本發(fā)明屬于醫(yī)用材料
技術領域：
，具體涉及一種分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架及其制備方法。
背景技術：
：近年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷已成為臨床案例中的常見現(xiàn)象，其中脊髓損傷導致的身體功能性缺失給患者帶來較大的傷害，也給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。脊髓損傷的治療一直是一個世界性的難題，目前臨床上使用的自體神經(jīng)移植物的治療手段對脊髓損傷的療效非常有限，迫切需要研發(fā)出新的更為有效的治療手段，因此，組織工程技術修復脊髓損傷成為神經(jīng)科學的前沿課題之一。殼聚糖作為一種天然高分子，其生物相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關注，被應用于醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫(yī)學工程等諸多領域。蠶絲微纖維對人體無毒害作用，安全可靠，具有良好的生物相容性，適于開發(fā)成功能性材料，它可應用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、化工等眾多領域。明膠是非常重要的天然生物高分子材料之一，是膠原的部分水解產(chǎn)物，價廉易得，具有良好的生物相容性和可降解性，已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥及化工產(chǎn)業(yè)。雖然殼聚糖、明膠和蠶絲微纖維具備上述各優(yōu)點，但目前將殼聚糖、明膠和蠶絲微纖維的混合物或聚合物用于制備脊髓支架鮮見報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架及其制備方法，材料價格低廉，制備方法簡單易于操作，避免使用交聯(lián)劑產(chǎn)生的細胞毒副作用，生物相容性好，適用于脊髓組織細胞附著，體內(nèi)易于代謝。為解決上述技術問題，本發(fā)明的實施例提供一種分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架，每100ml的脊髓支架制備溶液中含有如下組分：殼聚糖0.1~1g、2%醋酸溶液1~20ml、10%明膠溶液0.5~5ml、蠶絲微纖維0.05~0.5g、以及將上述原料的混合液中和至中性的5%氫氧化鈉溶液。進一步，每100ml的脊髓支架制備溶液中含有如下組分：殼聚糖0.3~0.6g、2%醋酸溶液5~12ml、10%明膠溶液1~3ml、蠶絲微纖維0.1~0.4g、以及將上述原料的混合液中和至中性的5%氫氧化鈉溶液。優(yōu)選地，每100ml的脊髓支架制備溶液中含有如下組分：殼聚糖0.45g、2%醋酸溶液8ml、10%明膠溶液2ml、蠶絲微纖維0.2g、以及將上述原料的混合液中和至中性的5%氫氧化鈉溶液。其中，所述蠶絲微纖維的制備方法包括如下三階段：a、從繭制備脫膠絲纖維；b、將脫膠絲纖維水解成微米級絲纖維；c、絲纖維洗滌、中和和凍干成絲纖維粉末。進一步，階段b、將脫膠絲纖維水解成微米級絲纖維的具體步驟為：將氫氧化鈉加入到蒸餾水中，當30%~40%的naoh放熱反應溶解時，加入干燥的脫膠絲纖維并用刮刀攪拌，進行水解，所述氫氧化鈉、蒸餾水和脫膠絲纖維的重量比為1：2.5~3.5：0.15~0.25；階段c、絲纖維洗滌、中和和凍干成絲纖維粉末的具體步驟為：c-1、將8~10倍于蒸餾水體積的水加入到階段b的反應混合物中，并以離心力2500~3000xg離心5~8分鐘；c-2、棄上清液，將絲纖維再懸浮于8~10倍于蒸餾水體積的水中，攪拌并離心；c-3、重復5~8次步驟c-2，除去過量堿；c-4、測量ph值，并使用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.0；c-5、將中和的絲纖維溶液再次以3000~4000rpm離心5~20min并重懸于水中，重復3~5次，最后將纖維懸浮在pbs中并凍干，得到絲纖維粉末。優(yōu)選地，階段b、將脫膠絲纖維水解成微米級絲纖維的具體步驟為：將1.75g的氫氧化鈉加入到5ml蒸餾水中，當大約35%的naoh放熱反應溶解時，加入0.35g的干燥的脫膠絲纖維并用刮刀攪拌，進行水解。為獲得400~500μm和中等150~200μm超細纖維，水解反應的時間分別進行30s和180s。為了獲得10~20μm的絲纖維，將反應混合物置于沸水浴中60s以幫助快速水解；階段c、絲纖維洗滌、中和和凍干成絲纖維粉末的具體步驟為：c-1、將45ml水加入到階段b的反應混合物中，并以離心力2800xg離心5分鐘；c-2、棄上清液，將絲纖維再懸浮于50ml水中，攪拌并離心；c-3、重復5~8次步驟c-2，除去過量堿；c-4、測量ph值，并使用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.0；c-5、將中和的絲纖維溶液再次以3500rpm離心5min并重懸于水中，重復3~5次，最后將纖維懸浮在pbs中并凍干，得到絲纖維粉末。其中，所述2%醋酸溶液由純水中加入醋酸配制而成，所述醋酸和純水的體積百分比為1:49；所述10%明膠溶液由明膠和純水配制而成，所述明膠和純水的質(zhì)量百分比為1:9；所述5%氫氧化鈉溶液由氫氧化鈉和純水配制而成，所述氫氧化鈉和純水的質(zhì)量百分比為1:19。本發(fā)明實施例還提供一種上述的分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架的制備方法，包括如下步驟：（1）制備殼聚糖-醋酸溶液：取配方量的殼聚糖溶解于2%醋酸溶液中，靜置過夜，加熱攪拌使其完全溶解；（2）稱取配方量的10%明膠溶液，將10%明膠溶液緩慢倒入步驟（1）制備的殼聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒加熱攪拌充分溶解；（3）稱取配方量的蠶絲微纖維，加入步驟（2）所得混合液中，65°c超聲攪拌，使其充分溶解；（4）利用5ml注射器吸取步驟（3）的脊髓支架制備溶液，注射到分區(qū)式組織工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制備液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱冷凍；（5）取出步驟（4）冰箱內(nèi)的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外層，形成包裹內(nèi)芯的后期脊髓模具，將后期脊髓模具輕輕放入含有5%氫氧化鈉溶液的玻璃大皿中，中和，用純水清洗至中性；（6）用鑷子把步驟（5）中清洗至中性的后期脊髓模具夾入凍干瓶中，蓋好瓶塞，水平放入冰箱，冷凍；（7）取出步驟（6）中冷凍后的凍干瓶，利用冷凍干燥機將凍干瓶完全凍干后，自冷凍干燥機上取下凍干瓶，并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的內(nèi)芯，得到分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架；（8）將制備好的分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架放入到密封袋中，標記好名稱和制備時間，于陰涼、干燥處長期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，備用。優(yōu)選地，上述的分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架的制備方法，包括如下步驟：(1)′制備殼聚糖-醋酸溶液：0.45g殼聚糖溶解于8ml的2%醋酸溶液中，靜置過夜，使其完全溶解；(2)′稱取2ml的10%明膠溶液，將10%明膠溶液緩慢倒入步驟(1)′制備的殼聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒充分攪拌溶解；(3)′稱取0.2g的蠶絲微纖維，加入步驟(2)′所得混合液中，65°c超聲攪拌2.5h，使其充分溶解；(4)′利用1ml注射器吸取0.8ml步驟(3)′的脊髓支架制備溶液，注射到分區(qū)式組織工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制備液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱內(nèi)，-20℃冷凍過夜；(5)′取出步驟(4)′冰箱內(nèi)的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外層，形成包裹內(nèi)芯的后期脊髓模具，將后期脊髓模具輕輕放入含有5%氫氧化鈉溶液的玻璃大皿中，中和2h后，用純水清洗后期脊髓模具15min/次，洗滌8次，至ph試紙檢測浸洗后的水為中性；(6)′用鑷子把步驟(5)′中清洗至中性的后期脊髓模具夾入凍干瓶中，蓋好瓶塞，水平放入冰箱，-20℃冷凍2h；(7)′打開冷凍干燥機，接通冷凍干燥機與真空泵，待冷凍干燥機內(nèi)溫度降至-40℃以下、真空降至0.02pa時，將步驟(6)′中凍干瓶移到冷凍干燥機內(nèi)，凍干2h，待凍干瓶完全凍干后，取下凍干瓶并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的內(nèi)芯，得到分區(qū)式殼聚糖-明膠-聚乙二醇脊髓支架；(8)′將制備好的分區(qū)式殼聚糖-明膠-聚乙二醇脊髓支架放入到密封袋中，標記好名稱和制備時間，于陰涼、干燥處長期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，備用。其中，所述分區(qū)式組織工程脊髓模具包括模具外殼、2個模具內(nèi)芯、蝴蝶狀內(nèi)芯和3根導管，所述模具外殼內(nèi)設有貫穿其軸向的模腔，所述模具內(nèi)芯上設有蝴蝶狀內(nèi)芯定位孔和3個導管定位孔，兩所述模具內(nèi)芯分別插裝于模腔的兩端，且模具內(nèi)芯的外柱面與模腔的內(nèi)環(huán)面密封觸接，兩所述模具內(nèi)芯在模腔軸向上間隔設置且兩者之間為脊髓支架形成空間，所述蝴蝶狀內(nèi)芯的兩端分別插設于兩模具內(nèi)芯上的蝴蝶狀內(nèi)芯定位孔內(nèi)，3根所述導管貫穿兩模具內(nèi)芯的導管定位孔。本發(fā)明的上述技術方案的有益效果如下：本發(fā)明采用物理混合方法制備殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架，材料價格低廉，制備方法簡單易于操作，避免使用交聯(lián)劑產(chǎn)生的細胞毒副作用，生物相容性好，適用于脊髓組織細胞附著，體內(nèi)易于代謝。附圖說明圖1為本發(fā)明制備的殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架掃描電鏡圖；圖2為本發(fā)明使用的分區(qū)式組織工程脊髓的結(jié)構(gòu)分解圖；圖3為本發(fā)明中模具內(nèi)芯組裝至模腔內(nèi)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為本發(fā)明使用的分區(qū)式組織工程脊髓的的模具外殼的俯視放大圖；圖5為本發(fā)明使用的分區(qū)式組織工程脊髓的的模具內(nèi)芯的俯視放大圖；圖6為本發(fā)明使用的分區(qū)式組織工程脊髓的的蝴蝶狀內(nèi)芯的俯視放大圖。附圖標記說明：1、模具外殼；10、模腔；2、模具內(nèi)芯；20、蝴蝶狀內(nèi)芯定位孔；21、導管定位孔；3、蝴蝶狀內(nèi)芯；4、導管。具體實施方式為使本發(fā)明要解決的技術問題、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖及具體實施例進行詳細描述。本發(fā)明提供一種掃描電鏡圖如圖1所示的分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架，每100ml的脊髓支架制備溶液中含有如下組分：殼聚糖0.1~1g、2%醋酸溶液1~20ml、10%明膠溶液0.5~5ml、蠶絲微纖維0.05~0.5g、以及將上述原料的混合液中和至中性的5%氫氧化鈉溶液。上述的分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架制備方法包括如下步驟：（1）制備殼聚糖-醋酸溶液：取配方量的殼聚糖溶解于2%醋酸溶液中，靜置過夜，加熱攪拌使其完全溶解；（2）稱取配方量的10%明膠溶液，將10%明膠溶液緩慢倒入步驟（1）制備的殼聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒加熱攪拌充分溶解；（3）稱取配方量的蠶絲微纖維，加入步驟（2）所得混合液中，65°c超聲攪拌，使其充分溶解；（4）利用5ml注射器吸取步驟（3）的脊髓支架制備溶液，注射到分區(qū)式組織工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制備液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱冷凍；（5）取出步驟（4）冰箱內(nèi)的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外層，形成包裹內(nèi)芯的后期脊髓模具，將后期脊髓模具輕輕放入含有5%氫氧化鈉溶液的玻璃大皿中，中和，用純水清洗至中性；（6）用鑷子把步驟（5）中清洗至中性的后期脊髓模具夾入凍干瓶中，蓋好瓶塞，水平放入冰箱，冷凍；（7）取出步驟（6）中冷凍后的凍干瓶，利用冷凍干燥機將凍干瓶完全凍干后，自冷凍干燥機上取下凍干瓶，并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的內(nèi)芯，得到分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架；（8）將制備好的分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架放入到密封袋中，標記好名稱和制備時間，于陰涼、干燥處長期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，備用。制備分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架所使用的分區(qū)式組織工程脊髓模具結(jié)構(gòu)如圖2~6所示，包括模具外殼1、2個模具內(nèi)芯2、蝴蝶狀內(nèi)芯3和3根導管4，所述模具外殼1內(nèi)設有貫穿其軸向的模腔10，所述模具內(nèi)芯2上設有蝴蝶狀內(nèi)芯定位孔20和3個導管定位孔21，兩所述模具內(nèi)芯2分別插裝于模腔10的兩端，且模具內(nèi)芯2的外柱面與模腔10的內(nèi)環(huán)面密封觸接，兩所述模具內(nèi)芯2在模腔10軸向上間隔設置且兩者之間為脊髓支架形成空間，所述蝴蝶狀內(nèi)芯3的兩端分別插設于兩模具內(nèi)芯2上的蝴蝶狀內(nèi)芯定位孔20內(nèi)，3根所述導管4貫穿兩模具內(nèi)芯2的導管定位孔21。利用上述的分區(qū)式組織工程脊髓模具制備分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架時，先將蝴蝶狀內(nèi)芯和3根導管插裝到其中一個模具內(nèi)芯中，然后將該模具內(nèi)芯插至模腔的一端，自模腔的另一端注入分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架制備溶液，然后將另一個模具內(nèi)芯自模腔另一端插入，兩模具內(nèi)芯擠壓兩者之間的分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架制備溶液，成型分區(qū)式殼聚糖-明膠-蠶絲微纖維脊髓支架。按照上述的制備方法具體制備下述3份樣品，并對3份樣品的孔隙率和力學強度進行比較，3份樣品的組分值和各實驗參數(shù)是目前實驗條件下的較優(yōu)組合，但不是限定本發(fā)明保護范圍的唯一組合。樣品g1的制備：(1)′制備殼聚糖-醋酸溶液：0.45g殼聚糖溶解于8ml的2%醋酸溶液中，靜置過夜，使其完全溶解；(2)′稱取2ml的10%明膠溶液，將10%明膠溶液緩慢倒入步驟(1)′制備的殼聚糖-醋酸溶液中，玻璃棒充分攪拌溶解；(3)′稱取0.2g的蠶絲微纖維，加入步驟(2)′所得混合液中，65°c超聲攪拌2.5h，使其充分溶解；(4)′利用1ml注射器吸取0.8ml步驟(3)′的脊髓支架制備溶液，注射到分區(qū)式組織工程脊髓模具中，固定好含脊髓支架制備液的前期脊髓模具，平放在玻璃大皿中，置于冰箱內(nèi)，-20℃冷凍過夜；(5)′取出步驟(4)′冰箱內(nèi)的前期脊髓模具，退去前期脊髓模具的外層，形成包裹內(nèi)芯的后期脊髓模具，將后期脊髓模具輕輕放入含有5%氫氧化鈉溶液的玻璃大皿中，中和2h后，用純水清洗后期脊髓模具15min/次，洗滌8次，至ph試紙檢測浸洗后的水為中性；(6)′用鑷子把步驟(5)′中清洗至中性的后期脊髓模具夾入凍干瓶中，蓋好瓶塞，水平放入冰箱，-20℃冷凍2h；(7)′打開冷凍干燥機，接通冷凍干燥機與真空泵，待冷凍干燥機內(nèi)溫度降至-40℃以下、真空降至0.02pa時，將步驟(6)′中凍干瓶移到冷凍干燥機內(nèi)，凍干2h，待凍干瓶完全凍干后，取下凍干瓶并取出后期脊髓模具，小心退去后期脊髓模具的內(nèi)芯，得到分區(qū)式殼聚糖-明膠-聚乙二醇脊髓支架；(8)′將制備好的分區(qū)式殼聚糖-明膠-聚乙二醇脊髓支架放入到密封袋中，標記好名稱和制備時間，于陰涼、干燥處長期保存，使用前取出脊髓支架用co60照射、消毒，備用。樣品g2和g3除部分組分含量不同外，其余實施過程同樣品g1，樣品g2和g3的組方含量如下表一。表一：分別對樣品g1、g2、g3進行孔隙率和拉力荷重檢測，結(jié)果如表二。表二：樣品孔隙率最大荷重g1>70%5.323ng240%左右(成型不好)2.892ng3<60%4.181n由表二可知，樣品g1組方制備的脊髓支架具有很好的孔隙率和力學強度，較好的滿足細胞培養(yǎng)和細胞產(chǎn)物研究領域的要求，是研究組織工程的良好脊髓支架。本發(fā)明的上述技術方案的有益效果如下：1、本發(fā)明所述的配方原料來源廣泛，價格低廉，具有醫(yī)用高分子材料表面吸附、截留和接枝功能。2、本發(fā)明所述的配方所制備的脊髓支架無毒性和免疫學惰性，改善與血液接觸的醫(yī)用高分子材料的生物相容性。3、本發(fā)明所述配方通過分區(qū)式組織工程脊髓（ptts）模具制備的脊髓支架具有孔隙結(jié)構(gòu)，空隙率大于60%。4、本發(fā)明所述方法通過分區(qū)式模具制備獲得的支架能起到正確引導作用，使脊髓灰質(zhì)與白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)上行纖維束和下行纖維束彼此分在不同區(qū)域中生長的分區(qū)式組織工程脊髓。5、本發(fā)明所述制備方法獲得的脊髓支架具有很好的力學強度，最大荷重為5.323n。以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12