本發(fā)明涉及化學(xué)藥物領(lǐng)域，具體涉及一種ph響應(yīng)與協(xié)同治療的靶向兩親性小分子前藥的制備與用途。

背景技術(shù)：

氨甲蝶呤（methotrexate，mtx，別名：(+)-氨甲蝶呤，甲氨基葉酸，分子式：c20h22n8o5，cas號(hào)：60388-53-6），是葉酸拮抗劑，與葉酸差異僅在n10上的nh上的氫改為甲基(ch3)，以及環(huán)上c4酮基改為氨基(nh2)，故可與葉酸競(jìng)爭(zhēng)同一酵素，通過(guò)對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制而達(dá)到阻礙腫瘤細(xì)胞dna的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖，抗代謝療法的抗癌藥物。同時(shí)由于與葉酸結(jié)構(gòu)相近，氨甲蝶呤可與細(xì)胞表面的葉酸受體進(jìn)行特異性結(jié)合使藥物能夠集中在葉酸受體比較多的癌細(xì)胞內(nèi)。此外，氨甲蝶呤與葉酸性質(zhì)相似，具有較好的親水性。鹽酸阿霉素（doxorubicin,dox）別名多柔比星，阿霉素等。分子式：c27h29no11，cas號(hào)：23214-92-8），是一種抗腫瘤抗生素，有效抑制rna和dna的合成，具有廣泛的抗譜性，對(duì)急性白血病，乳腺癌以及肝癌等多種腫瘤具有很好的治療效果。研究證明，dox藥物呈交叉耐藥性，并與mtx具有一定的協(xié)同治療作用，因此設(shè)計(jì)一種集mtx和dox于一體的智能型藥物遞送系統(tǒng)對(duì)于解決治療效率低，藥物耐藥性強(qiáng)等問(wèn)題具有非常強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

由于抗癌藥物往往表現(xiàn)出水中溶解度低以及藥物靶向遞送性弱等特點(diǎn)，在實(shí)際化療過(guò)程中，對(duì)正常組織或細(xì)胞有較大的細(xì)胞毒性，影響了腫瘤治療的難度與周期，因而提高藥物水溶性及其靶向性等具有重大的科學(xué)與實(shí)際意義。小分子藥物遞送系統(tǒng)可有效結(jié)合小分子藥物和生物納米技術(shù)等優(yōu)點(diǎn)，可選擇性地將藥物遞送至病灶，減低毒副作用的同時(shí)可有效提高了藥物的醫(yī)療療效。一些研究報(bào)道中，通常將抗癌藥物與親水性的聚合物例如聚乙二醇等通過(guò)酯鍵或酰胺鍵結(jié)合形成納米粒子，酯鍵與酰胺鍵往往需要體內(nèi)的酯酶或酰胺酶的存在才可斷裂，而酯酶在體內(nèi)是廣泛分布的，酰胺酶含量較低，因而難以實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，此外這種策略由于存在較大比例的載體成分，藥物上載量不高，不能實(shí)現(xiàn)無(wú)載體的藥物遞送。例如：cn103285400b公開(kāi)了一種酸敏感聚合物前藥的合成及應(yīng)用，抗癌藥物阿霉素與a-b型兩嵌段聚合物通過(guò)縮醛鍵鏈接，并制得聚乙二醇親水嵌段為外表面，疏水藥物為疏水核的前藥膠束納米顆粒，并通過(guò)物理包埋的形式包埋另外一種抗癌藥物，增強(qiáng)了對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有抗腫瘤藥物載體含量高，藥物上載量低及藥物釋放不可控等缺陷，提供一種ph響應(yīng)與協(xié)同治療的靶向兩親性小分子前藥的制備及應(yīng)用。本發(fā)明具體技術(shù)方案如下。

一種ph響應(yīng)與協(xié)同治療的靶向兩親性小分子前藥制備方法包括以下步驟：

（1）在冰浴和氬氣(ar)氛圍條件下，將氨甲喋呤（mtx）溶于無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，往溶液中分別加入n-羥基丁二酰亞胺（nhs）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（edc·hcl）；

（2）將步驟（1）得到的溶液在冰水浴中攪拌30min；

（3）再往步驟（2）的溶液中加入肼基甲酸丁酯（bh）的無(wú)水dmf溶液，室溫避光攪拌24h，在去離子水中進(jìn)行沉淀，抽濾并用丙酮清洗，獲得中間產(chǎn)物，即ph響應(yīng)的氨甲喋呤前驅(qū)體（mtx-bh）。

（4）將步驟（3）得到的mtx-bh加入二氯甲烷（dcm）和三氟乙酸（tfa）體積比為1：1的混合液中，避光攪拌30min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到黃色的固體；

（5）將步驟（4）得到的固體盡可能分散于甲苯中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲苯，重復(fù)三次，最后再用乙醚清洗三次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，這樣得到脫叔丁氧羰基保護(hù)的mtx-bh藥物前驅(qū)體；

（6）將步驟（5）得到的脫叔丁氧羰基保護(hù)的mtx-bh藥物前驅(qū)體溶于無(wú)水dmf中，加入dox的甲醇溶液，室溫避光反應(yīng)72h，最后在甲醇中透析除去未反應(yīng)的dox即可得到所需產(chǎn)物（mtx-dox），即ph響應(yīng)與協(xié)同治療的靶向兩親性小分子前藥mtx-dox。

進(jìn)一步的，步驟（1）中mtx、nhs、edc·hcl三者物質(zhì)的量的比為1:1:1-1:1.5:1.5，需要將mtx、nhs、edc·hcl三者完全溶解在dmf中。

進(jìn)一步的，步驟（3）中bh與步驟（1）中mtx的物質(zhì)的量的比為1:1-1.5:1。步驟（4）中每1mmolmtx-bh需要dcm和tfa混合溶液為20ml。

進(jìn)一步的，步驟（6）中脫叔丁氧羰基保護(hù)的mtx-bh藥物前驅(qū)體與dox物質(zhì)的量比為1:2-1:3。

進(jìn)一步的，步驟（4）、（5）和（6）需要連續(xù)進(jìn)行；所述步驟（5）和（6）中的脫叔丁氧羰基保護(hù)后的mtx-bh放置時(shí)間不可超過(guò)一周。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)有：

1.針對(duì)目前小分子前藥遞送系統(tǒng)存在的問(wèn)題，本發(fā)明創(chuàng)造性地提出一種兼具小分子前藥和納米藥物優(yōu)勢(shì)于一體的基于ph響應(yīng)兩親性小分子前藥自組裝的遞送系統(tǒng)，能有效提高藥物上載量和雙藥協(xié)同效應(yīng)，解決當(dāng)前小分子前藥遞送系統(tǒng)靶向傳遞以及藥物選擇性的可控釋放問(wèn)題，推動(dòng)腫瘤的精確診斷與高效治療。

2、在本發(fā)明中，氨甲蝶呤藥物分子的引入，形成的納米粒子可暫時(shí)屏蔽藥物分子的熒光，內(nèi)吞作用下進(jìn)入細(xì)胞，納米粒子解組裝，藥物分子的熒光可得到還原，實(shí)現(xiàn)藥物的追蹤，藥物在刺激響應(yīng)下釋放出兩種藥物，實(shí)現(xiàn)癌癥的治療與藥物的追蹤也是本項(xiàng)目的最大特色之一。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中ph響應(yīng)的靶向兩親性小分子前藥（mtx-dox）的合成示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中ph響應(yīng)的靶向兩親性小分子前藥（mtx-dox）的核磁示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中ph響應(yīng)的靶向兩親性小分子前藥（mtx-dox）的紅外示意圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中小分子前藥納米膠束的dls圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中ph響應(yīng)的靶向兩親性小分子前藥（mtx-dox）納米粒子的體外釋藥示意圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中小分子藥物納米膠束對(duì)kb癌細(xì)胞作用48h的體外毒性圖（a）及其對(duì)a549細(xì)胞和kb細(xì)胞的對(duì)比作用圖（b）。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1制備ph刺激響應(yīng)的mtx-dox兩親性小分子前藥

（1）在冰浴，氬氣(ar)氛圍條件下，首先將1.034gmtx溶于25ml無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，接著分別加入260.5mgn-羥基丁二酰亞胺（nhs）和447.0mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（edc·hcl）；冰水浴中攪拌30min后，將325.3mg肼基甲酸丁酯（bh）溶于5ml無(wú)水dmf溶液，加入上述反應(yīng)溶液中，室溫避光攪拌24h；在去離子水中進(jìn)行沉淀，抽濾并用丙酮清洗，即可獲得穩(wěn)定產(chǎn)物ph響應(yīng)的氨甲喋呤前驅(qū)體（mtx-bh）308.0mg，產(chǎn)率為23.82%。

（2）首先mtx-bh中氨基的脫叔丁氧羰基保護(hù)反應(yīng)，將步驟（1）反應(yīng)的部分產(chǎn)物mtx-bh85.4mg加入1.5mldcm和tfa體積比為1：1的混合液中，避光攪拌30min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到的固體盡可能分散于2.5ml甲苯中，旋蒸除去甲苯，重復(fù)三次，最后再用2.5ml乙醚清洗三次，旋蒸出去乙醚，得到脫叔丁氧羰基保護(hù)的mtx藥物前驅(qū)體；將得到的全部脫叔丁氧羰基保護(hù)的mtx藥物前驅(qū)體溶于5ml無(wú)水dmf中，加入含180.1mgdox的甲醇溶液5ml，避光反應(yīng)72h，甲醇中透析即可得到所需產(chǎn)物ph響應(yīng)與協(xié)同治療的靶向兩親性小分子前藥mtx-dox86.4mg，產(chǎn)率57.97%。其合成過(guò)程見(jiàn)圖1；核磁表征結(jié)果見(jiàn)圖2，mtx-bh中1.37ppm的峰即為叔丁氧羰基的氫譜峰，mtx-dox中8.6ppm處的出峰為肼基氫譜峰；紅外表征圖見(jiàn)圖3，1600-1575cm^-1處的出峰即為肼基氫的峰。

（3）制備小分子前藥納米膠束：室溫情況下，配備5mg/ml的mtx-dox的二甲基亞砜（dmso）溶液，加入極少量的三乙胺（tea）攪拌均勻（1mgmtx-dox加1μltea），緩慢滴加到去離子水中，攪拌一定時(shí)間后，二次水中透析獲得淺紅色的小分子前藥納米膠束。如圖4，其dls結(jié)果顯示前藥納米膠束為70.27nm，其粒徑分布系數(shù)為0.205。對(duì)所得納米粒子的體外釋放進(jìn)行測(cè)定，由圖5可得當(dāng)ph為5.04時(shí)，藥物的累計(jì)釋放率可達(dá)85%，而當(dāng)ph增大至6.80，7.44時(shí)，釋放率顯著降低。圖6a是所得納米膠束與游離藥物對(duì)kb腫瘤細(xì)胞作用48h的體外毒性對(duì)比示意圖，圖6b是納米膠束靶向毒性示意圖（kb細(xì)胞表面相對(duì)a549細(xì)胞有較多的葉酸受體），由圖可知mtx-dox納米藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性隨濃度增大而增加，且對(duì)a549腫瘤細(xì)胞的毒性相對(duì)kb腫瘤細(xì)胞要小。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。