本發(fā)明涉及一種貉犬瘟熱凍干活疫苗及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬犬瘟熱病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，幼齡動(dòng)物多為急性、致死性經(jīng)過，成年動(dòng)物可成慢性、持續(xù)性感染，臨床癥狀以雙相體溫升高，伴有卡他性肺炎、胃腸炎為主要特征，偶有神經(jīng)癥狀出現(xiàn)，容易繼發(fā)其他細(xì)菌病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高達(dá)80％，是危害我國毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的最嚴(yán)重的疫病之一。

貉犬瘟熱全年任何季節(jié)都能夠發(fā)生，尤其是仔貉在斷乳前后以及育成期更加敏感，具有非常高的發(fā)病率和死亡率，老齡貉具有一定的抵抗力。帶毒動(dòng)物是貉犬瘟熱的主要傳染源，通過眼及鼻分泌物、唾液、尿、糞便排出病毒，主要經(jīng)消化道、呼吸道傳染。由于貉犬瘟有發(fā)病急、缺乏特效治療方法的特點(diǎn)，貉犬瘟熱仍以疫苗接種作為主要的防控手段，然而目前市場上并沒有貉犬瘟熱疫苗銷售，很多養(yǎng)殖戶以犬、水貂等動(dòng)物的犬瘟熱疫苗用以預(yù)防貉犬瘟熱，無法取得較好的免疫保護(hù)效果。因此，開發(fā)安全、免疫效果良好的貉犬瘟熱疫苗，不僅是行業(yè)和市場的迫切需求，具有廣闊的市場應(yīng)用前景，對于防控貉犬瘟熱具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種貉犬瘟熱凍干活疫苗及其制備方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明通過貉體連續(xù)傳代的方式，人工馴化了犬瘟熱疫苗株cdv-o2，獲得了一株對貉安全、免疫原性良好、滴度穩(wěn)定的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12，并以此毒株制備了貉犬瘟熱凍干活疫苗。

本發(fā)明的一種貉犬瘟熱凍干活疫苗，其有效成分為貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株，所述的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株命名為cdv-or12株，分類命名為犬瘟熱病毒caninedistempervirus，該疫苗株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，微生物保藏號為cgmccno.13793，保藏時(shí)間為2017年04月21日。

在本發(fā)明所述的貉犬瘟熱凍干活疫苗中，優(yōu)選的，所含有的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥10^4.5/頭份，更優(yōu)選的，所含有的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的tcid50為10^4.5-10^5.5/頭份。

在本發(fā)明所述的貉犬瘟熱凍干活疫苗中，優(yōu)選的，還包括凍干保護(hù)劑，所述的凍干保護(hù)劑中包括明膠、水解乳蛋白和蔗糖。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種制備所述貉犬瘟熱凍干活疫苗的方法，其包括以下步驟：

(1)取所述的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12株以吸附接毒的方式接種vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到75-85％時(shí)通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒含量、純凈性檢驗(yàn)，將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于-20℃；

(2)將明膠、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照質(zhì)量百分比計(jì)，使明膠的終濃度為2～7％，水解乳蛋白的終濃度為10～25％，蔗糖終濃度為15～30％，于116℃、20min高壓滅菌后得到凍干保護(hù)劑；

(3)按照3～5體積份病毒液加入2體積份凍干保護(hù)劑的比例，將步驟(1)得到的病毒液與凍干保護(hù)劑充分混合，定量分裝于無菌的青瓶內(nèi)，加蓋置于凍干機(jī)內(nèi)預(yù)凍、干燥，即得。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟(1)中所述的病毒液中貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥10^6.0/ml。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，制備得到的疫苗成品中貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥10^4.5/頭份，更優(yōu)選的，所含有的貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的tcid50為10^4.5-10^5.5/頭份。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的貉犬瘟熱凍干活疫苗在制備預(yù)防貉犬瘟熱藥物中的用途。

實(shí)驗(yàn)證明，以此毒株制備得到的貉犬瘟熱凍干活疫苗可有效保護(hù)貉免于犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的攻擊，免疫3周和3個(gè)月后保護(hù)率均為100％，免疫6個(gè)月后保護(hù)率為90％，因此，該疫苗可有效預(yù)防貉犬瘟熱的發(fā)生，免疫期為6個(gè)月。-15℃以下貉犬瘟熱凍干活疫苗的保存期為15個(gè)月。本發(fā)明的提出為貉犬瘟熱的防控提供了一種新的技術(shù)手段。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1犬瘟熱病毒疫苗株cdv-o2的馴化及鑒定

1.犬瘟熱病毒疫苗株cdv-o2的馴化

(1)將保存的犬瘟熱病毒疫苗株cdv-o2以吸附接毒的方式接種于非洲綠猴腎細(xì)胞(vero)上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80％左右時(shí)通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒含量(tcid50≥10^5.0/ml)、無菌檢驗(yàn)。將檢驗(yàn)合格的病毒液分裝，并保存于-20℃。

(2)將擴(kuò)增的cdv-o2病毒液原液后肢肌肉接種抗體陰性健康貉3只，每只5ml，分三點(diǎn)接種，隔離飼養(yǎng)并每天觀察接種貉各項(xiàng)生理指標(biāo)。接種后第3、5天分別剖殺貉1只，無菌條件下采集脾臟，并利用vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，并通過犬瘟熱病毒特異性引物及犬瘟熱病毒陽性血清進(jìn)行鑒定。

(3)將分離到的犬瘟熱病毒標(biāo)記為cdv-or3，即為貉體內(nèi)馴化第1代(f1)，將cdv-or3以吸附接毒的方式接種于vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80％左右時(shí)通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒含量(tcid50≥10^5.0/ml)、無菌檢驗(yàn)。將檢驗(yàn)合格的病毒液分裝，并保存于-20℃。

(4)重復(fù)步驟(2)、(3)，將犬瘟熱病毒在貉體內(nèi)再連續(xù)馴化9次，得到犬瘟熱病毒弱毒疫苗株，其為在貉體內(nèi)馴化的第10代(f10)毒株，將該毒株命名為cdv-or12株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，微生物保藏號為cgmccno.13793，保藏時(shí)間為2017年04月21日。

2.犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12對貉免疫原性測定

取保存的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12，調(diào)整病毒含量為10^4.5tcid50/ml，后肢肌肉接種抗體陰性健康貉5只，每只1ml，接種21天后測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)，并用犬瘟熱病毒強(qiáng)毒hbf-1株攻毒，測定保護(hù)率。結(jié)果表明，犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12接種貉血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)分別為：1:256、1:362、1:256、1:181、1:362，攻毒保護(hù)率為100％(5/5)。

3.犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12對貉的毒力返強(qiáng)試驗(yàn)

取保存的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12連續(xù)5代肌肉接種抗體陰性貉，每代連續(xù)觀察14天。結(jié)果顯示每代接種貉體溫、食欲、精神狀態(tài)、糞便等生理指標(biāo)均表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)犬瘟熱癥狀，說明該犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12無毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，可用于貉犬瘟熱疫苗的研究。

實(shí)施例2貉犬瘟熱凍干活疫苗(cdv-or12株)的制備

1.犬瘟熱病毒制苗液的制備

取保存的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株cdv-or12株以吸附接毒的方式接種vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80％左右時(shí)通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒含量、純凈性檢驗(yàn)，得到的病毒液中貉犬瘟熱病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥10^4.5/ml。將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于-20℃。

2.制備凍干保護(hù)劑

將明膠、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照質(zhì)量百分比計(jì)，使明膠的終濃度為5％，水解乳蛋白的終濃度為15％，蔗糖終濃度為25％，于116℃、20min高壓滅菌后得到。

3.貉犬瘟熱凍干活疫苗的制備

按照4體積份病毒液加入2體積份凍干保護(hù)劑的比例，將收獲的犬瘟熱病毒制苗液與凍干保護(hù)劑充分混合，定量分裝于無菌的青瓶內(nèi)，加蓋置于凍干機(jī)內(nèi)預(yù)凍、干燥。

4.疫苗成品中犬瘟熱病毒含量的測定

疫苗成品進(jìn)行病毒含量測定，犬瘟熱病毒含量tcid50為10^4.5-10^5.5/頭份。

實(shí)施例3貉犬瘟熱凍干活疫苗(cdv-or12株)的安全性試驗(yàn)

取檢驗(yàn)合格的貉犬瘟熱凍干活疫苗(實(shí)施例2制備)，后肢肌肉接種抗體陰性貉，設(shè)單劑量(接種1頭份，犬瘟熱病毒含量tcid50＝10^4.5/頭份)、單劑量重復(fù)和超劑量(10倍)接種免疫組，同時(shí)設(shè)不接種疫苗貉作為陰性對照。疫苗接種后，連續(xù)14天觀察貉的體溫、食欲、精神狀態(tài)、糞便等生理指標(biāo)，并剖檢觀察接種貉主要臟器病變情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，貉經(jīng)單劑量、單劑量重復(fù)和超劑量接種后，各項(xiàng)生理指標(biāo)均正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，剖檢觀察接種貉主要臟器無病變。說明貉犬瘟熱凍干活疫苗對貉安全。

實(shí)施例4貉犬瘟熱凍干活疫苗(cdv-or12株)的效力及免疫期試驗(yàn)

取檢驗(yàn)合格的貉犬瘟熱凍干活疫苗(實(shí)施例2制備)，后肢肌肉接種抗體陰性貉，每只1ml(含1頭份，犬瘟熱病毒含量tcid50＝10^4.5/頭份)，同時(shí)設(shè)接種vero細(xì)胞培養(yǎng)液對照組。接種3周、3個(gè)月、6個(gè)月和9個(gè)月后采血、分離血清，測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體，同時(shí)使用100個(gè)半數(shù)致死量(ld50)的犬瘟熱檢驗(yàn)用強(qiáng)毒hbf-1進(jìn)行攻擊，連續(xù)14天觀察攻毒貉體溫、食欲、精神狀態(tài)、糞便等生理指標(biāo)。

結(jié)果表明，接種3周和3個(gè)月后，接種貉血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)均在1:256以上，貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率均為100％(10/10)；接種6個(gè)月后，貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率為90％(9/10)；接種9個(gè)月后，貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率為70％(7/10)。因此，該疫苗的免疫期定為6個(gè)月。

實(shí)施例5貉犬瘟熱凍干活疫苗(cdv-or12株)與同類疫苗(cdv3-cl株)對貉的免疫效力比較試驗(yàn)

取檢驗(yàn)合格的貉犬瘟熱凍干活疫苗(實(shí)施例2制備)，以及市場上銷售的水貂犬瘟熱活疫苗(cdv3-cl株)分別后肢肌肉接種抗體陰性貉，每只接種1頭份(犬瘟熱病毒含量tcid50＝10^4.5/頭份)，同時(shí)設(shè)未接種疫苗的對照組。接種3周、3個(gè)月、6個(gè)月和9個(gè)月后采血、分離血清，測定血清中犬瘟熱病毒中和抗體，同時(shí)使用100個(gè)半數(shù)致死量(ld50)的犬瘟熱檢驗(yàn)用強(qiáng)毒hbf-1進(jìn)行攻擊，連續(xù)14天觀察攻毒貉體溫、食欲、精神狀態(tài)、糞便等生理指標(biāo)。

結(jié)果表明，接種3周和3個(gè)月后，貉犬瘟熱凍干活疫苗免疫組血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)均在1:256，接種貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率為100％(10/10)，水貂犬瘟熱活疫苗免疫組血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)均在1:128以上，接種貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率為100％(10/10)；接種6個(gè)月后，貉犬瘟熱凍干活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率為100％(10/10)，水貂犬瘟熱活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率為80％(8/10)；接種9個(gè)月后，貉犬瘟熱凍干活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率為70％(7/10)，水貂犬瘟熱活疫苗免疫組接種貉對犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的保護(hù)率僅為50％(5/10)。因此，本發(fā)明所制備的貉犬瘟熱凍干活疫苗(cdv-or12株)的免疫效力優(yōu)于臨床上應(yīng)用的水貂犬瘟熱活疫苗。

實(shí)施例6貉犬瘟熱凍干活疫苗(cdv-or12株)保存期測定

將檢驗(yàn)合格的貉犬瘟熱凍干活疫苗(實(shí)施例2制備)保存于-15℃以下，每3個(gè)月測定疫苗樣品中犬瘟熱病毒的含量。結(jié)果表明，貉犬瘟熱凍干活疫苗在-15℃以下保存9個(gè)月后病毒含量開始下降，下降幅度為10^0.13～10^0.17；保存15個(gè)月后疫苗病毒含量仍在10^4.5tcid50/頭份以上；保存18個(gè)月后疫苗病毒含量降到10^4.5tcid50/頭份以下。因此，該疫苗在-15℃以下的保存期為15個(gè)月。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明制備得到的貉犬瘟熱凍干活疫苗可有效保護(hù)貉免于犬瘟熱病毒強(qiáng)毒的攻擊，有效預(yù)防貉犬瘟熱的發(fā)生。