本發(fā)明涉及一種小薊三氯甲烷提取物，屬于藥物領域。

背景技術：

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌(mycobacteriumtuberculosis)引起的人畜共患的一種慢性、消耗性傳染病。結(jié)核病與艾滋病、瘧疾一同仍然是人類健康的主要威脅，尤其是在發(fā)展中國家。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約1/3人口感染過結(jié)核分枝桿菌，其中結(jié)核病病人約2000萬，每年新發(fā)結(jié)核病病人870萬，每年約有300萬人死于該病，超過了艾滋病、瘧疾、腹瀉等傳染病死亡人數(shù)的總和，其死亡率在全球單一細菌性病原體感染導致疾病中最高，結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要原因之一。

數(shù)十年來，國際上針對結(jié)核菌已開發(fā)出近二十種藥物，但均存在副作用大，易產(chǎn)生耐藥性等缺點，特別是近年來耐藥及多重耐藥菌株(multipledrugsresistant-bacillustuberculosis，mdr-tb)的出現(xiàn)，更是對現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物提出了嚴重挑戰(zhàn)，使原有的抗結(jié)核病治療方案(即一線抗癆藥，二線抗癆藥的方案)失去了應有的作用。耐多藥結(jié)核是指結(jié)核分枝桿菌至少同時耐異煙肼和利福平，亦有人認為，只要是耐異煙肼(inh)、利福平(rfp)、吡嗪酰胺(pza)、乙胺丁醇(emb)和鏈霉素(sm)中兩種或兩種以上者均屬于耐多藥范疇。世界衛(wèi)生組織估計，全球可能有5000萬人已被感染耐一藥以上的結(jié)核分枝桿菌，當今世界約有三分之二的結(jié)核病人處于發(fā)生耐多藥的危險之中。同時，從化學合成物中尋找有效藥物的難度日益增大。中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥自2000多年前即有關于抗結(jié)核治療的記載。因此，近年來國內(nèi)外從中國豐富的植物資源中尋找有效的抗結(jié)核藥物，已引起越來越廣泛的重視。

小薊(herbacirsii)是菊科植物刺兒菜的干燥地上部分，俗稱刺角芽、刺角等。一般生長于荒地、草叢、灌叢、田間等，我國主要分布于安徽、山東、江蘇等地，小薊中主要含有黃酮、三萜、甾醇、有機酸等化學成分。

小薊的主要藥理作用：①抗菌作用：小薊具有很好的抗菌作用，有實驗表明，小薊提取物對黑曲霉(aspergillusniger)、青霉(penicilliumnotatum)、綿霉(achlyaspp)等3種常見果蔬致病真菌均具有較好的抑制作用，抑制效果從大到小依次是青霉、綿霉、黑曲霉，此外，實驗還發(fā)現(xiàn)小薊的水提物對青霉的抑制效果最好，小薊的乙醇提取物對綿霉和黑曲霉抑制效果最好。采用超臨界co2萃取法，鑒定小薊花、莖、葉中揮發(fā)油中的化學成份，共鑒定出166個化合物，且實驗發(fā)現(xiàn)，不同萃取揮發(fā)油對特定的病原微生物具有特殊的抑菌效果。另有實驗發(fā)現(xiàn)，乙醇浸劑1：30000時可以抑制人型結(jié)核桿菌，且小薊水煎劑對結(jié)核桿菌的抑制濃度比小薊乙醇浸劑大300倍。此外，有實驗研究發(fā)現(xiàn)，小薊等多種中藥的醇提物對耐甲氧西林奧球菌(methicillin-resistantstaphylococcus,mrs)都有不同程度的抑制作用。②其他藥理作用：小薊除了具有良好的抗菌作用以外，小薊還具有降血糖的作用，有實驗表明，將小薊鮮葉的正己烷、三氯甲烷、甲醇的提取液來進行動物實驗，實驗結(jié)果表明，小薊的正己烷提取液對正常小鼠和糖尿病模型小鼠均具有顯著的降血糖功效，而三氯甲烷和甲醇提取液則降血糖功效不明顯。此外，有實驗證明，小薊的乙酸乙酯部位能夠明顯減輕由于二甲苯所導致的小鼠炎癥，且該部位對小鼠的凝血、止血等具有明顯的作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術方案是提供了一種小薊三氯甲烷提取物。本發(fā)明另一技術方案是提供了該提取物的用途。

本發(fā)明提供了一種小薊三氯甲烷提取物，它是由小薊粗粉或乙醇提取物，加入石油醚提取后，再依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取相應溶劑部位提取物，收集三氯甲烷部位提取物，即得。

其中，所述的提取方法為溶劑萃取法、回流或超聲提取法。

其中，所述的溶劑萃取法包括如下步驟：

a、取小薊，粉碎；加入95％乙醇浸泡；

b、浸泡后的粗粉超聲提取，提取液過濾，濃縮、真空干燥，得凍干粉；

c、取b步驟制備的小薊乙醇提取物凍干粉，加水分散；

d、加入石油醚萃取，石油醚萃取后，再按順序萃取小薊乙醇提取物水溶液的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇部位，收集三氯甲烷溶劑部位，濃縮，即得小薊三氯甲烷提取物。

其中，b步驟所述的超聲提取功率為400w，提取時間30min。

其中，d步驟所述的濃縮溫度為60℃。

其中，所述的回流或超聲提取方法包括如下步驟：

取小薊粗粉，加入石油醚回流或超聲提取后，藥渣再依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水回流或超聲提取，收集三氯甲烷提取物，即得。

本發(fā)明提供了所述的小薊三氯甲烷提取物在制備抑制人型結(jié)核桿菌的藥物中的用途。

進一步優(yōu)選地，所述的藥物是治療結(jié)核病的藥物。

更進一步優(yōu)選地，所述的藥物是治療耐藥結(jié)核病的藥物。

本發(fā)明采用兩種系統(tǒng)溶劑法提取制備的小薊三氯甲烷提取物，最低殺菌濃度分別為0.63、0.63mg/ml，經(jīng)實驗測定小薊三氯甲烷提取物的mic值分別是100ug/ml，mbc值分別是400ug/ml，對結(jié)核分枝桿菌標準菌株h37rv有較好的抑殺作用。

附圖說明

圖1小薊三氯甲烷溶劑部位提取物對結(jié)核桿菌的抑制曲線

具體實施方式

實施例1本發(fā)明小薊三氯甲烷提取物的制備方法

取小薊500g,用粉碎機進行粉碎制成粗粉，粗粉過藥典三號篩。然后將小薊粗粉用95％乙醇浸泡24h，浸泡后的粗粉分別用超聲波提取儀提取兩次，超聲功率為400w，每次30min，合并提取液并過濾，濾液由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃減壓濃縮成浸膏，置于烘箱中烘干，即得到粗提物，真空干燥得到凍干粉，稱重即可得出提取率。

準確稱取小薊乙醇提取物凍干粉100g，分別分散于蒸餾水500ml中，按乙醇提取物水溶液與石油醚比例為1:2的比例加入石油醚，置于2000ml分液漏斗中，充分搖勻，靜置于鐵架臺上，進行萃取。靜置2小時后，收集石油醚層提取液，然后再按乙醇提取物水溶液與石油醚體積比為1：2的比例加入石油醚，充分搖勻后靜置于鐵架臺上2小時，然后收集石油醚層萃取液，重復上述過程，直到石油醚層無色為止，收集所有石油醚萃取液。將小薊的石油醚萃取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃條件下減壓濃縮成浸膏，將浸膏放入鼓風干燥箱中，將制得的浸膏中殘留的有機溶劑充分蒸發(fā)干后，再將浸膏進行真空干燥得到提取物凍干粉，稱重，并計算出提取率。石油醚部位萃取完之后，分別再依次按順序萃取小薊乙醇提取物水溶液的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇部位，萃取方法與小薊石油醚溶劑部位相同。三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成浸膏的溫度條件分別是60℃、80℃、90℃。提取了中藥的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇這4個溶劑部位之后，每種中藥乙醇提取物水溶剩余的溶液部位即水溶劑部位的提取液，剩余殘渣棄之不要。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀100℃條件下減壓濃縮成浸膏，真空干燥得到凍干粉，稱重，計算提取率。

實驗結(jié)果：

表1小薊不同溶劑部位提取物提取率的測定結(jié)果

實施例2本發(fā)明小薊三氯甲烷提取物的制備

準確稱取小薊藥材粗粉100g，裝入100ml圓底燒瓶中，首先加溶劑石油醚使其浸過藥面1cm～2cm高，超聲提取30min，提取2次，收集石油醚提取液，將提取物使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃左右減壓濃縮成浸膏，將浸膏用油浴把制得的浸膏中殘留的有機溶劑充分蒸發(fā)干后，再將浸膏進行真空干燥得到提取物，稱重，并計算出提取率。石油醚部位提取完之后，分別再依次按三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水的順序，超聲提取相應溶劑的中藥溶劑部位提取物，分別得到白及的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水溶劑部位提取物。

實驗結(jié)果：

表2小薊不同溶劑部位提取物提取率的測定結(jié)果

以下通過具體藥效學試驗證明本發(fā)明的有益效果。

試驗例1抗結(jié)核中藥小薊不同溶劑部位提取物體外抗結(jié)核作用

1、實驗材料

實驗藥品為小薊的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物(實施例1制備)。

2、實驗方法

將適量結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv分別接種于小薊的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水這五個溶劑部位不同含藥濃度的改良羅氏培養(yǎng)基中，通過絕對濃度法，分別研究小薊不同溶劑部位提取物對結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv的體外抑制作用，同時設置有空白對照與利福平陽性對照，分別篩選出小薊體外抑菌效果最好的溶劑部位。本實驗在四川省疾病控制中心結(jié)核所生物安全二級+(bsl-2+)實驗室進行。

2.1培養(yǎng)基的配制：

空白培養(yǎng)基、利福平陽性培養(yǎng)基配制方法同上

2.2小薊各溶劑部位提取物含藥培養(yǎng)基的配制：

取實施例1提取的小薊石油醚部位提取物凍干粉，將其溶解于含有2％吐溫-80的空白培養(yǎng)基，配制成含有小薊石油醚提取物2.5mg/ml的含藥培養(yǎng)基，取含有小薊乙醇提取物2.5mg/ml的含藥培養(yǎng)基4ml，加入到不含吐溫-80的空白培養(yǎng)基4ml中，混合均勻即可得到含小薊乙醇提取物1.25mg/ml的含藥培養(yǎng)基，同法，依次可以得到含小薊乙醇提取物0.63、0.32、0.16mg/ml的含藥培養(yǎng)基。因此，可分別制得含小薊石油醚溶劑部位提取物2.5、1.25、0.63、0.31、0.15mg/ml5個濃度的含藥培養(yǎng)基，每個濃度裝3只無菌培養(yǎng)管，每管約8ml，制作成斜面培養(yǎng)基備用。若需調(diào)節(jié)含藥培養(yǎng)基的濃度，即稱取該濃度對應溶劑部位提取物凍干粉重量，同法配制即可。小薊三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水溶劑部位提取物培養(yǎng)基的配制方法相同。

結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv菌液的配制、接種培養(yǎng)與觀察、結(jié)果判斷標準、統(tǒng)計學分析等均同上。

2.3實驗結(jié)果：小薊不同溶劑部位提取物體外抑菌實驗結(jié)果

對小薊石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水五個溶劑部位提取物進行體外抑制結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv實驗研究，根據(jù)對小薊乙醇提取物體外抑菌的含藥濃度的初步探索，將含藥培養(yǎng)基制作成含藥濃度分別為2.5、1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml的5個濃度梯度的培養(yǎng)基，同時設置空白培養(yǎng)基和利福平陽性培養(yǎng)基。該抑菌實驗重復3次，培養(yǎng)四周，分別觀察藥敏實驗結(jié)果，具體結(jié)果見表3-表7：

表3實驗前三周小薊石油醚溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表4實驗前三周小薊三氯甲烷溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表5實驗前三周小薊乙酸乙酯溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表6實驗前三周小薊正丁醇溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表7實驗前三周小薊水溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

由表3-表7可知：

①小薊各溶劑部位提取物的各個濃度培養(yǎng)基，培養(yǎng)一周以后，均未發(fā)現(xiàn)有結(jié)核桿菌生長；

②小薊石油醚溶劑部位提取物，培養(yǎng)兩、三周以后，各實驗組對標準菌株h37rv的抑殺作用和空白組比有極顯著差異(p＜0.01)，當含藥濃度是2.5mg/ml時，與利福平陽性對照組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，其余濃度與利福平陽性組比有極顯著差異(p＜0.01)。

③小薊三氯甲烷溶劑部位提取物，培養(yǎng)兩、三周以后，實驗組各濃度對標準菌株h37rv的抑殺作用和空白組比有極顯著差異(p＜0.01)，當含藥濃度是2.5、1.25mg/ml時，與利福平陽性對照組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，其余濃度與利福平陽性組比有極顯著差異(p＜0.01)。

④小薊乙酸乙酯溶劑部位提取物，培養(yǎng)兩、三周以后，當實驗組藥物濃度為2.5、1.25、0.63時對標準菌株h37rv的抑殺作用和空白組比有極顯著差異(p＜0.01)，其余濃度與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，各濃度與利福平陽性對照組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。

⑤小薊正丁醇溶劑部位提取物，培養(yǎng)二周以后，當藥物濃度是0.32、0.16mg/ml時，其對標準菌株h37rv的抑殺作用與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，其余濃度與空白組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。各濃度組與利福平組比均具有極顯著差異(p＜0.01)；培養(yǎng)三周以后，當藥物濃度是1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml時，其抑殺作用與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，藥物濃度為2.5mg/ml時與空白組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。各濃度組與利福平組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。

⑥小薊水溶劑部位提取物，培養(yǎng)兩、三周以后，實驗組藥物濃度為1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml時，對標準菌株h37rv的抑殺作用與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，實驗組藥物濃度為2.5mg/ml時與空白組比有顯著差異(p＜0.05),各濃度組與利福平組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。

表8實驗第四周小薊不同溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果

由表8可知，培養(yǎng)四周以后，小薊石油醚溶劑部位提取物培養(yǎng)基含藥濃度在2.5mg/ml時，有殺菌效果，在設置的濃度梯度中，最低殺菌濃度為2.5mg/ml；小薊三氯甲烷提取物培養(yǎng)基在2.5、1.25、0.63均具有殺菌效果，最低殺菌濃度為0.63mg/ml；乙酸乙酯部位在濃度為2.5、1.25、0.63時具有一定的抑菌效果，最低抑菌濃度0.63mg/ml；正丁醇部位提取物最低抑菌濃度1.25mg/ml；而小薊水部位提取物從結(jié)果看來，無抑制結(jié)核桿菌的作用。

3、小結(jié)

通過本實驗部分對篩選出來的小薊經(jīng)系統(tǒng)溶劑法(萃取法)制備出石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位提取物，用制備出來的五個不同的溶劑部位進行進一步的體外抑制結(jié)合分歧桿菌標準菌株h37rv的實驗研究，以篩選出體外抑制標準菌株h37rv的有效溶劑部位。通過體外抑菌實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)小薊三氯甲烷溶劑部位相比該種中藥的其他四種溶劑部位，具有更好的抑制h37rv的效果。由于萃取的系統(tǒng)溶劑法操作起來有可能會存在有機溶劑與水相沒有充分震蕩、中藥乙醇提取物沒有充分分散于水中等問題，從而影響萃取效果。為了篩選出更加準確的抑制h37rv的有效溶劑部位，再進行一次系統(tǒng)溶劑法(超聲提取法)制備小薊的不同溶劑部位，并對每一種部位進行體外抗結(jié)核作用研究。

試驗例2抗結(jié)核中藥小薊不同溶劑部位提取物體外抗結(jié)核作用

1、實驗材料

實驗藥品為小薊的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物(實施例2制備)

2、實驗方法

本實驗在四川省疾病控制中心結(jié)核所生物安全二級+(bsl-2+)實驗室進行操作。

3實驗結(jié)果：小薊不同溶劑部位提取物體外抑菌實驗結(jié)果

對小薊石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水五個溶劑部位提取物分別進行體外抑制結(jié)核桿菌的實驗研究，根據(jù)對小薊乙醇提取物體外抑制結(jié)核桿菌的含藥濃度的初步探索，將含藥培養(yǎng)基制作成含藥濃度分別為2.5、1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml的5個濃度梯度的培養(yǎng)基，同時設置空白培養(yǎng)基和利福平陽性培養(yǎng)基。該抑菌實驗重復3次，培養(yǎng)四周，分別觀察藥敏實驗結(jié)果，具體結(jié)果見表9-表13。

表9實驗前三周小薊石油醚溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表10實驗前三周小薊三氯甲烷溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表11實驗前三周小薊乙酸乙酯溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表12實驗前三周小薊正丁醇溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

表13實驗前三周小薊水溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果(n＝3,x±s)

注：與空白組比較：*p＜0.05，差異顯著**p＜0.01，差異極顯著

由表9-表13可知：

①小薊各溶劑部位的各個濃度培養(yǎng)基，培養(yǎng)一周以后，均未發(fā)現(xiàn)有結(jié)核桿菌生長；

②小薊石油醚部位，培養(yǎng)兩周、三周以后，各濃度組與空白組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。含藥濃度為2.5、1.25、0.63mg/ml時對h37rv標準菌株的抑殺作用和利福平組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，濃度為0.32、0.16mg/ml時與利福平組具有極顯著差異(p＜0.01)。

③小薊三氯甲烷部位，培養(yǎng)兩、三周以后，各濃度組與空白組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。含藥濃度為2.5、1.25、0.63mg/ml時對h37rv標準菌株的抑殺作用和利福平組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，濃度為0.32、0.16mg/ml時與利福平組具有極顯著差異(p＜0.01)。

④小薊乙酸乙酯部位，培養(yǎng)兩、三周以后，當藥物濃度是0.15mg/ml時，其抑殺作用與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，其余濃度與空白組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。各濃度組與利福平組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。

⑤小薊正丁醇部位，培養(yǎng)兩、三周以后，當藥物濃度是0.15mg/ml時，其抑殺作用與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，其余濃度與空白組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。各濃度組與利福平組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。

⑥小薊水部位，培養(yǎng)兩周后，當藥物濃度是1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml時，其抑殺作用與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，當藥物濃度是2.5mg/ml時，與空白組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。各濃度組與利福平組比均具有極顯著差異(p＜0.01)；培養(yǎng)三周后，當藥物濃度是1.25、0.63、0.32、0.16mg/ml時，其抑殺作用與空白組比無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，當藥物濃度是2.5mg/ml時，與空白組比均具有顯著差異(p＜0.05)，各濃度組與利福平組比均具有極顯著差異(p＜0.01)。

表14實驗第四周小薊不同溶劑部位提取物對h37rv體外抑制作用實驗結(jié)果

由表14可知，培養(yǎng)四周以后，小薊石油醚部位培養(yǎng)基含藥濃度在設置的濃度梯度中，最低殺菌濃度為0.63mg/ml；小薊三氯甲烷部位含藥培養(yǎng)基在2.5、1.25、0.63、0.32mg/ml均具有殺菌效果，最低殺菌濃度為0.32mg/ml。乙酸乙酯和正丁醇部位在濃度為2.5、1.25、0.64、0.32mg/ml時具有較輕微的抑菌效果，最低抑菌濃度0.32mg/ml；小薊正水部位含藥培養(yǎng)基從結(jié)果看來，無抑制結(jié)核桿菌的作用。與萃取法系統(tǒng)溶劑法相比，超聲法系統(tǒng)溶劑法制得的中藥部位，石油醚部位殺菌效果更好，三氯甲烷部位最低抑菌濃度更低，乙酸乙酯和正丁醇的抑菌效果較微弱，但比萃取法制得的中藥部位效果好一些。小薊水部位無抑菌效果。

4小結(jié)

通過本實驗部分對篩選出來的小薊經(jīng)系統(tǒng)溶劑法(超聲提取法)制備出新的石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶劑部位提取物，并用制備出來的五個不同的溶劑部位提取物進行新一輪的體外抑制結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv的實驗研究，篩選出抑菌效果最好的中藥溶劑部位提取物，即小薊抑制h37rv的有效溶劑部位。通過比較萃取與超聲兩種不同的系統(tǒng)溶劑法提取物對標準菌株h37rv的體外抑制作用，選擇一種效果更好的系統(tǒng)溶劑法。實驗結(jié)果表明，超聲提取法制得的溶劑部位提取物仍然是小薊三氯甲烷部位抑菌效果最好，但最低殺菌濃度有所不同，超聲法提取的溶劑部位最低殺菌濃度更低，表現(xiàn)出更好的抑菌活性。使用萃取法與超聲提取法兩種不同方法提取的溶劑部位提取物，小薊三氯甲烷溶劑部位最低殺菌濃度分別是0.63、0.32mg/ml。探究了小薊的有效抑菌溶劑部位，并對有效抑菌溶劑部位的抗菌濃度做了初步探究，后續(xù)實驗將有效部位通過色譜法分成不同溶劑片段，通過抑菌研究，確定有效溶劑片段，再將有效溶劑片段進行藥化研究，確定其化學組成，并對其進行檢測、鑒定其有效成分以及穩(wěn)定性的研究。本實驗部分為后續(xù)實驗進行初步探索，打下實驗基礎。

試驗例3抗結(jié)核中藥有效溶劑部位最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

1、抗結(jié)核中藥有效溶劑部位mic、mbc的測定(一)

1.1材料與設備

(1)實驗材料

標準菌株(h37rv)：由四川省疾控中心實驗室提供

(2)實驗試劑

middlebrook7h9培養(yǎng)基美國bd公司

middlebrook7h10培養(yǎng)基美國bd公司

小薊三氯甲烷溶劑部位(由實施例1制備)

⑶器材

96孔板

生物安全柜：生物安全柜：型號：ac2-s，廠家：成都東方銳進科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：型號：kf-2020a，廠家：南京肯凡電子科技有限公司；

1.2實驗方法

采用96孔板二倍稀釋法測定提取物對人型結(jié)核桿菌的最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，mic)，以肉眼未見細菌生長的藥物濃度為mic(nashetal,1986)，取96孔微孔板，滅菌后，每孔加入200ul滅菌去離子水以防止培養(yǎng)過程中各實驗孔成分蒸發(fā)。取改良羅氏培養(yǎng)基上生長良好的人型結(jié)核桿菌標準菌株，以middlebrook7h9培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度至od＝0.1(約1×107cfu/ml)，并稀釋至細菌濃度約為1×105cfu/ml。在微孔板第2列孔b-g內(nèi)，加198ul上述菌液和2ul初始濃度為50mg/ml的小薊石油醚溶劑部位或小薊三氯甲烷溶劑部分。其余列孔b3-g11加入100ul菌液。待第二列微孔b-g中液體充分混勻后，取出100ul添加到下一個孔中，以此類推。加到g10時，取出100ul棄掉。g11為不加提取物的空白對照。同一藥物的稀釋濃度同時設3個平行對照組。37℃培養(yǎng)2周，肉眼在顯微鏡下觀察的未見細菌生長的微孔最低濃度為該提取物的mic，并從肉眼未見到細菌生長孔取培養(yǎng)物涂布在middlebrook7h10-adc平板上，37℃培養(yǎng)20-30d，仔細觀察細菌生長情況，以沒有細菌生長對應孔的濃度的最低濃度為該提取物的最低殺菌濃度(minimalbactericidalconcentration,mbc)(dubuissonetal,2010)。稀釋后的終濃度為：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9、1.95ug/ml。

本部分實驗在四川省疾病控制中心結(jié)核所生物安全二級+(bsl-2+)實驗室進行操作。

1.3實驗結(jié)果

采用96孔板法測定小薊三氯甲烷溶劑部位對人型結(jié)核桿菌標準菌h37rv的mic和mbc值，結(jié)果顯示，小薊三氯甲烷溶劑部位對h37rv的mic為62.5mg/ml，mbc為500mg/ml。

表15mic、mbc的測定結(jié)果(一)

1.4小結(jié)

對小薊乙醇提取物的抑菌濃度進行了初步的探索，并篩選出了小薊三氯甲烷溶劑部位為該種中藥體外抑菌效果最好的溶劑部位。在設定的5個濃度梯度含藥培養(yǎng)基抑菌實驗中，大致找出了抑菌與殺菌的濃度范圍，采用采用96孔板二倍稀釋法進行小薊有效溶劑部位的mic與mbc測定。由于采用二倍稀釋法測定，所以測定濃度區(qū)間較大。下面采用蘇通培養(yǎng)基稀釋法縮短測定濃度區(qū)間，測定小薊三氯甲烷溶劑部位的mic與mbc值。

2、抗結(jié)核中藥有效溶劑部位mic、mbc的測定(二)

2.1實驗材料

(1)材料

實驗菌株:人型結(jié)核桿菌標準菌株(由四川省疾控中心實驗室提供)

小薊三氯甲烷溶劑部位(由實施例1制備)

(2)試劑

二甲基亞砜(dmso)：分子量：78.13，純度：分析純，規(guī)格：500ml，廠家：天津市致遠化學試劑有限公司；

middlebrook7h11培養(yǎng)基：美國bd公司

天門冬酰胺：分子量：132.12，純度：分析純，規(guī)格：500g，廠家：天津市致遠化學試劑有限公司；

磷酸氫二鉀：分子量：136.09，純度：分析純，規(guī)格：500g，廠家：天津市致遠化學試劑有限公司；

檸檬酸鎂：分子量：703.40，純度：分析純，規(guī)格：500g，廠家：天津市致遠化學試劑有限公司；

硫酸鎂：分子量：246.47，純度：分析純，規(guī)格：500g，廠家：廣東光華科技股份有限公司；

枸櫞酸鐵銨：分子量：488.16，純度：分析純，規(guī)格：500g，廠家：天津市致遠化學試劑有限公司；

丙三醇：分子量：92.09，純度：分析純，規(guī)格：500ml，廠家：天津市津東天正精細化學試劑廠；

蒸餾水

(3)器材

生物安全柜：生物安全柜：型號：ac2-s，廠家：成都東方銳進科技有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：型號：kf-2020a，廠家：南京肯凡電子科技有限公司；

2.2實驗方法

(1)蘇通培養(yǎng)基的配制：

準確稱取上述各種成分，溶解于100ml無菌蒸餾水中，即可得到蘇通液體培養(yǎng)基。

(2)菌液的稀釋配制

用無菌接種環(huán)刮取少量在改良羅氏培養(yǎng)基上生長良好的菌齡3周左右的結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv，置于裝有2-3ml生理鹽水的已高壓滅菌的磨菌管中進行研磨，用無菌吸管吸取少量研磨均勻的菌液于裝有生理鹽水的比濁管中，搖晃均勻，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度，直至麥氏比濁儀測定菌液濃度為1×107cfu/ml，用移液槍吸取20ul菌液于2ml生理鹽水中，稀釋菌液濃度為1×105cfu/ml，用于接種。每管培養(yǎng)基接種10ul。

(3)小薊三氯甲烷部位供試液的制備

稱取各溶劑部位凍干粉，用dmso進行溶解，將其溶解于含有2％dmso的蘇通培養(yǎng)基，對含有dmso的蘇通培養(yǎng)基依次稀釋，最終使藥物濃度分別為500、450、400、350、300、250、200、150、100、50ug/ml的十個濃度梯度。

(4)藥敏實驗

分別測試小薊三氯甲烷溶劑部位的最低抑菌濃度(mic)與最低殺菌濃度(mbc)，培養(yǎng)基采用配制的蘇通培養(yǎng)基，每只培養(yǎng)管盛裝3ml培養(yǎng)基，再加入不同稀釋度溶劑部位藥液3ml，接種結(jié)核桿菌標準菌株培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果，若肉眼觀察培養(yǎng)基液體為渾濁則代表有結(jié)核桿菌菌落生長，澄清管的最低藥物濃度為該藥物的最低抑菌濃度(mic)，將未見菌落生長的澄清管各取100ul培養(yǎng)基液，接種于middlebrook7h11瓊脂板上，37℃條件下培養(yǎng)4周，以未見菌落生長的最低濃度確定為該藥物的最低殺菌濃度。

2.3實驗結(jié)果

表16mic、mbc的測定結(jié)果(二)

由表16可知，小薊三氯甲烷部位提取物的mic值分別是100，mbc值分別是400ug/ml，對結(jié)核分枝桿菌標準菌株h37rv有較好的抑殺作用。

2.4小結(jié)

本實驗部分通過蘇通培養(yǎng)基試管稀釋法較為精確的測定了小薊三氯甲烷有效溶劑部位提取物的mic和mbc值，實驗結(jié)果表明小薊三氯甲烷有效溶劑提取物均具有較好的抑菌活性。為后面結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv和耐藥菌株的ic50的測定提供濃度設定依據(jù)，同時為整個研究課題打下實驗基礎。

試驗例4抗結(jié)核中藥小薊有效溶劑部位對h37rv與耐藥菌株ic50的測定

1、實驗材料

菌種及來源：

標準菌株人型結(jié)核分歧桿菌h37rv：來源于四川省疾控中心結(jié)核所實驗室

耐藥結(jié)核分歧桿菌臨床分離株no.23592(耐利福平、異煙肼)：來源于四川省疾控中心結(jié)核所實驗室

實驗藥品：

實施例1制備的小薊三氯甲烷溶劑部位。

2、實驗方法

對小薊有效抗結(jié)核桿菌溶劑部位提取物mic與mbc的測定，將含有小薊三氯甲烷溶劑部位提取物的培養(yǎng)基含藥濃度梯度調(diào)至450、400、350、300、250、200、150、100ug/ml的8個濃度，分別接種標準菌株h37rv和耐藥菌株以觀察藥物對這兩種結(jié)核分歧桿菌的抑制情況的差異，同時設置三組平行實驗。設置空白培養(yǎng)基，不設置利福平陽性對照組。培養(yǎng)基配制方法同上。菌液的稀釋、接種、以及培養(yǎng)方法均同上。培養(yǎng)3周以后，分別數(shù)出每一個培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)，并計算出抑制率。本部分實驗在四川省疾病控制中心結(jié)核所生物安全二級+(bsl-2+)實驗室進行操作。

a1為空白培養(yǎng)基上的菌落生長數(shù)

a2為含藥培養(yǎng)基上的菌落生長數(shù)

a1、a2均為三組平行實驗的平均數(shù)

3實驗結(jié)果：小薊三氯甲烷溶劑部位對標準菌株h37rv的ic50測定結(jié)果

對小薊三氯甲烷溶劑部位提取物mic與mbc值得測定，將小薊三氯甲烷溶劑部位提取物制作成含藥濃度分別是450、400、350、300、250、200、150、100ug/ml的含藥培養(yǎng)基，分別接種標準菌株h37rv和耐藥菌株，同時做三組平行實驗，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察3周，3周后記錄培養(yǎng)基表面的標準菌株h37rv和耐藥菌株生長情況及菌落數(shù)，菌落數(shù)結(jié)果用三組平行實驗的平均數(shù)表示，并計算出抑制率，制作出ic50曲線圖。實驗結(jié)果見表17、圖1。

表17小薊三氯甲烷不同濃度溶劑部位提取物對h37rv和耐藥菌株的抑制作用

不同濃度的小薊三氯甲烷溶劑部位提取物對結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv與耐藥菌株的抑制率見表17，由表可見，隨著培養(yǎng)基中含藥濃度的增加，對兩種菌株的抑制率逐漸增大，當藥物濃度是450ug/ml時，抑菌率達到了100％，當藥物濃度是100ug/ml時，無抑制效果。根據(jù)表17的實驗結(jié)果，以小薊三氯甲烷溶劑部位提取物含藥濃度為橫坐標，藥物對菌株生長的抑制率為縱坐標，得到小薊三氯甲烷溶劑部位提取物對h37rv和耐藥菌株的抑制曲線，結(jié)果見圖1，由圖可知，隨著藥物濃度的增大，對菌株的抑制率逐漸增大，呈現(xiàn)量效關系。小薊三氯甲烷溶劑部位提取物對h37rv和耐藥菌株的抑制曲線基本重合，使用spss軟件計算得出藥物對h37rv和耐藥菌株的ic50值分別301.597、315.289ug/ml，表明該提取物對兩種菌株的抑制效果差別不大。

4小結(jié)

小薊不同溶劑部位提取物體外抗結(jié)核作用，以及對抗結(jié)核中藥有效部位mbc、mic的測定等試驗研究中，考慮到安全性問題，均采用的結(jié)核分歧桿菌標準菌株h37rv。在本實驗中藥有效部位抑制結(jié)核桿菌的量效關系時采用同時使用標準菌株h37rv與耐藥菌株，比較前面篩選出來的抗結(jié)核中藥有效溶劑部位對兩種菌株的抑制作用與量效關系，結(jié)果表明，抗結(jié)核中藥對標準菌株與耐藥菌株的抑制效果相差不大。

目前我國耐藥結(jié)核病發(fā)病率不斷升高，臨床上治療耐藥結(jié)核病的化療方案用藥的種類多、劑量較大，不良反應發(fā)生率較高。如果引入中藥治療結(jié)核病，即便是中藥聯(lián)合用藥，也能較好地治療耐藥結(jié)核病，并且能減輕副作用，提高病人接受程度，對于我國或全球結(jié)核病控制具有巨大的社會意義和應用前景。