本發(fā)明屬于生物醫(yī)用納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸適配體修飾的磁性納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

磁共振成像（magneticresonanceimaging,mri）利用原子核在磁場(chǎng)內(nèi)共振所產(chǎn)生信號(hào)來(lái)成像，能夠?qū)ι锝M織進(jìn)行快速無(wú)損檢測(cè)，且具有分辨率高、成像參數(shù)多、使用安全等突出優(yōu)點(diǎn)，是目前腫瘤診斷的有效技術(shù)之一。在臨床mri中，絕大多數(shù)的診斷須用磁共振成像對(duì)比劑（mricontrastagent），通過(guò)增強(qiáng)對(duì)比信號(hào)差異，提高成像對(duì)比度和清晰度，有效檢測(cè)正常組織與病變組織的成像差異，顯示體內(nèi)器官或組織的功能狀態(tài)。mri造影劑主要有順磁性造影劑和超順磁性造影劑兩大類(lèi)。相對(duì)于順磁性造影劑，超順磁性造影劑，主要包括fe3o4納米顆粒，磁矩大，弛豫效能高，而且可以通過(guò)尺寸選擇或特異性表面分子修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)特定組織部位的靶向。

腫瘤熱療是繼手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療和生物治療(免疫療法)之外的又一種非常有發(fā)展前景的腫瘤治療方法。在眾多的熱療技術(shù)（微波、射頻和超聲等）中，基于磁流體的磁感應(yīng)熱療是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種治療腫瘤的手段。它利用磁性介質(zhì)加入腫瘤組織后，在外加交變磁場(chǎng)(acmf)的作用下，磁性介質(zhì)由于尼爾弛豫和布朗弛豫效應(yīng)而感應(yīng)發(fā)熱，使腫瘤組織快速達(dá)到有效治療溫度范圍（41℃-45℃）而殺滅腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)其凋亡。其中磁性介質(zhì)在交變磁場(chǎng)下的升溫性能非常關(guān)鍵。

磁流體進(jìn)入腫瘤組織的方式主要有動(dòng)脈栓塞、瘤內(nèi)注射和靜脈注射。與前兩者相比，靜脈注射法可以使磁流體更有效、精確地靶向至任意大小、形貌和位置的瘤區(qū)，具有創(chuàng)傷小和同時(shí)靶向多個(gè)瘤體的優(yōu)點(diǎn)，其介導(dǎo)的熱療通常被稱為“靶向磁感應(yīng)熱療”（targetedmagnetichyperthermia,tmh），特別適合原位瘤的治療，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

不管是作為磁共振成像腫瘤診斷用造影劑，還是腫瘤熱療介質(zhì)，都需要磁性材料在腫瘤部位的有效富集。表面分子修飾是解決磁性納米顆粒臨床應(yīng)用的橋梁。通過(guò)表面修飾，提高高性能磁性納米顆粒的水溶性、生理穩(wěn)定性以及腫瘤靶向性，利用靜脈給藥并高效靶向到腫瘤區(qū)域，同時(shí)進(jìn)行mri成像診斷和磁感應(yīng)熱療，是腫瘤診療領(lǐng)域的迫切需求，也是目前國(guó)際腫瘤診療研究的挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明提供一種核酸適配體修飾的磁性納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。所述納米顆粒包含位于核心的磁核，包覆在其表面的peg化磷脂以及與peg相連的核酸適配體。所述磁核具備良好的超順磁性和優(yōu)異的磁熱效應(yīng)，且通過(guò)外層包覆peg化磷脂提高其體內(nèi)穩(wěn)定性和生物相容性，同時(shí)通過(guò)連接核酸適配體，實(shí)現(xiàn)其靶向腫瘤組織的功能。靜脈注射所述顆粒，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤的mri成像診斷和熱療。

技術(shù)方案：一種核酸適配體修飾的磁性納米顆粒，所述磁性納米顆粒表面包覆有一層peg化磷脂分子，且peg上連接有核酸適配體。

優(yōu)選的，上述磁性納米顆粒為1~20nm的鐵核。

優(yōu)選的，上述peg化磷脂分子末端修飾有羧基或氨基。

優(yōu)選的，上述核酸適配體能特異性靶向腫瘤細(xì)胞，且適配體末端修飾有氨基或羧基。

核酸適配體修飾的磁性納米顆粒的制備方法，制備步驟為：步驟1：制備油酸包覆的磁性納米顆粒；步驟2：在步驟1所得磁性納米顆粒表面包覆peg化的磷脂分子；步驟3：在步驟2所得顆粒表面修飾核酸適配體。

上述步驟1的具體步驟為：準(zhǔn)備含鐵化合物、油酸和油胺，所述含鐵化合物優(yōu)選乙酰丙酮鐵；其中油酸和油胺摩爾比為1:9~9:1，含鐵化合物中鐵元素與油胺摩爾比不超過(guò)1:3；以有機(jī)物為溶劑，所述有機(jī)物優(yōu)選二芐醚；在保護(hù)性氣氛下，加熱升溫到300℃，再自然冷卻；加入絮凝劑，所述絮凝劑優(yōu)選乙醇，絮凝并磁分離洗滌沉淀物，最后將制備的油酸包裹的磁性納米顆粒fe3o4@oa保存于有機(jī)溶劑中。

上述步驟2的具體步驟為：以氯仿為溶劑，溶解peg化磷脂，與步驟1制備的分散于有機(jī)溶劑中的fe3o4@oa混合，其中鐵元素與peg化磷脂的質(zhì)量比為1:2，所述peg化磷脂分子優(yōu)選羧基衍生物dspe-peg2000-cooh；加入去離子水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下70℃作用15min，通過(guò)疏水作用，在顆粒表面的油酸烷基鏈上包覆單層peg化磷脂分子，超濾離心去除多余磷脂膠束，獲得水溶性材料fe3o4@peg。

上述步驟3中核酸適配體的修飾通過(guò)edc-nhs偶聯(lián)，優(yōu)選末端修飾氨基的核酸適配體：5’-nh2as1411；edc和nhs的摩爾比不小于1:1，適配體偶聯(lián)率≥30%。

上述磁性納米顆粒在制備腫瘤核磁共振成像造影劑中的應(yīng)用。

上述磁性納米顆粒在制備腫瘤熱療用磁性介質(zhì)中的應(yīng)用。

有益效果：1.高溫?zé)峤夥ㄖ苽溆退岚拇判约{米顆粒，以油酸和油胺作為表面活性劑和還原劑，通過(guò)調(diào)控油酸和油胺的比例，控制磁性納米結(jié)構(gòu)的形貌，粒徑，結(jié)晶度以及磁學(xué)性能，使產(chǎn)物磁核兼具優(yōu)異的超順磁性和磁熱升溫性能。2．peg修飾的脂質(zhì)分子的包覆，提高了磁性納米顆粒在體內(nèi)的穩(wěn)定性和生物相容性，有效避免顆粒被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，延長(zhǎng)顆粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，從而提高顆粒于腫瘤區(qū)域的富集。3．核酸適配體與peg的連接，提高了產(chǎn)物的腫瘤靶向性能，易于進(jìn)入腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)部，尾靜脈注射法可以達(dá)到顆粒在腫瘤部位的有效富集。4．本發(fā)明磁性納米顆粒既可用作腫瘤影像診斷用mri造影劑，又可以作為腫瘤熱療用磁性介質(zhì)。核磁共振信號(hào)優(yōu)異，熱療效果顯著，有效達(dá)到了腫瘤的診療一體化。

附圖說(shuō)明

圖1：實(shí)施例1制備的核酸適配體修飾的磁性納米顆粒的透射電鏡圖。

圖2：實(shí)施例1制備的核酸核酸適配體修飾前（a、b）后（c、d）的磁性納米顆粒的水動(dòng)力尺寸和表面電位分析圖。

圖3：實(shí)施例1制備的核酸核酸適配體修飾的磁性納米顆粒在交變磁場(chǎng)下的升溫曲線圖。

圖4：實(shí)施例2核酸核酸適配體修飾的磁性納米顆粒在balb/c裸鼠皮下乳腺癌腫瘤模型的mri成像效果圖（a：注射前；b：注射24h）。

圖5：實(shí)施例3皮下乳腺癌腫瘤模型balb/c裸鼠熱療的近紅外熱成像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

本發(fā)明提供了一種核酸適配體修飾的磁性納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：制備油酸包覆的磁性納米顆粒；

其具體步驟還包括：

步驟1.1：將含鐵化合物溶解在有機(jī)溶劑中；

步驟1.2：在步驟1.1的溶液中先后加入油酸和油胺；

步驟1.3在氮?dú)夥諊?，步驟1.2的混合體系以3.3℃/min的速率分兩階段升溫，220℃停留60min，290℃停留30min；

步驟1.4：冷卻至室溫后，加入乙醇進(jìn)行磁分離洗滌，重復(fù)多次以去除體系中殘留的有機(jī)溶劑、油酸和油胺；

步驟1.5：將制備所得fe3o4@oa保存于有機(jī)溶劑中。

步驟2：在步驟1所得磁性納米顆粒表面包覆peg化的磷脂分子；

其具體步驟還包括：

步驟2.1：將dspe-peg2000-cooh溶解在有機(jī)溶劑中；

步驟2.2：在步驟2.1溶液中混合入步驟1所得分散于相同有機(jī)溶劑中的fe3o4@oa；

步驟2.3：在步驟2.2的混合體系中緩慢加入去離子水；

步驟2.4：將步驟2.3的混合體系置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下70℃作用15min，通過(guò)疏水作用，在fe3o4@oa顆粒表面的油酸烷基鏈上包覆單層具有較好水溶性的磷脂分子；

步驟2.5：待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，超聲分散，220nm濾膜過(guò)濾后超濾離心，去除底部沉淀物，得上層黑色透明的水溶性材料fe3o4@peg。

步驟3：在步驟2所得顆粒表面修飾核酸適配體。

其具體步驟還包括：

步驟3.1：在步驟2所得fe3o4@peg溶液中加入edc·hcl和nhs，室溫下反應(yīng)半小時(shí)；

步驟3.2：將步驟3.1所得溶液超濾離心，去離子水多次洗滌；

步驟3.3：將5’-nh2as1411的適配體于85℃變性10min，隨即冰浴10min復(fù)性，加入步驟3.2溶液中，震蕩反應(yīng)5h以上；

步驟3.4：將步驟3.3所得溶液超濾離心，去離子水多次洗滌，直至超濾液中檢測(cè)不到適配體，最終得到水溶性fe3o4@apt。

本發(fā)明提供了一種核酸適配體修飾的磁性納米顆粒。所述納米顆粒包含位于核心的磁核，包覆在其表面的peg化磷脂以及與peg相連的核酸適配體。所述磁核具備良好的超順磁性和優(yōu)異的磁熱效應(yīng)，且通過(guò)外層包覆peg化磷脂提高其體內(nèi)穩(wěn)定性和生物相容性，同時(shí)通過(guò)連接核酸適配體，實(shí)現(xiàn)其靶向腫瘤組織的功能。

本發(fā)明還提供了上述磁性納米顆粒在腫瘤mri成像診斷中的應(yīng)用，靜脈注射的磁性納米顆?？梢杂行Ц患谀[瘤部位，縮短t2弛豫時(shí)間，降低mri成像信號(hào)。

本發(fā)明還提供了上述磁性納米顆粒在腫瘤熱療中的應(yīng)用，靜脈注射的磁性納米顆?？梢杂行Ц患谀[瘤部位，在交變磁場(chǎng)作用下，達(dá)到熱療有效溫度，延緩腫瘤生長(zhǎng)。

實(shí)施例1：as1411適配體修飾的fe3o4磁性納米顆粒的制備方法。

1．將0.7g（2mmol）的乙酰丙酮鐵(fe(acac)3)溶解于20ml的二芐醚；先后加入12mmol油酸和6mmol油胺；在氮?dú)夥諊?，設(shè)定溫控儀程序，體系以3.3℃/min的速率升溫至220℃，在220℃停留60min，后繼續(xù)以3.3℃/min的速率升溫至290℃，在290℃下停留30min，結(jié)束反應(yīng)；冷卻至室溫后，加入乙醇磁分離洗滌，重復(fù)多次以去除體系中殘留的二芐醚、油酸和油胺，最后將制備出的油酸修飾的磁性fe3o4納米顆粒（fe3o4@oa）保存于氯仿中。

2．取60mgdspe-peg2000-cooh溶于5ml氯仿中；加入3ml的fe3o4@oa（濃度為5mgfe/ml），70℃下超聲10min；加入5ml去離子水，水浴70℃，抽至真空后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)溶劑蒸發(fā)殆盡；待其冷卻至室溫后，超聲分散15min；樣品經(jīng)220nm濾膜過(guò)濾后再超濾離心，去除底部沉淀物，取上層黑色透明的水相納米結(jié)構(gòu)fe3o4@peg。

3.移取1mlfe3o4@peg（5mg/ml），加入500μledc·hcl(500mm)和500μlnhs(100mm)，室溫下反應(yīng)半小時(shí)，超濾離心（10kda），去離子水（4ml×4次）洗滌；加入經(jīng)85℃變性10min，冰浴10min復(fù)性的5’-nh2as1411的適配體（10od），震蕩反應(yīng)5h，超濾離心（30kda,4ml×4次），直至超濾液中檢測(cè)不到適配體，最終得到適配體修飾的fe3o4納米顆粒fe3o4@apt。

利用透射電鏡（jeoljem-200cx）對(duì)實(shí)施例1制備得到的核酸適配體修飾磁性納米顆粒進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1所示，所得產(chǎn)物粒徑為5~20nm，為超順磁性氧化鐵納米顆粒造影劑粒徑尺寸。

利用粒徑電位分析儀（brookhavenzetaplus）測(cè)定實(shí)施例1制備的適配體修飾前（fe3o4@peg）和后（fe3o4@apt）的水動(dòng)力尺寸，結(jié)果如圖2所示，連接適配體后，顆粒分散性基本沒(méi)有變化，但平均粒徑變大，由26nm變?yōu)?4nm。表面zeta電位分布范圍變窄，平均zeta電位由-17mv變?yōu)?34mv，證實(shí)了電負(fù)性核酸適配體的修飾成功。

對(duì)實(shí)施例1制備的核酸適配體修飾的磁性納米顆粒fe3o4@apt進(jìn)行交變磁場(chǎng)下升溫試驗(yàn)。方法如下：取濃度為2mg[fe]/ml的磁性樣品1ml于磁感應(yīng)線圈中心，插入測(cè)溫光纖并啟動(dòng)交變磁場(chǎng)。使用光纖測(cè)溫儀記錄光纖探頭處樣品溫度變化。交變磁場(chǎng)的參數(shù)設(shè)置如下：頻率為390khz，電流強(qiáng)度為12a，磁感應(yīng)線圈直徑為3cm。比能量吸收率值（sar）用來(lái)評(píng)價(jià)升溫性能，其計(jì)算公式為：sar=c·(δt/δt)·(1/mfe)，其中c為樣品的比熱容，取磁性樣品與溶劑的比熱容的質(zhì)量平均值；δt/δt為溫度-時(shí)間曲線的起始斜率；mfe為1g磁性液體樣品中鐵的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，實(shí)施例1制備的核酸適配體修飾的磁性納米顆粒具有良好的磁熱效應(yīng)，2min內(nèi)溫度升高約22℃，計(jì)算的sar值為40.48w/g，這為后續(xù)的磁感應(yīng)熱療提供了良好的基礎(chǔ)。

實(shí)施例2：as1411適配體修飾的fe3o4磁性納米顆粒的制備方法：

1．將0.7g（2mmol）的乙酰丙酮鐵(fe(acac)3)溶解于20ml的二芐醚；先后加入12mmol油酸和6mmol油胺；在氮?dú)夥諊?，設(shè)定溫控儀程序，體系以3.3℃/min的速率升溫至220℃，在220℃停留60min，后繼續(xù)以3.3℃/min的速率升溫至290℃，在290℃下停留30min，結(jié)束反應(yīng)；冷卻至室溫后，加入乙醇磁分離洗滌，重復(fù)多次以去除體系中殘留的二芐醚、油酸和油胺，最后將制備出的油酸修飾的磁性fe3o4納米顆粒（fe3o4@oa）保存于氯仿中。

2．取60mgdspe-peg2000-nh2溶于5ml氯仿中；加入3ml的fe3o4@oa（濃度為5mgfe/ml），70℃下超聲10min；加入5ml去離子水，水浴70℃，抽至真空后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)溶劑蒸發(fā)殆盡；待其冷卻至室溫后，超聲分散15min；樣品經(jīng)220nm濾膜過(guò)濾后再超濾離心，去除底部沉淀物，取上層黑色透明的水相納米結(jié)構(gòu)fe3o4@peg。

3.將適配體5’-coohas1411（10od）85℃變性10min，冰浴10min復(fù)性后加入500μledc·hcl(500mm)，500μlnhs(100mm)，1mlfe3o4@peg（5mg/ml），震蕩反應(yīng)5h，超濾離心（30kda,4ml×4次），直至超濾液中檢測(cè)不到適配體，最終得到適配體修飾的fe3o4納米顆粒fe3o4@apt。

實(shí)施例3：核酸適配體修飾磁性納米顆粒在腫瘤核磁共振成像中的應(yīng)用。

以balb/c裸鼠皮下乳腺癌腫瘤模型為例進(jìn)行說(shuō)明：

1．小鼠皮下乳腺癌腫瘤模型的建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf-7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心收集后，以1×10⁷個(gè)/ml的數(shù)目，200μl/只的劑量接種于4-6周齡的清潔級(jí)balb/c雌性小鼠的右側(cè)后腿根部的皮下，經(jīng)一周后腫瘤可以長(zhǎng)至50-60mm³。

2．小鼠體內(nèi)mri成像檢測(cè)：將實(shí)施例1制得的核酸適配體修飾磁性納米顆粒過(guò)濾除菌，以30mgfe/kg體重，100μl的劑量經(jīng)荷瘤小鼠的尾靜脈注射，觀察小鼠腫瘤部位顯影成像情況。結(jié)果如圖4所示，注射24小時(shí)后，與注射前比，富集于腫瘤部位的顆粒能有效縮短t2弛豫時(shí)間，使腫瘤部位mri信號(hào)明顯變暗。

實(shí)施例4：核酸適配體修飾磁性納米顆粒在腫瘤熱療中的應(yīng)用。

在此實(shí)施例中，以balb/c裸鼠皮下乳腺癌腫瘤模型為例進(jìn)行說(shuō)明。

1．小鼠皮下乳腺癌腫瘤模型的建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf-7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心收集后，以1×10⁷個(gè)/ml的數(shù)目，200μl/只的劑量接種于4-6周齡的清潔級(jí)balb/c雌性小鼠的右側(cè)后腿根部的皮下，經(jīng)一周后腫瘤可以長(zhǎng)至50-60mm³。

2．小鼠磁感應(yīng)熱療：將實(shí)施例1制得的核酸適配體修飾磁性納米顆粒過(guò)濾除菌，以30mgfe/kg體重，100μl的劑量經(jīng)荷瘤小鼠的尾靜脈注射，4h后，將腫瘤區(qū)域置于acmf（390khz20a)裝置中的特定磁感應(yīng)線圈(內(nèi)徑3cm，高度1.5cm)中心，單次作用至少30min，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤體積大小，以驗(yàn)證熱療是否有效。腫瘤體積大小的計(jì)算公為:v=ab²/2(其中a代表腫瘤長(zhǎng)度，b代表腫瘤寬度)。相對(duì)腫瘤體積(rtv）計(jì)為vt/v0(其中vt為t時(shí)刻的腫瘤體積，而v0為初始的腫瘤體積）。相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率（t/c）計(jì)為：trtv/crtv×100%（其中trtv為處理組裸鼠的相對(duì)腫瘤體積，crtv為對(duì)照組的相對(duì)腫瘤體積）。

熱療過(guò)程中使用近紅外熱成像儀來(lái)檢測(cè)腫瘤表面的溫度圖像，結(jié)果如圖5所示，腫瘤部位溫度明顯高于周邊組織，最高溫度為42.6℃，達(dá)到有效熱療溫度。