本發(fā)明屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程亞單位二聯(lián)口服疫苗。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由尼多病毒目(nidovirales)冠狀病毒科(coronaviridae)的豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種冬季多發(fā)的高度接觸性腸道傳染病。不同年齡和不同品種的豬均易感，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100％，尤其對哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，病死率平均為50％，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重危害。

豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritis，tge)是由尼多目、冠狀病毒科的豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tgev)引起的一種以腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬高致死率為特征的高度接觸性腸道傳染病。該病具有高度傳染性，豬場一旦暴發(fā)此病，而造成出生2周齡以內(nèi)仔豬近乎100％死亡，損失十分嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大危害。

豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎往往在寒冷季節(jié)并發(fā)于仔豬，造成仔豬腹瀉、脫水、死亡，傳染性強，難以治愈，因此研制這兩種病毒的二聯(lián)疫苗對預(yù)防豬腹瀉和胃腸炎病的爆發(fā)，降低豬死亡率，減少豬場經(jīng)濟(jì)損失具有極其重要的意義。

疫苗免疫接種是預(yù)防這兩種病的主要措施，然而現(xiàn)有的疫苗一般需要注射，常規(guī)注射疫苗會產(chǎn)生應(yīng)激及疫苗吸收的問題。以往研究發(fā)現(xiàn)，腸道粘膜免疫所產(chǎn)生的分泌型抗體(siga)是抵抗pedv和tgev感染的有效抗體，如igg、igm的免疫保護(hù)效果并不理想。因此選擇一種能在腸粘膜定居的菌作為宿主菌對于豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎疫苗的研制具有極其重要的意義。

乳酸乳球菌一種易通過黏膜吸收的常在菌，因其在食品工業(yè)各個領(lǐng)域中的長期應(yīng)用已證明不具有致病性，被公認(rèn)為安全級微生物。利用一些乳酸乳球菌在胃腸道、泌尿、生殖系統(tǒng)中或黏膜部位粘附存活且無病原性等特點，廣泛開展了活菌口服后在體內(nèi)定植及疫苗的研究。

目前，豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎發(fā)生率居高不下，發(fā)病的原因愈加復(fù)雜，且并無特效治療藥物，一般對癥治療效果不佳，所以最好接種疫苗防止暴發(fā)。然而，市面上商品化的疫苗主要為滅活苗和弱毒苗。滅活苗雖然安全穩(wěn)定，但需要大劑量接種或應(yīng)用濃縮抗原；免疫期短，常需強化接種；產(chǎn)生完全免疫力需要2周，不利于緊急預(yù)防接種與降低疫苗費用且滅活苗只能通過注射免疫，仔豬無法獲得siga，保護(hù)效果不佳。而弱毒苗由于存在著成本高、易返祖、有潛在感染危險等缺陷，很難在實踐中推廣應(yīng)用。傳統(tǒng)疫苗在防治豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎中暴露出越來越多的問題，已無法提供完全保護(hù)，研制一種新型可靠的疫苗迫在眉睫。豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎的免疫機制中，黏膜免疫具有非常重要的作用。傳統(tǒng)的非腸道輸入的滅活疫苗不產(chǎn)生siga抗體，細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)弱而且維持時間短。口服免疫突出的優(yōu)點是可有效地刺激腸道局部免疫細(xì)胞產(chǎn)生分泌型iga，這尤其適應(yīng)于腸道粘膜傳染病，并且避免了常規(guī)注射所引起的應(yīng)激及疫苗吸收問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種基因工程亞單位二聯(lián)口服疫苗，即一種豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒基因工程亞單位二聯(lián)口服疫苗，口服免疫突出的優(yōu)點是可有效地刺激腸道局部免疫細(xì)胞產(chǎn)生分泌型iga，這尤其適應(yīng)于腸道粘膜傳染病，并且避免了常規(guī)注射所引起的應(yīng)激及疫苗吸收問題，解決疫苗免疫應(yīng)激性強，免疫原性不強、有毒性的問題。

本發(fā)明所提供的豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒基因工程亞單位二聯(lián)口服疫苗，是使用能夠重組表達(dá)豬流行性腹瀉病毒s蛋白和豬傳染性胃腸炎病毒sln蛋白的乳酸乳球菌制備的；

其中豬流行性腹瀉病毒s蛋白，其氨基酸序列為seqidno:1；其編碼基因的核苷酸序列為seqidno:2；

所述的sln蛋白，是將豬傳染性胃腸炎病毒的a、d抗原位點基因和n321抗原位點基因連接起來的，

作為優(yōu)選，所述的sln蛋白編碼基因的連接順序為d抗原位點基因、n321抗原位點基因、a抗原位點基因；

所述的d抗原位點基因、n321抗原位點基因、a抗原位點基因是通過linker連接起來的，

作為實施例的一種具體記載，sln蛋白的氨基酸序列為seqidno:3；其編碼基因為seqidno:4。

本發(fā)明制備的滅活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保護(hù)，免疫后能夠產(chǎn)生較強免疫力，接種豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，能夠有效預(yù)防豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎的流行和傳播，降低本病對養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，有著廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：兩種重組菌的pcr鑒定結(jié)果圖；

圖2：兩種重組菌的雙酶切鑒定結(jié)果圖；

圖3：兩種重組菌的western-blotting結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實施例1：口服疫苗的制備

一、合成和擴(kuò)增目的基因

根據(jù)全病毒rna序列，對抗原位點進(jìn)行優(yōu)化后，選用兩個柔性的linker((ggggs)3)將tgev的a、d抗原位點基因和n321抗原位點基因連接起來(順序為：d抗原位點基因-linker-n321抗原位點基因-linker-a抗原位點基因)，把該序列命名為sln，并送往生物公司合成。

設(shè)計特異性引物分別從獲得的pedv變異株中提取rna,反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增pedv的s1基因和tgev的sln基因并連接pmd18-t載體，轉(zhuǎn)化至dh5α感受中，挑陽性單克隆，菌液pcr鑒定、提取質(zhì)粒酶切鑒定以及測序鑒定正確。

1、表達(dá)載體構(gòu)建

將鑒定正確的s1基因和sln基因分別和pmg36e表達(dá)載體用限制酶xbai和hindiii雙酶切，并進(jìn)行膠回收純化。將兩者16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌jm109中培養(yǎng)16小時。挑取單克隆菌落進(jìn)行pcr鑒定、質(zhì)粒雙酶切鑒定以及測序鑒定正確。

3、構(gòu)建重組乳酸乳球菌

將鑒定正確的兩種陽性質(zhì)粒分別與感受態(tài)細(xì)胞mg1363輕柔混勻后，冰上放置5min，將其轉(zhuǎn)入2mm的預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯中，迅速電擊，電擊參數(shù)為電壓2.5kv，電擊時間為5ms，電擊后加入900μl冰預(yù)冷的sgm17恢復(fù)培養(yǎng)基，混勻，將菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，冰上放置10min，28℃復(fù)蘇培養(yǎng)2h，取適量菌液涂布于含有5μg/ml紅霉素的gm17瓊脂培養(yǎng)基上，28℃厭氧培養(yǎng)2-3d。于平板上挑取單個菌落，分別接種于含有5μg/ml紅霉素的gm17液體培養(yǎng)基中，28℃厭氧培養(yǎng)過夜后，從乳酸乳球菌中分別提取質(zhì)粒，并分別對質(zhì)粒進(jìn)行pcr鑒定、雙酶切鑒定和測序鑒定正確。兩種重組乳酸乳球菌種分別命名為：mg1363/pmg36e-s1和mg1363/pmg36e-sln。

4、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

分別取50μl的兩種菌種接種于5ml含有紅霉素的新配gm17液體培養(yǎng)基中，于28℃過夜培養(yǎng)，至od600達(dá)到1.0時，加入nisin至終濃度為10ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，于10小時后終止誘導(dǎo)。

然后進(jìn)行sds-page蛋白檢測試驗：結(jié)果顯示所表達(dá)的目的蛋白大約為86kd和15kd；western鑒定重組蛋白具有與抗ped和抗tge的多抗發(fā)生反應(yīng)的能力，證明重組菌表達(dá)的外源蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

5、凍存重組菌

從表達(dá)兩種重組蛋白菌株的培養(yǎng)液中分別取100微升，分別接種于含紅霉素的50毫升gm17培養(yǎng)基中。28℃非震蕩培養(yǎng)至od600＝1.0時，將兩種菌液混合，并與100毫升含3％蔗糖的10％脫脂牛奶混合液混合均勻，分裝為2毫升每管，凍干。

6、凍存菌的穩(wěn)定性試驗

(1)菌種保存溫度：將兩種菌種混合物的凍干培養(yǎng)物分別于-20℃、4℃、和25℃保存3個月，然后各取5支同上述方法復(fù)蘇計數(shù)，比較不同保存溫度對細(xì)菌數(shù)量的影響。結(jié)果顯示以-20℃保存為最好。

表1不同保存溫度對保存三個月的混合重組菌種菌數(shù)的影響

(2)菌種保存時間：將兩種菌種混合物的凍干培養(yǎng)物凍存3、6、12、18個月各取5支，以同樣的方法復(fù)蘇計數(shù)，比較不同保存時間對細(xì)菌數(shù)量的影響。結(jié)果顯示菌種在-20℃條件下經(jīng)過凍干保存18個月對菌種數(shù)量的影響差異不顯著，表明凍存菌種很穩(wěn)定。

表2不同保存時間對混合重組菌種菌數(shù)的影響

(3)pcr鑒定：挑取凍存3、6、12、18個月的菌種的在mrs固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇后，取mrs固體平板上單菌落，加100μl滅菌雙蒸水，在沸水浴中加熱5分鐘后，用自備兩個基因的pcr引物擴(kuò)增s1和sln基因顯示兩條陽性目的條帶，表明凍存菌穩(wěn)定。

7、疫苗的制備

取凍干好的菌粉，加入1ml的生理鹽水，混合均勻，直接口服。

實施例2：

(一)口服疫苗的效力試驗

1材料

1.1藥品

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室制備的重組口服疫苗。

1.2試驗場所及試驗動物

試驗場所為山東省青島市城陽區(qū)海偉養(yǎng)豬場，試驗動物為20頭30日齡的仔豬。

2試驗方法

2.1免疫疫苗并檢測抗體

將20頭30日齡的仔豬平均分為對照組和免疫組。免疫組每頭仔豬灌服組合口服疫苗1頭份，對照組灌服等劑量的無菌生理鹽水。分別于免疫前及免疫后的7d、14d、21d、28d對每頭豬進(jìn)行采血，測血液中抗體含量。

2.2疫苗免疫后重組菌在豬體內(nèi)的表達(dá)水平及消長規(guī)律

口服免疫組在免疫后7天、14天、28天分別采集直腸棉拭，樣品處理后涂布于5μg/ml紅霉素的mrs平板，經(jīng)28℃培養(yǎng)24h，每組隨機挑取10個菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后用堿裂解法提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切分析，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切后片段大小，驗證糞檢菌是否為重組菌mg1363(pmg36e)。

3結(jié)果與分析

3.1口服免疫后抗體水平結(jié)果

對照組和免疫組對s1和sln的siga母源抗體水平都較高。免疫組首免14天后，由于母源抗體的衰減及疫苗可能的部分中和作用，抗體滴度有所下降，但仍顯著高于對照組；免疫28天后，對照組針對上述抗原的抗體水平繼續(xù)下降，而免疫組的抗體水平則繼續(xù)升高，至免疫后60天，仍能檢測到較高水平抗體。如下表所示：

豬血清中針對s1和sln抗原特異性siga抗體水平

3.2重組菌在豬體內(nèi)的表達(dá)水平及消長規(guī)律結(jié)果

重組菌口服免疫組在免疫后14天、28天分別采集直腸棉拭進(jìn)行檢測，均未檢測到重組質(zhì)粒；重組菌滅活油乳劑苗肌肉注射組在上述時間段亦未能檢出重組質(zhì)粒。根據(jù)抗體檢測結(jié)果，重組菌油乳劑滅活苗主要通過其免疫保護(hù)性抗原的緩慢釋放，刺激機體產(chǎn)生抗體；與對照組相比，免疫后14、28天抗體水平顯著升高；而重組菌活菌口服免疫組在上述階段產(chǎn)生抗體的水平較低，也與活菌口服后在體內(nèi)存活時間較短的檢測結(jié)果相吻合。

4結(jié)論

通過對免疫后豬體產(chǎn)生的抗體水平的追蹤可以看出重組菌有很好的免疫原性，能夠刺激機體產(chǎn)生針對pedvs1和tgevsln的特異性siga抗體，并能長時間持續(xù)較高水平。結(jié)果表明本實驗室研究的疫苗免疫效力良好。

實施例3：口服疫苗的安全性試驗

1材料

1.1藥品

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室制備的重組口服疫苗。

1.2試驗場所及試驗動物

試驗場所為山東省青島市城陽區(qū)海偉養(yǎng)豬場，試驗動物為20頭30日齡的仔豬。

2試驗方法

2.1、單劑量安全性試驗

30日齡仔豬80頭，分為2組，分別為試驗組和對照組，每組40頭豬。試驗組每頭灌服重組乳酸菌1ml，對照組灌服等劑量無菌生理鹽水，灌服一次后，連續(xù)14天觀察仔豬精神狀態(tài)，有無腹瀉、采食量下降等不良癥狀出現(xiàn)，并對成活率、增重、飼料利用率等生產(chǎn)性能進(jìn)行統(tǒng)計。

2.2、單劑量重復(fù)安全性試驗

30日齡仔豬80頭，分為2組，分別為試驗組和生理鹽水對照組，每組40頭豬。試驗組每頭灌服重組乳酸菌1ml，對照組灌服等劑量無菌生理鹽水，連續(xù)灌服七天，用藥后連續(xù)14天觀察仔豬精神狀態(tài)，有無腹瀉、采食量下降等不良癥狀出現(xiàn)，并對成活率、增重、飼料利用率等生產(chǎn)性能進(jìn)行統(tǒng)計。

2.3、超劑量安全性試驗

30日齡仔豬80頭，分為2組，分別為試驗組和生理鹽水對照組，每組40頭豬。試驗組每頭灌服重組乳酸菌2ml，對照組灌服等劑量無菌生理鹽水，灌服1次后，連續(xù)14天觀察仔豬精神狀態(tài)，有無腹瀉、采食量下降等不良癥狀出現(xiàn)，并對成活率、增重、飼料利用率等生產(chǎn)性能進(jìn)行統(tǒng)計。

3、試驗結(jié)果

疫苗對30日齡仔豬單劑量使用的安全性試驗結(jié)果

疫苗對30日齡仔豬單劑量重復(fù)使用的安全性試驗結(jié)果

疫苗對30日齡仔豬超劑量使用的安全性試驗結(jié)果

各試驗組仔豬在灌服疫苗后，連續(xù)14天觀察仔豬的反應(yīng)，仔豬無腹瀉、采食量下降等不良癥狀，所有試驗仔豬均健康存活，體重增加。試驗結(jié)束后隨機挑選5頭剖殺，觀察剖檢變化，各組仔豬剖檢的組織和器官與生理鹽水對照組基本無差別。

本發(fā)明制備的基因工程亞單位口服疫苗安全可靠，可有效引起腸道粘膜免疫反應(yīng)，免疫后能夠產(chǎn)生較強免疫力，免疫仔豬的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，能夠有效預(yù)防豬流行性腹瀉病和豬傳染性胃腸炎，降低本病對養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，有著廣闊的應(yīng)用前景。

sequencelisting

<110>青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種基因工程亞單位二聯(lián)口服疫苗

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