本發(fā)明涉及漁藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，屬于殺滅寄生蟲(chóng)藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及大黃素的新用途，具體涉及一種大黃素在制備殺滅魚(yú)類體外寄生纖毛蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：寄生纖毛蟲(chóng)病是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖最為嚴(yán)重的病害之一，特別是多子小瓜蟲(chóng)病。該病分布范圍廣、無(wú)寄主專一性、發(fā)病快，死亡率高，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來(lái)，多子小瓜蟲(chóng)病的防治主要以孔雀石綠和汞制劑等化學(xué)藥物為主。由于這些化學(xué)藥物有毒性大、殘留高、致癌、致畸、致突變以及污染環(huán)境等危害，已經(jīng)在食用魚(yú)生產(chǎn)中禁用。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的環(huán)保、高效的防治藥物。我國(guó)中草藥資源豐富，其成分易降解、殘留低，已有研究表明部分中草藥殺滅多子小瓜蟲(chóng)的效果較好，這為我們尋找高效、安全的殺小瓜蟲(chóng)藥物開(kāi)辟了新途徑。大黃素是一種來(lái)自于多種藥用植物中的蒽醌類化合物，其結(jié)構(gòu)式為：大黃素分子式：c15h10o5，分子量：269.2，為黃色粉末。有研究報(bào)道，大黃素具有利尿，血管舒張，止咳，抗細(xì)菌，抗病毒，抗?jié)?，抗炎和抗癌等作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種大黃素在制備殺滅魚(yú)類體外寄生纖毛蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用，特別是在制備殺滅多子小瓜蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：大黃素在制備殺滅魚(yú)類體外寄生纖毛蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。所述的魚(yú)類體外寄生纖毛蟲(chóng)指多子小瓜蟲(chóng)(ichthyophthiriusmultifiliis)。所述的藥物制成藥液或粉劑。所述的藥物含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述的大黃素有效且安全的濃度為0.5～0.85mg每升魚(yú)類養(yǎng)殖用水。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)本發(fā)明首次將大黃素應(yīng)用于制備殺滅魚(yú)類體外寄生蟲(chóng)藥物，特別是用于殺滅多子小瓜蟲(chóng)。(2)大黃素來(lái)源于天然植物，無(wú)殘留、無(wú)污染、無(wú)公害，對(duì)人體無(wú)毒，所以在環(huán)境中易降解，并能在有效劑量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)一次性全部殺滅寄生蟲(chóng)，達(dá)到防治小瓜蟲(chóng)病的效果；具有開(kāi)發(fā)成新型環(huán)保防治魚(yú)類體外寄生纖毛蟲(chóng)漁藥的廣闊應(yīng)用前景。(3)大黃素對(duì)魚(yú)的半致死濃度分別為殺滅多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)半有效濃度的17.8倍和7.0倍，在殺蟲(chóng)有效劑量范圍內(nèi)對(duì)魚(yú)安全。(4)大黃素來(lái)源豐富，其提取制備工藝簡(jiǎn)單，具有廣闊的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例中用到的寄主模型魚(yú)為草魚(yú)(ctenopharyngodonidellus)，來(lái)源于廣州市花都區(qū)五星村魚(yú)苗場(chǎng)。寄生蟲(chóng)模型為多子小瓜蟲(chóng)(ichthyophthiriusmultifiliis)，來(lái)源于廣州市花地灣花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)。實(shí)施例1：大黃素對(duì)多子小瓜蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)的殺滅作用(1)藥物的配制：稱取大黃素粉末1.5mg，用20μl無(wú)水乙醇促溶，加入蒸餾水配制成濃度為1280mg/l的儲(chǔ)備液，用二倍梯度稀釋法依次稀釋至64、32、16、8、4、2、1、0.5和0mg/l(對(duì)照)。以實(shí)驗(yàn)用最高濃度藥液中無(wú)水乙醇的含量(0.08％)為標(biāo)準(zhǔn)，配制含0.08％無(wú)水乙醇的對(duì)照組處理液。(2)取96孔板，各孔中加入100μl約含200只幼蟲(chóng)的蟲(chóng)液，接著在各孔中加入100μl不同濃度的藥液，使最終藥物濃度依次為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/l(對(duì)照)，各藥物濃度5個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)溫度保持為23±0.5℃，在4倍物鏡下記錄不同藥物濃度中幼蟲(chóng)的致死時(shí)間和4h各孔的幼蟲(chóng)數(shù)，并計(jì)算致死率和半數(shù)有效濃度ec50(見(jiàn)表3)，計(jì)算公式如下：致死率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)后各孔幼蟲(chóng)個(gè)數(shù)/實(shí)驗(yàn)前各孔幼蟲(chóng)個(gè)數(shù))×100％結(jié)果表明：大黃素濃度為1mg/l時(shí)，能在4h內(nèi)100％殺滅多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)。隨著濃度的增加，殺幼蟲(chóng)時(shí)間縮短。實(shí)施例2：大黃素對(duì)多子小瓜蟲(chóng)成蟲(chóng)的殺滅作用(1)大黃素藥物的配制：同實(shí)施例1。(2)取24孔板，將含有大約60個(gè)成蟲(chóng)的200μl水溶液加入到各孔中，并在4倍顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)各孔成蟲(chóng)數(shù)量，隨后向各孔中加入200μl不同濃度的藥液，使藥液的終濃度依次為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/l，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)溫度為23±0.5℃。在4倍顯微鏡下觀察記錄5h內(nèi)成蟲(chóng)的死亡時(shí)間和第5h的死亡率，計(jì)算出5h致死率和5h半數(shù)有效濃度(ec50)(見(jiàn)表3)。未死亡的成蟲(chóng)將形成包囊繼續(xù)孵化，在實(shí)驗(yàn)的第22h，包囊完全孵化后，在4倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)各孔中的幼蟲(chóng)數(shù)，并計(jì)算平均每個(gè)包囊孵出的幼蟲(chóng)數(shù)計(jì)算公式如下：死亡率(％)＝各孔實(shí)驗(yàn)后死亡的成蟲(chóng)數(shù)/各孔實(shí)驗(yàn)前總成蟲(chóng)數(shù)×100％平均每個(gè)包囊孵出幼蟲(chóng)數(shù)＝各孔幼蟲(chóng)總數(shù)/各孔的包囊數(shù)。結(jié)果表明：2mg/l大黃素能在255.3±10.2min殺死所有成蟲(chóng)。雖然1mg/l的大黃素不能在5h內(nèi)殺死所有成蟲(chóng)，殺蟲(chóng)率為92.6±2.1％，但可以完全抑制包囊孵化，從而阻斷多子小瓜蟲(chóng)的傳播。在0.5和0.25mg/l濃度下，5h內(nèi)的殺蟲(chóng)率分別為62.3±4.5％和34.7±3.1％，并能顯著降低每個(gè)存活包囊釋放幼蟲(chóng)的平均數(shù)量。實(shí)施例3：大黃素藥物對(duì)多子小瓜蟲(chóng)包囊的殺滅作用(1)大黃素藥物的配制：同實(shí)施例1。(2)將200μl含有大約40個(gè)成蟲(chóng)的蟲(chóng)液加入24孔板各孔中，隨后將24孔板靜置于23±0.5℃溫度下6h，待形成包囊后，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)各孔包囊數(shù)，然后向各孔中加入200μl不同濃度的藥液，使藥液的終濃度依次為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/l，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。再繼續(xù)在23±0.5℃下靜置16h，待包囊完全孵化后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)包囊平均孵出幼蟲(chóng)的數(shù)，計(jì)算公式如下：平均每個(gè)包囊孵出幼蟲(chóng)數(shù)＝各孔幼蟲(chóng)數(shù)/各孔的包囊數(shù)結(jié)果表明：大黃素的濃度在大于或等于2mg/l條件下可以殺死包囊，包囊無(wú)感染性幼蟲(chóng)釋放。另外，隨著藥液濃度的降低，平均每個(gè)包囊釋放的感染性幼蟲(chóng)數(shù)增加。實(shí)施例4：低濃度大黃素藥物對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染力的影響(1)大黃素藥物的配制：方法同實(shí)施例1。藥液配置成1、0.8、0.4、0.2、0.1和0mg/l(對(duì)照)。(2)剛孵化的感染性幼蟲(chóng)，用蒸餾水把蟲(chóng)液的濃度調(diào)整為40000個(gè)幼蟲(chóng)每毫升，各取5ml蟲(chóng)液(大約含200000個(gè)幼蟲(chóng))加入50ml的燒杯中，再加入5ml藥液，混勻，使感染性幼蟲(chóng)在終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4和0.5mg/l的大黃素試液中處理2h。將180尾未感染多子小瓜蟲(chóng)的健康草魚(yú)苗，隨機(jī)平均地分配到18個(gè)含5l曝氣自來(lái)水的水族箱中(每個(gè)水族箱10尾魚(yú))，將經(jīng)過(guò)各濃度大黃素藥液處理2h的幼蟲(chóng)倒入各水族箱中，讓其感染草魚(yú)(平均每尾魚(yú)20000只幼蟲(chóng))，每一處理濃度設(shè)置3個(gè)平行。感染2h后，向每個(gè)水族箱中再加入5l曝氣自來(lái)水(每個(gè)水族箱共10l水)，實(shí)驗(yàn)溫度為23±0.5℃，由供氧泵供氧。在實(shí)驗(yàn)的第5天，用150mg/l的麻醉劑(ms222，sigma)麻醉草魚(yú)后，統(tǒng)計(jì)草魚(yú)體表小白點(diǎn)的總數(shù)，并統(tǒng)計(jì)草魚(yú)的感染率和感染強(qiáng)度(表1)。表1低濃度大黃素對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染力的影響濃度(mg/l)每缸幼蟲(chóng)數(shù)每缸魚(yú)數(shù)感染率(％)感染強(qiáng)度0(對(duì)照)20000010100±0.0a243.9±11.1a0.0520000010100±0.0a206.7±49.5b0.120000010100±0.0a61.9±18.3c0.22000001040.0±10.0b13.8±6.1d0.42000001026.7±5.8c4.4±2.7d0.5200000100.0±0.0d0.0±0.0e感染率＝(體表有白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)/總魚(yú)數(shù))×100％；感染強(qiáng)度＝體表白點(diǎn)總數(shù)/體表有白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)。同一縱欄內(nèi)個(gè)數(shù)值右上角標(biāo)有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，標(biāo)有不同字母表示差顯著(p<0.05)。結(jié)果表明：0.5mg/l大黃素處理幼蟲(chóng)2h后，幼蟲(chóng)喪失感染草魚(yú)的能力。處理濃度為0.4mg/l和0.2mg/l時(shí)，草魚(yú)的感染率和感染強(qiáng)度與對(duì)照相比差異顯著。因此，低濃度的大黃素能降低多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的感染力。實(shí)施例5：大黃素對(duì)多子小瓜蟲(chóng)病的防治實(shí)驗(yàn)(1)大黃素藥物的配制：根據(jù)實(shí)施例1方法，配制成5000、3000和0(對(duì)照組)mg/l的藥液。(2)將45尾草魚(yú)苗剪去一部分背鰭做標(biāo)記，然后放入到20l含感染性多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的水中(每升大約10000只感染性幼蟲(chóng))，持續(xù)4小時(shí)，以確保每尾魚(yú)都感染上多子小瓜蟲(chóng)。將感染上多子小瓜蟲(chóng)的草魚(yú)隨機(jī)分到9個(gè)裝有10l曝氣自來(lái)水的玻璃缸(體積15l)中，每缸5尾。再選取90尾健康的草魚(yú)苗，隨機(jī)分配到各個(gè)缸中，使每缸10尾健康魚(yú)，與已感染小瓜蟲(chóng)的草魚(yú)混養(yǎng)。隨后向各缸中加入不同劑量的藥液，混勻，使藥液的終濃度分別為0.5、0.3和0mg/l，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。每天加入與第一天相同劑量的原藥液，持續(xù)加藥10天后停藥，之間在第5天更換50％無(wú)藥液的新鮮曝氣自來(lái)水。在第10天，用150mg/l的麻醉劑(ms222，sigma)麻醉草魚(yú)，隨后記錄草魚(yú)體表白點(diǎn)的個(gè)數(shù)，并把藥液更換成無(wú)藥液的新鮮曝氣自來(lái)水。然后再放置20天，在第20天和第30天時(shí)，再次記錄草魚(yú)體表的白點(diǎn)數(shù)，期間仍不加藥。統(tǒng)計(jì)各組的感染率、感染強(qiáng)度和存活率(表2)。表2大黃素對(duì)小瓜蟲(chóng)病的在體預(yù)防與治療效果“i”表示被感染草魚(yú)；“n”表示未感染草魚(yú)；感染強(qiáng)度＝體表白點(diǎn)總數(shù)/體表存在白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)；感染率(％)＝(體表存在白點(diǎn)的魚(yú)數(shù)/總魚(yú)數(shù))×100％存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)后存活魚(yú)數(shù)/實(shí)驗(yàn)前總魚(yú)數(shù))×100％；同一縱欄內(nèi)個(gè)數(shù)值右上角標(biāo)有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，標(biāo)有不同字母表示差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明：大黃素在0.5mg/l的濃度下，藥物累加治療10天，感染魚(yú)的感染率降到20±20％，未感染魚(yú)的感染率為0；實(shí)驗(yàn)持續(xù)第20天時(shí)，感染魚(yú)和未感染魚(yú)的感染率都為0。大黃素在0.3mg/l濃度下，藥物累加治療10天，感染魚(yú)和未感染魚(yú)的感染強(qiáng)度分別為95.0±21.2和75.3±12.9，顯著低于對(duì)照組。由此可見(jiàn)，0.5mg/l的大黃素藥液可以治療和預(yù)防多子小瓜蟲(chóng)病。實(shí)施例6：大黃素對(duì)草魚(yú)的急性毒性實(shí)驗(yàn)(1)藥液配制：方法同實(shí)施例1。(2)預(yù)實(shí)驗(yàn)：測(cè)定大黃素使實(shí)驗(yàn)草魚(yú)在24h內(nèi)全部死亡的濃度為4mg/l，96h不發(fā)生死亡的濃度2mg/l。(3)向18個(gè)水族箱(體積：15l)中分別加入10l曝氣自來(lái)水，和10尾健康草魚(yú)，溫度控制在23±0.5℃，并由充氧泵供氧。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)置0(對(duì)照)、2、2.5、3、3.5和4mg/l六個(gè)濃度組，進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間隨時(shí)觀察各濃度下實(shí)驗(yàn)魚(yú)的中毒情況，如果發(fā)現(xiàn)草魚(yú)中毒死亡，及時(shí)撈出，以免破壞水質(zhì)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)草魚(yú)的死亡時(shí)間和死亡魚(yú)數(shù)，計(jì)算96h的半致死濃度(lc50)和95％置信區(qū)間(使用spss軟件probit程序計(jì)算)，結(jié)果見(jiàn)表3。藥物對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的安全濃度(sc)，可按下面的公式進(jìn)行計(jì)算得知：sc＝0.3×48hlc50/(24hlc50/48hlc50)2。表3大黃素半數(shù)有效濃度(ec50)及半數(shù)致死濃度(lc50)結(jié)果表明：大黃素對(duì)草魚(yú)96h的lc50為3.149mg/l，大約是其4h殺滅幼蟲(chóng)ec50的17.8倍，是5h殺滅成蟲(chóng)ec50的7倍?？梢?jiàn)大黃素在殺蟲(chóng)有效范圍內(nèi)，對(duì)魚(yú)安全。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12