本發(fā)明屬于復(fù)合生物材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種vegf轉(zhuǎn)染膠原蛋白組織修復(fù)材料的制備方法。
背景技術(shù)：
生物材料發(fā)展至今已經(jīng)經(jīng)歷了三個(gè)主要階段。自20世紀(jì)80年代以來，以醫(yī)療、保健及增進(jìn)生活質(zhì)量等為目的的生物醫(yī)用材料取得了快速的發(fā)展，已經(jīng)有超過50種植入器械被應(yīng)用于臨床，一般來源于技術(shù)成熟的工程材料，并且具有生物相容性和缺損組織替代功能，例如已廣泛應(yīng)用于臨床的心人工血管、人工關(guān)節(jié)和人工腎等。上述生物醫(yī)用材料，具有一個(gè)普遍的共性:生物惰性。即生物醫(yī)用材料發(fā)展所遵循的原則是盡量將受體對植入器械的異物反應(yīng)降到最低。從上世紀(jì)80年代到90年代，生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的重點(diǎn)逐漸由生物惰性轉(zhuǎn)向生物活性和可控降解性，開發(fā)了第二代生物醫(yī)用材料及產(chǎn)品。
20世紀(jì)90年代后期，第三代生物材料是伴隨著組織工程學(xué)的建立、發(fā)展而迅速發(fā)展起來的。以組織工程生物材料支架為代表，其綜合了工程科學(xué)和生命科學(xué)原理，為種子細(xì)胞提供了適合其生長、基質(zhì)合成及發(fā)揮其他功能的生物學(xué)空間，克服了以往單一的細(xì)胞移植中細(xì)胞不易成活、基質(zhì)合成能力低下等缺點(diǎn)，為組織工程化組織的構(gòu)建提供了細(xì)胞載體和結(jié)構(gòu)支架。這類生物醫(yī)用材料將生物活性材料與可降解材料這兩個(gè)獨(dú)立的概念結(jié)合起來，在可降解材料上進(jìn)行分子修飾，引起細(xì)胞整合素的相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化，以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與組裝。但目前所應(yīng)用于組織工程的生物材料的性能還有待進(jìn)一步提高，不能滿足現(xiàn)代醫(yī)藥的需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種vegf轉(zhuǎn)染膠原蛋白組織修復(fù)材料的制備方法，進(jìn)一步提高了組織修復(fù)材料的細(xì)胞粘附性及生物活性。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種vegf轉(zhuǎn)染膠原蛋白組織修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：將1mllb液體培養(yǎng)基和20μl、10％v/v葡萄糖置于離心管中，將1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到離心管中，置于30℃，120-260rpm/min，震蕩培養(yǎng)過夜，得vegf懸液；
步驟二：將350mg明膠溶解于60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解制得明膠溶液；
步驟三：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二酰亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恒溫水槽中40℃攪拌48小時(shí)后，將溶液置于透析袋中，放入盛有超純水的燒杯中，并置于電熱恒溫水槽于40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟四：取出透析袋中殘留的溶液，置于-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置于凍干機(jī)上干燥48h，得粘附性明膠；
步驟五：將粘附性明膠制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調(diào)節(jié)水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟六：將3mg/ml的膠原蛋白溶液與10×pbs以4:1的體積比在4℃下充分混勻，用0.1mnaoh調(diào)節(jié)ph至8,向溶液中加入nah2po4及nacl,并使膠原蛋白溶液的終濃度為2mg/ml，nah2po4的終濃度為10mm，nacl的終濃度為100mm，然后將溶液轉(zhuǎn)置35℃水浴反應(yīng)24h；
步驟七：反應(yīng)結(jié)束后，離心除去上清液，并將沉淀溶于蒸餾水中，透析除鹽，即得纖維化的膠原蛋白溶液；
步驟八：稱取棉短絨，將其溶解在氫氧化鋰/尿素水溶液中，配制成質(zhì)量濃度4％的纖維素溶液，所述的氫氧化鋰/尿素水溶液采用氫氧化鋰8.76g、尿素12g及水79.24g配制而成，并加入膠原蛋白溶液充分?jǐn)嚢杈鶆?、過濾、靜置24h，于20kv條件下靜電紡絲得膠原蛋白纖維膜；
步驟九：將多巴胺修飾溶液均勻噴涂于膠原蛋白纖維膜表面，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸鹽緩沖液(pbs)漂洗3次；
步驟十：將膠原蛋白纖維膜浸泡于vegf懸液中48h得vegf轉(zhuǎn)染膠原蛋白組織修復(fù)材料。
步驟一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化學(xué)研究所伊藤ナノ醫(yī)工學(xué)研究室提供。
優(yōu)選的，步驟三中所述的透析袋殘留分子量為10000da。
優(yōu)選的，所述的步驟三中超純水用量為漫過透析袋。
優(yōu)選的，步驟九中噴涂的厚度為5-30nm。
本發(fā)明的有益效果在于：
1)多巴胺是神經(jīng)激素中的一種化合物，含有豐富的乙氨基和兒茶酚活性官能團(tuán)，幾乎能粘附在任何機(jī)體的表面，尤其對于有機(jī)表面效果更佳。多巴胺修飾后的明膠的黏附性較高，且在材料表面上形成了聚合的多巴胺-明膠層。多巴胺的修飾，不僅提高了固定的明膠的含量，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞的粘附，加強(qiáng)了材料表面的細(xì)胞相容性。
2)明膠分子結(jié)構(gòu)上含有大量的羥基及少量的羧基和氨基，具有極強(qiáng)的親水性。因此，明膠分子中的羧基可以與多巴胺的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)。明膠具有其他合成材料無法比擬的生物相容性、可降解性以及生物活性。
3)vegf又稱血管通透性生長因子是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的促血管生成細(xì)胞生長因子，明膠可以和生長因子相互作用而結(jié)合在一起，可以有效提高組織修復(fù)材料上生長因子的數(shù)量。
4)纖維素作為一種生物材料，具有良好的生物適應(yīng)性和生物活性，能作用于創(chuàng)面修復(fù)的多個(gè)環(huán)節(jié)，促進(jìn)創(chuàng)面的快速愈合。以纖維素為原料制成的傷口敷料柔軟透明、舒適；有良好的通透性，能為創(chuàng)面提供濕潤、微酸的修復(fù)環(huán)境；能調(diào)節(jié)創(chuàng)面氧張力，促進(jìn)毛細(xì)血管形成，從而加速傷口的愈合。
5)膠原蛋白本身就是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原蛋白能與細(xì)胞或周圍基質(zhì)相互作用，表現(xiàn)出良好的協(xié)調(diào)性；膠原蛋白分子內(nèi)和分子間的共價(jià)交聯(lián)賦予了膠原蛋白較高強(qiáng)度的機(jī)械性能；膠原蛋白可以和血小板粘合，凝聚形成血栓而阻止血流，從而起到止血的效果；膠原蛋白的網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)對細(xì)胞起錨定、支持作用，能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和遷移。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
一種vegf轉(zhuǎn)染膠原蛋白組織修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：將1mllb液體培養(yǎng)基和20μl、10％v/v葡萄糖置于離心管中，將1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到離心管中，置于30℃，120-260rpm/min，震蕩培養(yǎng)過夜，得vegf懸液；
步驟二：將350mg明膠溶解于60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解制得明膠溶液；
步驟三：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二酰亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恒溫水槽中40℃攪拌48小時(shí)后，將溶液置于透析袋中，透析袋殘留分子量為10000da，將透析袋放入盛有超純水的燒杯中，超純水用量為漫過透析袋的位置，并將燒杯置于電熱恒溫水槽于40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟四：取出透析袋中殘留的溶液，置于-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置于凍干機(jī)上干燥48h，得粘附性明膠；
步驟五：將粘附性明膠制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調(diào)節(jié)水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟六：將3mg/ml的膠原蛋白溶液與10×pbs以4:1的體積比在4℃下充分混勻，用0.1mnaoh調(diào)節(jié)ph至8,向溶液中加入nah2po4及nacl,并使膠原蛋白溶液的終濃度為2mg/ml，nah2po4的終濃度為10mm，nacl的終濃度為100mm，然后將溶液轉(zhuǎn)置35℃水浴反應(yīng)24h；
步驟七：反應(yīng)結(jié)束后，離心除去上清液，并將沉淀溶于蒸餾水中，透析除鹽，即得纖維化的膠原蛋白溶液；
步驟八：稱取棉短絨，將其溶解在氫氧化鋰/尿素水溶液中，配制成質(zhì)量濃度4％的纖維素溶液，所述的氫氧化鋰/尿素水溶液采用氫氧化鋰8.76g、尿素12g及水79.24g配制而成，并加入膠原蛋白溶液充分?jǐn)嚢杈鶆颉⑦^濾、靜置24h，于20kv條件下靜電紡絲得膠原蛋白纖維膜；
步驟九：將多巴胺修飾溶液均勻噴涂于膠原蛋白纖維膜表面，噴涂的厚度為5-30nm，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸鹽緩沖液(pbs)漂洗3次；
步驟十：將膠原蛋白纖維膜浸泡于vegf懸液中48h得vegf轉(zhuǎn)染膠原蛋白組織修復(fù)材料。
步驟一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化學(xué)研究所伊藤ナノ醫(yī)工學(xué)研究室提供。
細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)：取培養(yǎng)的huvec細(xì)胞，消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×103cell/ml密度接種在實(shí)施例1制得的組織修復(fù)材料及空白對照組膠原蛋白材料上，每孔1ml，接種0.5h、1h、2h后，用無菌的pbs溶液漂洗，鏡下觀察并照相計(jì)數(shù)，結(jié)果見下表1。可以看出經(jīng)過多巴胺修飾后的膠原蛋白組織修復(fù)材料所粘附的細(xì)胞數(shù)量明顯多于沒有經(jīng)過修飾的空白對照組的細(xì)胞數(shù)量。
表1
細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取培養(yǎng)的huvec細(xì)胞，消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×103cell/ml密度接種在實(shí)施例1制得的組織修復(fù)材料及空白對照組膠原蛋白材料上，每孔1ml，隔兩天換液，接種5day后，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒wst-8檢測材料表面的細(xì)胞活性，結(jié)果見表2，可以得出經(jīng)過多巴胺修飾后的膠原蛋白組織修復(fù)材料的細(xì)胞活性略高于空白實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活性。
表2