本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于超臨界二氧化碳技術(shù)的納米制劑體系方法，具體為一種利用超臨界二氧化碳技術(shù)構(gòu)建提高姜黃素抗癌效果的納米體系方法，并用于腫瘤治療。

背景技術(shù)：

姜黃素(curcumin,cm)是從姜科植物的根莖中提取得到的天然二酮類(lèi)化合物，大量的研究表明其具有廣譜抗癌效果，包括抑制結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌等。但是，由于水不溶性，不穩(wěn)定性和生物可利用度低等缺陷，限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。

為了提高cm的抗癌效果，各種納米制劑得到發(fā)展，其中包括：脂質(zhì)體、膠束、納米顆粒和納米纖維。中國(guó)專(zhuān)利cn103550776b公開(kāi)了一種疏水性藥物納米顆粒、其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)溶劑交換法，將姜黃素制備出前驅(qū)納米顆?；烊橐海賹㈦p親性表面活性劑水溶液加入所訴前驅(qū)納米顆?；烊橐褐校暦稚?，即得到姜黃素納米顆粒。但制備過(guò)程中使用到丙酮等有機(jī)試劑，會(huì)造成有機(jī)溶劑殘留的問(wèn)題，得到的納米顆粒粒度不均一，且制備工藝復(fù)雜。

超臨界流體(supercriticalfluid,scf)是指熱力學(xué)狀態(tài)處于臨界溫度(tc)和臨界壓力(pc)之上的流體。scf的粘度接近于氣體，密度接近于液體，擴(kuò)散系數(shù)介于氣體和液體之間，兼具氣體、液體的雙重特性，具有高擴(kuò)散性和高溶解性的優(yōu)點(diǎn)。二氧化碳(co2)的tc(31.26℃)接近于室溫，pc(7.38mpa)處于中等壓力，且其性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)臭、無(wú)味、無(wú)毒、不易燃易爆、價(jià)廉、易于精制，對(duì)設(shè)備要求不高，可在室溫下操作，特別適合于具有生物活的性藥物或材料，因此超臨界二氧化碳(sc-co2)成為最常用的“溶劑”。中國(guó)專(zhuān)利cn102697738a公開(kāi)了一種二氧化碳流體抗溶劑法制備多孔微球的方法，先依次制備油相及油包水乳液，然后將制備的油包水乳液通過(guò)高壓泵泵入高壓釜中，使包埋有碳酸氫銨顆粒的聚合物微球析出；當(dāng)乳液噴完后，維持高壓釜內(nèi)壓力和溫度不變，繼續(xù)通入co2淋洗以清除殘留的溶劑。其優(yōu)點(diǎn)在于：操作過(guò)程簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑殘留較低、粒徑均一。

本專(zhuān)利采用的溶液強(qiáng)制分散法(solutionenhanceddispersionbysupercriticalco2,seds)利用特殊定制的同軸噴嘴，使從中快速泵出的co2既充當(dāng)抗溶劑也充當(dāng)分散劑，有效地將從噴嘴噴出的液滴迅速分散為更小的液滴，有助于形成更小粒徑的納米顆粒。目前，利用seds技術(shù)構(gòu)建提高姜黃素抗癌效果的納米體系方法報(bào)道較少，不同的納米制劑形態(tài)(如納米顆粒和納米纖維基質(zhì))對(duì)于同一種藥物用于不同的病灶部位具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種操作簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑殘留率低、綠色環(huán)保的利用超臨界二氧化碳技術(shù)構(gòu)建提高姜黃素抗癌效果的納米制劑體系方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種基于超臨界二氧化碳技術(shù)的納米制劑體系方法，利用超臨界二氧化碳技術(shù)構(gòu)建提高姜黃素抗癌效果；提高姜黃素抗癌效果的納米體系方法包括以下步驟：

s1：將姜黃素按比例溶于含有聚合物的有機(jī)溶劑中，配置成一定濃度的混合溶液；

s2：將液化的co2泵入高壓結(jié)晶釜，調(diào)節(jié)溫度和壓力至預(yù)設(shè)值后，通過(guò)hplc泵以一定的流速泵入事先配置好的混合溶液。

s3：當(dāng)混合溶液泵完后，步驟s2中繼續(xù)通入co2，并保持溫度和壓力穩(wěn)定直至有機(jī)溶劑完全被co2帶走后，停止泵入co2，待壓力降至常壓后，得到干燥的樣品，并于4℃冰箱中保存用于后續(xù)檢測(cè)抗癌效果。

作為優(yōu)選的實(shí)施方式，采用改進(jìn)的溶液強(qiáng)制分散技術(shù)(solutionenhanceddispersionbysupercriticalco2,seds)，溶液強(qiáng)制分散技術(shù)利用特殊定制的同軸噴嘴，從噴嘴中快速泵出的二氧化碳既充當(dāng)抗溶劑也充當(dāng)分散劑，通過(guò)改變壓力、溫度、泵速和濃度等參數(shù)，可以得到不同粒徑大小和形貌的姜黃素納米制劑。

作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的聚合物為絲素(silkfibroin)。

作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的有機(jī)溶劑為六氟異丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)。

制備得到姜黃素-絲素納米顆粒，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的工藝參數(shù)范圍為：壓力10-20mpa,溫度35℃，泵速0.5ml/min，濃度0.5％，姜黃素/絲素比例1:2。

制備姜黃素-絲素納米顆粒，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，具有窄的粒徑分布和可控的粒徑大小，其粒徑大小可通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)(壓力、溫度、泵速和濃度等)控制在100nm以下。

制備姜黃素-絲素納米顆粒，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，載藥率和包封率最高可分別達(dá)到12％±0.62和36％±1.9。

制備姜黃素-絲素納米顆粒，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，負(fù)載的姜黃素可在水溶液中緩慢釋放，且釋放速率可以通過(guò)控制絲素的β折疊含量進(jìn)行調(diào)控。

制備姜黃素-絲素納米顆粒，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，具有高效的細(xì)胞吸收效率和增強(qiáng)的抗癌效果。

制備得到姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的工藝參數(shù)范圍為：壓力20mpa,溫度35℃，泵速8ml/min，濃度4-6％，姜黃素/絲素比例1:9。

制備姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，具有相互貫通的納米孔洞及相互連接的納米纖維結(jié)構(gòu)，孔洞大小和纖維直徑可通過(guò)工藝參數(shù)(壓力、流速和溫度)控制在100nm以下。

制備姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，負(fù)載的姜黃素可在水溶液中緩慢釋放，且釋放速率可以通過(guò)乙醇蒸汽進(jìn)行調(diào)控。

制備姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，具有高效的細(xì)胞吸收效率和增強(qiáng)的抗癌效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本基于超臨界二氧化碳技術(shù)的納米制劑體系方法具有以下創(chuàng)新點(diǎn)：

1、納米結(jié)構(gòu)可通過(guò)改變參數(shù)輕易調(diào)控，可制備多種姜黃素納米體系，包括納米顆粒和納米纖維基質(zhì)。

2、大幅提高姜黃素的抗癌效果。

3、有機(jī)溶劑殘留較低；

4、制備條件溫和可控、制備過(guò)程發(fā)生在結(jié)晶釜內(nèi)，不受外界環(huán)境因素干擾；

5、操作簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，產(chǎn)率高。

附圖說(shuō)明

圖1本項(xiàng)目中超臨界二氧化碳技術(shù)制備姜黃素納米體系流程圖。

圖2本發(fā)明中超臨界二氧化碳裝置示意圖。

圖中：1-溶液泵，2-高壓結(jié)晶釜，3-控溫室，4-co2罐，5-冷箱，6-co2泵，7-熱交換器，8-同軸噴嘴，9-燒結(jié)板，10-水浴箱。

圖3本發(fā)明實(shí)施例一所得的姜黃素-絲素納米顆粒sem圖片。

圖中：制備參數(shù)：姜黃素/絲素比例1:2，濃度0.5％，壓力10mpa，流速0.5ml/min，溫度35℃。

圖4本發(fā)明實(shí)施例二所得的姜黃素-絲素納米顆粒sem圖片。

圖中：制備參數(shù)：姜黃素/絲素比例1:2，濃度0.5％，壓力20mpa，流速0.5ml/min，溫度35℃。

圖5姜黃素-絲素納米顆粒的累計(jì)釋放曲線。

圖中：黑色曲線代表姜黃素原藥，紅色曲線代表在10mpa壓力下制備的姜黃素-絲素納米顆粒，藍(lán)色曲線代表20mpa壓力下制備的姜黃素-絲素納米顆粒。

圖6姜黃素-絲素納米顆粒的細(xì)胞吸收熒光照片。(a)0.5小時(shí)，(b)6小時(shí)

圖7姜黃素-絲素納米顆粒的體外抗癌效果。(結(jié)直腸癌細(xì)胞hct116)

圖8姜黃素-絲素納米顆粒與結(jié)直腸癌細(xì)胞(hct116)共培養(yǎng)6天的細(xì)胞增殖曲線。

圖9姜黃素-絲素納米顆粒的細(xì)胞毒性。(正常細(xì)胞ncm460)

圖10本發(fā)明實(shí)施例三所得的姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)sem圖片。

圖中：制備參數(shù)：姜黃素/絲素比例1:9，濃度4％，壓力20mpa，流速8ml/min，溫度35℃。

圖11本發(fā)明實(shí)施例四所得的姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)sem圖片。

圖中：制備參數(shù)：姜黃素/絲素比例1:9，濃度6％，壓力20mpa，流速8ml/min，溫度35℃。

圖12姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的累積釋放曲線。

圖13姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的細(xì)胞吸收熒光照片。(a)0.5小時(shí)，(b)6小時(shí)

圖14姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的體外抗癌效果。(結(jié)直腸癌細(xì)胞hct116)

圖15姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)與結(jié)直腸癌細(xì)胞(hct116)共培養(yǎng)6天的細(xì)胞增殖曲線。

圖16姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的細(xì)胞毒性。(正常細(xì)胞ncm460)

圖17姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)與正常細(xì)胞(ncm460)共培養(yǎng)6天的細(xì)胞增殖曲線。

圖18姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的體內(nèi)抑瘤效果。

圖中：(a)腫瘤體積變化率，(b)小鼠體重變化率，(c)腫瘤重量，(d)經(jīng)處理并剝離后的腫瘤光學(xué)照片(e)腫瘤組織切片h&e染色照片。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

首先配置姜黃素-絲素溶液，將姜黃素溶于含有絲素的六氟異丙醇中，姜黃素與絲素比例為1:2，混合溶液總濃度為0.5％。采用附圖1所示的超臨界裝置，打開(kāi)壓力閥門(mén)，使結(jié)晶釜內(nèi)的壓力達(dá)到預(yù)定的超臨界壓力10mpa，溫度控制在35℃，打開(kāi)排氣閥，使壓力和溫度保持恒定。泵入姜黃素-絲素溶液，泵速調(diào)整為0.5ml/min。待樣品泵完，關(guān)閉進(jìn)樣閥門(mén)，保持其他條件不變(壓力、溫度等)至少30分鐘以上徹底帶走溶劑，并干燥樣品。最后關(guān)閉進(jìn)氣閥門(mén)，待結(jié)晶釜中的co2氣體完全排空后，打開(kāi)結(jié)晶釜并于燒結(jié)板上收集樣品。如附圖2所示，制備得到的姜黃素-絲素納米顆粒粒徑為～77nm，載藥率和包封率分別為～9.3％和～28％。如附圖4所示，負(fù)載的姜黃素可在196小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)累積釋放。

實(shí)施例2

制備過(guò)程類(lèi)似于實(shí)施例1。首先配置姜黃素-絲素溶液，將姜黃素溶于含有絲素的六氟異丙醇中，姜黃素與絲素比例為1:2，混合溶液總濃度為0.5％。采用附圖1所示的超臨界裝置，打開(kāi)壓力閥門(mén)，使結(jié)晶釜內(nèi)的壓力達(dá)到預(yù)定的超臨界壓力20mpa，溫度控制在35℃，打開(kāi)排氣閥，使壓力和溫度保持恒定。泵入姜黃素-絲素溶液，泵速調(diào)整為0.5ml/min。待樣品泵完，關(guān)閉進(jìn)樣閥門(mén)，保持其他條件不變(壓力、溫度等)至少30分鐘以上徹底帶走溶劑，并干燥樣品。最后關(guān)閉進(jìn)氣閥門(mén)，待結(jié)晶釜中的co2氣體完全排空后，打開(kāi)結(jié)晶釜并于燒結(jié)板上收集樣品。如附圖3所示，制備得到的姜黃素-絲素納米顆粒粒徑為～61nm，載藥率和包封率分別為～9.5％和～29％。如附圖4所示，負(fù)載的姜黃素可在196小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)累積釋放。隨后進(jìn)行細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)，如圖5所示，通過(guò)本專(zhuān)利方法獲得的姜黃素-絲素納米顆粒，具有高效的細(xì)胞吸收效率。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，如圖6-8所示，通過(guò)本專(zhuān)利方法獲得的姜黃素-絲素納米顆粒，具備增強(qiáng)的體外抗癌效果且減小的毒副作用。

實(shí)施例3

首先配置姜黃素-絲素溶液，將姜黃素溶于含有絲素的六氟異丙醇中，姜黃素與絲素比例為1:9，混合溶液總濃度為4％。采用附圖1所示的超臨界裝置，打開(kāi)壓力閥門(mén)，使結(jié)晶釜內(nèi)的壓力達(dá)到預(yù)定的超臨界壓力20mpa，溫度控制在35℃，打開(kāi)排氣閥，使壓力和溫度保持恒定。泵入姜黃素-絲素溶液，泵速調(diào)整為8ml/min。待樣品泵完，關(guān)閉進(jìn)樣閥門(mén)，保持其他條件不變(壓力、溫度等)至少30分鐘以上徹底帶走溶劑，并干燥樣品。最后關(guān)閉進(jìn)氣閥門(mén)，待結(jié)晶釜中的co2氣體完全排空后，打開(kāi)結(jié)晶釜并于燒結(jié)板上收集樣品。如附圖9所示，制備得到的姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的平均纖維直徑為～63nm。

實(shí)施例4

制備過(guò)程類(lèi)似于實(shí)施例3。首先配置姜黃素-絲素溶液，將姜黃素溶于含有絲素的六氟異丙醇中，姜黃素與絲素比例為1:9，混合溶液總濃度為6％。采用附圖1所示的超臨界裝置，打開(kāi)壓力閥門(mén)，使結(jié)晶釜內(nèi)的壓力達(dá)到預(yù)定的超臨界壓力20mpa，溫度控制在35℃，打開(kāi)排氣閥，使壓力和溫度保持恒定。泵入姜黃素-絲素溶液，泵速調(diào)整為8ml/min。待樣品泵完，關(guān)閉進(jìn)樣閥門(mén)，保持其他條件不變(壓力、溫度等)至少30分鐘以上徹底帶走溶劑，并干燥樣品。最后關(guān)閉進(jìn)氣閥門(mén)，待結(jié)晶釜中的co2氣體完全排空后，打開(kāi)結(jié)晶釜并于燒結(jié)板上收集樣品。如附圖10所示，制備得到的姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的平均纖維直徑為～47nm。如附圖11所示，負(fù)載的姜黃素可在96小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)累積釋放。隨后進(jìn)行細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)，如圖12所示，通過(guò)本專(zhuān)利方法獲得的姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)，具有高效的細(xì)胞吸收效率。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，如圖13-16所示，通過(guò)本專(zhuān)利方法獲得的姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)，具備增強(qiáng)的體外抗癌效果且減小的毒副作用。如圖17所示，通過(guò)本專(zhuān)利方法獲得的姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型體內(nèi)同樣具備增強(qiáng)的抑瘤效果，且不引起明顯的急性毒性反應(yīng)。如圖18所示，姜黃素-絲素納米纖維基質(zhì)的體內(nèi)抑瘤效果。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。