers成像圖；

圖7為向a549細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入不同組樣品培養(yǎng)后所得的細(xì)胞存活率圖。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料，包括金納米顆粒核、金屬-有機(jī)骨架外殼和核酸適配體，所述金納米顆粒包覆于金屬-有機(jī)骨架外殼內(nèi)，所述核酸適配體接枝于金屬-有機(jī)骨架外殼表面。所述核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的粒徑為40-55nm。所述金屬-有機(jī)骨架外殼的厚度為2-3nm。

本發(fā)明所述的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟：

s1：采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備金納米顆粒；

s2：向步驟s1制得的金納米顆粒的溶液中加入巰基化試劑，攪拌反應(yīng)后，離心分離得到巰基修飾的金納米顆粒；

s3：將步驟s2制備得到的巰基修飾的金納米顆粒分散于醇類溶劑中，加入乙酸銅，超聲后離心分離取沉淀物再分散于醇類溶劑中，加入均苯三甲酸，超聲進(jìn)行配位反應(yīng)，離心分離得到核殼型復(fù)合材料；

s4：將步驟s3制得的核殼型復(fù)合材料分散于tris-hcl緩沖液中，加入交聯(lián)劑，攪拌反應(yīng)后，離心分離得到沉淀物，將沉淀物加入含有核酸適配體的pbs溶液中，低溫反應(yīng)后，離心分離得到核酸適配體修飾的核殼型復(fù)合材料。

具體的，所述巰基化試劑為4-巰基苯甲酸。所述交聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺。

步驟s2中，所述金納米顆粒在水中的分散濃度為50mg/l；所述金納米顆粒與巰基化試劑的質(zhì)量比為0.6:1。步驟s3中，所述巰基修飾的金納米顆粒在醇類溶劑中的分散濃度為300mg/l；所述巰基修飾的金納米顆粒、乙酸銅、均苯三甲酸的質(zhì)量比為0.03:1:1。步驟s4中，所述核殼型復(fù)合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為0.24:2:1。

本發(fā)明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在癌細(xì)胞靶向成像中的應(yīng)用，所述癌細(xì)胞為a549細(xì)胞。

本發(fā)明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在光熱治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在負(fù)載藥物及藥物緩釋中的應(yīng)用，所述的負(fù)載藥物為阿霉素、紫杉酮、喜樹堿、酞菁、表柔比星、柔紅霉素、甲氨蝶呤中的一種物質(zhì)或多種的混合物。

實施例1

核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用

本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料包括金納米顆粒核、金屬-有機(jī)骨架外殼和核酸適配體，所述金納米顆粒包覆于金屬-有機(jī)骨架外殼內(nèi)，所述核酸適配體接枝于金屬-有機(jī)骨架外殼表面。

請參閱圖1，其是本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的合成示意圖，所述核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟s1：采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備金納米顆粒；具體的，取200ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％氯金酸溶液加到500ml三口燒瓶中，加熱至145℃，加熱過程中保持磁力攪拌和冷凝回流，加熱至劇烈沸騰狀態(tài)后，迅速加入1.46ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌回流40min后，攪拌冷卻至室溫，得到分散于水溶液中的金納米顆粒。

步驟s2：取12ml步驟s1中制備得到的金納米顆粒的分散液，邊攪拌邊向其中加入120μl濃度為0.05mol/l的4-巰基苯甲酸的乙醇溶液，持續(xù)攪拌2h后，在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心8min，用乙醇清洗一次，離心棄去上清液，將離心得到的沉淀物分散在2ml的乙醇中，得到分散于乙醇中的巰基修飾的金納米顆粒。

步驟s3：取2ml的步驟s2中得到的分散于乙醇中的巰基修飾的金納米顆粒，向其中加入10ml濃度為10mmol/l的乙酸銅的乙醇溶液，超聲10min，在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心8min，再用乙醇清洗一次，離心棄去上清液，將離心得到的沉淀物分散在2ml的乙醇中，加入10ml濃度為10mmol/l的均苯三甲酸的乙醇溶液，超聲10min，于75℃下反應(yīng)20min；在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心6min，用移液槍棄去上層清液，再用乙醇清洗一次，離心棄去上層清液，離心得到的沉淀物分散于tris-hcl緩沖液中，得到核殼型復(fù)合材料。

步驟s4：向步驟s3得到的分散于tris-hcl緩沖液中的核殼型復(fù)合材料中加入5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和2.5mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，攪拌反應(yīng)12h；反應(yīng)結(jié)束后，在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心6min，用移液槍棄去上層清液，再用去離子水清洗一次，棄去上清液，將沉淀物加入含有核酸適配體的pbs溶液中，于4℃下反應(yīng)12h；反應(yīng)結(jié)束后，在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心6min，用移液槍棄去上層清液，將沉淀用pbs清洗一次后，得到核酸適配體修飾的核殼型復(fù)合材料。

將上述得到的核酸適配體修飾的核殼型復(fù)合材料分散在2ml的pbs溶液中，進(jìn)行超聲處理0.5h，然后滴在銅網(wǎng)上，晾干后進(jìn)行透射電鏡掃描。請參閱圖2，其是所述核酸適配體修飾的核殼型復(fù)合材料的透射電鏡掃描圖。從圖中可以看出，所述復(fù)合材料為核殼結(jié)構(gòu)，粒徑大小約50nm，金屬-有機(jī)骨架外殼的厚度為2-3nm，復(fù)合材料殼體的尺寸均一，分散性好。

實施例2

(1)核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的表面拉曼光譜的穩(wěn)定性

用ph為7.4的pbs溶液配制濃度為5mg/l的核酸適配體修飾的核殼型復(fù)合材料的pbs溶液，將復(fù)合材料的pbs溶液與不同濃度的nacl溶液按照體積比為8:2混合，所述nacl的濃度依次為為0.01、0.05、0.1、0.5mol/l?；旌虾?，均于37℃下攪拌2h，然后采集拉曼光譜。請參閱圖3，其是所述核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在不同濃度的nacl溶液中的拉曼光譜圖。從圖中可知，隨著nacl濃度的增加，所述核酸適配體修飾的核殼型復(fù)合材料的拉曼光譜未發(fā)生明顯變化，說明所述復(fù)合材料在鹽溶液中具有較好的sers穩(wěn)定性。

(2)核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的光熱性能

配制濃度分別為1mg/l、5mg/l、10mg/l的復(fù)合材料的pbs溶液，然后分別取1ml加入樣品管中，用808nm波長的激光照射(功率為0.5w/cm²)，每隔一段時間記錄溫度變化。請參閱圖4，其是不同濃度的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在激光照射下的升溫速率圖。從圖中可以看出，各個濃度的溶液隨著照射時間的增加逐漸升溫，并且，10mg/l的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料溶液在光照60min后溫度升溫了22.8℃，說明其光熱轉(zhuǎn)化效果較好。

(3)核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的負(fù)載藥物-藥物緩釋功能

將100μl的1mg/ml的阿霉素(dox)加入5ml的濃度為50mg/l的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的pbs溶液中，于25℃暗處下攪拌反應(yīng)24h，然后離心分離，收集上清液，根據(jù)dox吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線和dox負(fù)載前后在480nm處的吸光值，計算dox的負(fù)載率，得dox的負(fù)載率為57.0％。

然后將負(fù)載有dox的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料分散于pbs溶液中，pbs溶液的ph分別為7.4和5.5，每隔一定時間，離心取上清液測定紫外，通過480nm處的紫外吸收值計算dox隨時間的釋放量。請參閱圖5，其是所述核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的藥物體外釋放曲線圖。從圖中可以看出，相較于ph＝7.4的中性環(huán)境，ph＝5.5的酸性環(huán)境中dox的釋放量更大，ph＝5.5的條件下，10h時dox的釋放量為48％，而ph＝7.4的條件下，10h時dox的釋放量僅為9.7％，說明酸性條件更有利于dox的釋放。

實施例3

(1)核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在sers成像中的應(yīng)用

將5mg/l的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料分別加入肺癌細(xì)胞a549和正常肺細(xì)胞beas2b培養(yǎng)液中，孵育30min，在激光533nm下進(jìn)行拉曼成像測試。請參閱圖6，其是本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料對a549細(xì)胞和beas-2b細(xì)胞的sers成像圖。從圖中可以看出，所述復(fù)合材料與a549細(xì)胞孵育后，可以觀察到明顯的sers信號，而將復(fù)合材料與beas2b細(xì)胞孵育后，sers信號很弱，說明所述核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料對肺癌細(xì)胞a549具有靶向成像功能。

(2)核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在熱療-化療復(fù)合治療中的應(yīng)用

取6組相同濃度(20mg/l)的不同樣品的pbs溶液分別加入細(xì)胞a549的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1h，所述樣品及處理方式分別如下表：

請參閱圖7，其是向a549細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入不同組樣品培養(yǎng)后所得的細(xì)胞存活率圖。第1組樣品為僅進(jìn)行光照，細(xì)胞存活率沒有發(fā)生明顯變化，說明僅進(jìn)行光照對細(xì)胞的存活率無明顯影響。比較第2組和第4組，激光照射后，核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料升溫會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。比較第3組和第5組，負(fù)載dox的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料比dox會引起更多的細(xì)胞死亡，這主要是因為，負(fù)載dox的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料是以主動內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞，而dox是以被動擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞，而主動內(nèi)吞比被動擴(kuò)散的吸收更好。比較第3組、第4組和第6組，第6組的藥物治療結(jié)合光熱治療的效果比第3組僅進(jìn)行藥物治療或第4組僅進(jìn)行光熱治療的效果好，這是因為dox藥物治療和核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料的光熱治療產(chǎn)生了協(xié)同作用使細(xì)胞存活率降低，而且核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料在細(xì)胞內(nèi)局部濃度更高，協(xié)同作用更明顯，因此第6組的細(xì)胞存活率最低，進(jìn)一步說明了本發(fā)明的核酸適配體修飾核殼型復(fù)合材料能夠用于光熱治療和負(fù)載藥物及藥物緩釋中。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。