本發(fā)明屬于納米藥物領(lǐng)域，具體涉及針對多金屬氧酸鹽作為抗癌藥物的局限性，利用生物相容材料對其進(jìn)行包裹，從而制備出載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑。

背景技術(shù)：

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)在2016年發(fā)布的《globecancer2016》顯示出：癌癥已經(jīng)成為除心腦血管疾病以外的全球人類死亡的第一因素，發(fā)展能夠更加有效地治療癌癥的手段，對促進(jìn)人類健康具有重大意義。納米藥物的出現(xiàn)，為癌癥治療帶來了新的希望。納米載藥系統(tǒng)是一種新型納米級別的給藥系統(tǒng)，用合成或天然的高分子材料作為載體，利用納米技術(shù)對藥物進(jìn)行包裹或者修飾制得粒徑在10～1000nm的藥物輸送系統(tǒng)。納米載藥系統(tǒng)的載體一般都具有體內(nèi)長循環(huán)和靶向功能，因此，納米載藥系統(tǒng)在癌癥治療的發(fā)展中具有重大意義。

用于納米載藥系統(tǒng)的抗癌藥物有多種，如阿霉素、多西紫杉醇等，本發(fā)明所用具有抗癌作用的藥物是一種新型無機(jī)材料——多金屬氧酸鹽(poms)，它是由前過渡金屬離子通過氧連接而形成的一類多金屬氧簇化合物。它豐富的結(jié)構(gòu)類型和巨大的抗癌潛力使其具有成為高效化療藥物的可能，但其水溶性差且在水相中不穩(wěn)定，因而限制其在抗癌領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明利用具有生物相容性的材料對其進(jìn)行包裹，再用靶向分子葉酸對納米載體表面進(jìn)行修飾，制備出可用于癌癥治療的新型納米制劑，為新一代納米體系發(fā)展提供基礎(chǔ)，促進(jìn)針對腫瘤治療的研究發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服多金屬氧酸鹽的抗癌應(yīng)用局限性，本發(fā)明提供了一種載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑及其制備方法。

載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑是利用生物材料對多金屬氧酸鹽進(jìn)行包裹制得納米載體，再用靶向分子葉酸對納米載體表面進(jìn)行修飾；所用的生物材料為具有生物相容性的pla-peg2000及tpgs-cooh。所用多金屬氧酸鹽(poms)為[eu(h2o)3(p2w17o61)]2。

所述采用的技術(shù)方案是利用具有生物相容性的材料，采用單乳超聲法對多金屬氧酸鹽進(jìn)行包裹，再進(jìn)行葉酸表面修飾，最終制備出具有體內(nèi)長循環(huán)、療效高、毒副作用小、穩(wěn)定性好等功能的新型納米制劑。

本發(fā)明的具體步驟為：

步驟1、生物材料tpgs-cooh的制備：

1)分別稱取維他命e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)757mg、n，n-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)103mg、戊二酸66mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于10ml二甲基亞砜中，室溫下反應(yīng)24小時(shí)；

3)步驟2)的反應(yīng)過程會產(chǎn)生n，n-二環(huán)己基脲，通過過濾去除該副產(chǎn)物。將濾液轉(zhuǎn)移進(jìn)入透析袋，以二甲基亞砜為透析液，透析24小時(shí)去除未反應(yīng)的dcc。冷凍干燥，得到tpgs-cooh；

步驟2、載多金屬氧酸鹽納米載體的制備：

1)配制60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液，作為乳化劑，備用；

2)分別稱取多金屬氧酸鹽25mg、pla-peg200050mg及步驟1所得tpgs-cooh80mg混合溶于4ml的三氯甲烷中，備用；

3)輕柔攪拌下將步驟2)所得溶液緩慢倒入步驟1)的60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液中；

4)利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將步驟3)的混合溶液在25w條件下超聲120s得到乳液，將該乳液在室溫下攪拌過夜蒸發(fā)有機(jī)溶劑三氯甲烷，得到納米粒子懸浮液；

5)將步驟4)得到的納米粒子懸浮液在離心機(jī)上以10500rpm離心15min后得到納米粒子；

6)用蒸餾水洗滌步驟5)得到的納米粒子，并超聲再次打碎，如此反復(fù)三次后可得到產(chǎn)物，并將其分散于水中，凍干兩天得到納米粉體。

步驟3、用葉酸對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進(jìn)行修飾：

a、氨基化葉酸(fol-nh2)的制備：

1)分別稱取葉酸(fol)441.4mg、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)230mg、n，n-二環(huán)己基碳二亞胺(edc)103mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于30ml二甲基亞砜中，50℃下反應(yīng)6小時(shí)；

3)步驟2)的反應(yīng)過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物n，n-二環(huán)己基脲，通過過濾去除該副產(chǎn)物；

4)在步驟3)所得的濾液中加入過量的乙二胺，以吡啶為催化劑，過夜反應(yīng)；

5)在步驟4)反應(yīng)完全的混合溶液中加入大量的乙腈將氨基化葉酸(fol-nh2)沉淀出來，離心收集，真空過濾后，放入真空干燥箱中烘干。

b、用氨基化葉酸(fol-nh2)對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進(jìn)行修飾：

1)稱取步驟2所得的納米粒子10mg分散于5ml蒸餾水中，超聲30分鐘；

2)在步驟1)所得溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/edc/nhs＝1∶20∶6.7加入nhs和edc，edc為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，激活納米粒子表面的羧基端；

3)在步驟2)所得混合溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/fol-nh2＝1∶10加入fol-nh2；

4)在步驟3)所得混合溶液中加三乙胺調(diào)節(jié)ph值至8，37℃下反應(yīng)4個(gè)小時(shí)后進(jìn)行離心；

5)用二甲基亞砜洗滌步驟4)離心得到的混合物，以去除未反應(yīng)的fol-nh2，然后再用去離子水洗滌。冷凍干燥，得到表面經(jīng)葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑。

本發(fā)明利用具有生物相容性的材料對多金屬氧酸鹽進(jìn)行包裹，再進(jìn)行葉酸表面修飾，制得具有體內(nèi)長循環(huán)、主動(dòng)靶向、療效高、毒副作用小等功能的新型納米制劑，有效克服多金屬氧酸鹽水溶性差且在水相中不穩(wěn)定的缺陷，進(jìn)一步發(fā)揮多金屬氧酸鹽的抗癌作用，開闊其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，為癌癥治療的納米體系發(fā)展提供新的思路，促進(jìn)針對癌癥治療的研究發(fā)展。

附圖說明

圖1為制備載多金屬氧酸鹽抗癌納米制劑的過程圖；

圖2為載多金屬氧酸鹽納米粒的sem檢測圖；

如圖所示，多金屬氧酸鹽被生物材料包裹，制備的納米粒子呈橢球狀；

圖3為載多金屬氧酸鹽納米粒的粒徑分布圖；

如圖所示，載多金屬氧酸鹽納米粒粒徑的平均尺寸在174.2nm；

圖4為無葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米粒細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)；

如圖所示，制備出的無葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，比較不同劑量不同時(shí)長下，癌細(xì)胞的存活率雖然呈現(xiàn)出降低趨勢，但總體效果不明顯；

圖5為葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米粒細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)；

如圖所示，制備出經(jīng)葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，比較不同劑量不同時(shí)長下，癌細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)出明顯降低趨勢，且在200μg/ml、24h時(shí)達(dá)到最低，不足1％；

由圖4、圖5，首先說明本發(fā)明所制備的納米制劑具有抗癌作用，二者對比看出經(jīng)葉酸修飾的納米制劑具有良好的靶向作用，能夠更好地靶向作用于癌細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

生物材料tpgs-cooh的制備：

1)分別稱取維他命e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)757mg、n，n-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)103mg、戊二酸66mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于10ml二甲基亞砜中，室溫下反應(yīng)24小時(shí)；

3)步驟2)的反應(yīng)過程會產(chǎn)生n，n-二環(huán)己基脲，通過過濾去除該副產(chǎn)物。將濾液轉(zhuǎn)移進(jìn)入透析袋，以二甲基亞砜為透析液，透析24小時(shí)去除未反應(yīng)的dcc。冷凍干燥，得到tpgs-cooh；；

實(shí)施例2

載多金屬氧酸鹽納米載體的制備：

1)配制60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液，作為乳化劑，備用；

2)分別稱取多金屬氧酸鹽25mg、pla-peg200050mg及步驟1所得tpgs-cooh80mg混合溶于4ml的三氯甲烷中，備用；

3)輕柔攪拌下將步驟2)所得溶液緩慢倒入步驟1)的60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液中；

4)利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將步驟3)的混合溶液在25w條件下超聲120s得到乳液，將該乳液在室溫下攪拌過夜蒸發(fā)有機(jī)溶劑三氯甲烷，得到納米粒子懸浮液；

5)將步驟4)得到的納米粒子懸浮液在離心機(jī)上以10500rpm離心15min后得到納米粒子；

6)用蒸餾水洗滌步驟5)得到的納米粒子，并超聲再次打碎，如此反復(fù)三次后可得到產(chǎn)物，并將其分散于水中，凍干兩天得到納米粉體。

實(shí)施例3

用葉酸對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進(jìn)行修飾：

a、氨基化葉酸(fol-nh2)的制備：

1)分別稱取葉酸(fol)441.4mg、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)230mg、n，n-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)103mg，備用；

2)將步驟1)稱取的藥品混合溶于30ml二甲基亞砜中，50℃下反應(yīng)6小時(shí)；

3)步驟2)的反應(yīng)過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物n，n-二環(huán)己基脲，通過過濾去除該副產(chǎn)物；

4)在步驟3)所得的濾液中加入過量的乙二胺，以吡啶為催化劑，過夜反應(yīng)；

5)在步驟4)反應(yīng)完全的混合溶液中加入大量的乙腈將氨基化葉酸(fol-nh2)沉淀出來，離心收集，真空過濾后，放入真空干燥箱中烘干。

b、用氨基化葉酸(fol-nh2)對載多金屬氧酸鹽納米載體表面進(jìn)行修飾：

1)稱取步驟2所得的納米粒子10mg分散于5ml蒸餾水中，超聲30分鐘；

2)在步驟1)所得溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/edc/nhs＝1∶20∶6.7加入nhs和edc，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，激活納米粒子表面的羧基端；

3)在步驟2)所得混合溶液中以摩爾比為tpgs-cooh/fol-nh2＝1∶10加入fol-nh2；

4)在步驟3)所得混合溶液中加三乙胺調(diào)節(jié)ph值至8，37℃下反應(yīng)4個(gè)小時(shí)后進(jìn)行離心；

5)用二甲基亞砜洗滌步驟4)離心得到的混合物，以去除未反應(yīng)的fol-nh2，然后再用去離子水洗滌。冷凍干燥，得到表面經(jīng)葉酸修飾的載多金屬氧酸鹽納米制劑。