本申請是申請?zhí)枮閏n201210017896.5，申請日為2012年1月19日，發(fā)明名稱為“一種含有vegf拮抗劑的滴眼液”的分案申請。本發(fā)明涉及醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，具體涉及一種含有vegf拮抗劑的滴眼液。
背景技術(shù)：
：角膜新生血管、新生血管性青光眼、翼狀胬肉、慢性結(jié)膜炎等眼表病的發(fā)病均與新生血管的產(chǎn)生有一定的關(guān)系，vegf的過度表達(dá)可以誘導(dǎo)眼表新生血管形成。其中角膜新生血管不是一種獨(dú)立的角膜病，而是一種病理改變。導(dǎo)致角膜新生血管的原因很多，免疫炎癥性、感染性、變性、外傷性、隱形眼鏡的不當(dāng)使用，醫(yī)源性疾病等。上述原因?qū)е碌慕悄ば律苋绻患皶r治療，最終會導(dǎo)致角膜盲。角膜新生血管為世界范圍視力喪失和失明的主要原因，在美國約4.14％的眼科患者患有角膜新生血管，美國每年有140萬新增角膜新生血管患者，其中12％的會導(dǎo)致視力下降，在美國每年有約17萬新增視力下降的角膜新生血管患者。中國尚沒有關(guān)于角膜新生血管的流行病學(xué)調(diào)查，如果按照美國角膜新生血管占眼科患者4％，其中12％會導(dǎo)致視力下降來計算，2009年全國眼科患者為6283萬，國內(nèi)每年約有30萬的新增患者因角膜新生而影響視力。患者角膜新生血管進(jìn)展會導(dǎo)致視力的進(jìn)一步惡化，最終需要角膜移植才能恢復(fù)視力。因此此類患者需要進(jìn)行有效的抗新生血管治療，以防止視力進(jìn)一步喪失，同時避免進(jìn)行角膜移植，醫(yī)生對于角膜新生血管沒有有效的治療手段。生物藥物，尤其是重組類蛋白許多特性完全不同于小分子化學(xué)分子，其發(fā)生不穩(wěn)定降解反應(yīng)是一個多步驟反應(yīng)。限于目前分析方法的局限，發(fā)生于高級結(jié)構(gòu)的這些飽含多個步驟的降解也很難精確測量到，其穩(wěn)定性，尤其在常規(guī)條件下的保存就是一個很大的挑戰(zhàn)。眼睛是人體最重要的器官之一：大腦的近80％的信息來自眼睛；同時眼睛由于其特殊的生理構(gòu)造，是比較柔弱的組織，對粘度，滲透壓等要求都非常高。因此對于眼用制劑，尤其是有外傷時候采用的眼用制劑要求異常嚴(yán)格。vegf(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)的生物學(xué)效應(yīng)均是通過其特異性受體vegfr(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體)介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的，vegfr可導(dǎo)致由配體介導(dǎo)的二聚體化，受體的二聚體化促使相鄰受體亞基自身磷酸化和去磷酸化，從而觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。vegfr均為酪氨酸蛋白激酶，按其功能和結(jié)構(gòu)分為：fins-樣酪氨酸激酶-1(vegfr-1/flt-1)、激酶插入?yún)^(qū)受體(vegfr-2/flk-1/kdr)、fins-樣酪氨酸激酶-4(vegfr-3/flt-4)及一些低相對分子質(zhì)量vegfr(neuropilin-1)。flt-1和kdr主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，flt-4則主要分布于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上。與vegf相結(jié)合的主要為flt-1和kdr，flt-1與vegf的結(jié)合力較kdr高，他們都是糖基化的跨膜受體，直接參與vegf進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞。flt-1與vegf結(jié)合后能促使血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成和調(diào)節(jié)血管滲透性；kdr與vegf結(jié)合后則能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生及成熟。vegf拮抗劑，尤其是一類人工設(shè)計的靶向基因工程蛋白，如lucentis、avastin、vegf-trap等等，它們能有效地阻斷由血管內(nèi)皮生長因子(vegf)介導(dǎo)的信號傳遞，抑制病變新生血管的生長，并用于治療腫瘤、眼睛等由新生血管引起的疾病，但是上述藥物的已上市的制劑形式為注射劑，其給藥方式為玻璃體直接注射或全身給藥，其制劑形式對于患者而言，其依從性差，且存在諸多不便。因此，研究者開始研究一種患者依從性好，且方便有效的含有vegf拮抗劑的藥物制劑形式，us7303748公開了一種含有vegf-trap的滴眼液，其制劑處方:39.4-103.06mg/mlvegf-trap，5mm磷酸，5mm檸檬酸，100mm氯化鈉，0.005％吐溫-20。但是該滴眼液濃度較大，由于生物制劑一般都存在不穩(wěn)定的問題，目前眼表的抗血管治療患者很多都不愿住院治療，高濃度的生物制劑很容易造成保存和使用的不便，同時眼表給藥是一個特殊的給藥途徑，對ph、滲透壓和局部刺激性，不能添加抑菌劑和抗菌劑等，上述問題使得用于眼表抗新生血管治療藥物的成本昂貴，效果有限。因此，提供一種濃度低，抑制新生血管療效確切的滴眼液，并將其用于治療角膜新生血管、新生血管性青光眼、翼狀胬肉、慢性結(jié)膜炎等多種眼表疾病，對于滿足臨床需求具有顯著的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明需要解決技術(shù)問題之一是提供一種濃度小但是療效確切的含有vegf拮抗劑的滴眼液。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：本發(fā)明一方面提供了一種含有vegf拮抗劑的滴眼液，該滴眼液中含有0.05-9.0mg/ml的vegf拮抗劑；優(yōu)選含有0.1-1.0mg/ml的vegf拮抗劑；更優(yōu)選含有0.5mg/ml的vegf拮抗劑；其中所述vegf拮抗劑優(yōu)選為含有flt-1和kdr的片斷的融合蛋白。上述vegf拮抗劑優(yōu)選具有如下結(jié)構(gòu)之一的融合蛋白：a.fp1，由flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和kdr的第3免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3-fc；b.fp2，由kdr的第1免疫球蛋白樣區(qū)域，flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和kdr的第3免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：kdrd1-fltd2-kdrd3-fc；c.fp3，由flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和kdr的第3-4免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3,4-fc；d.fp4，由flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，kdr的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和flt-1的第4免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3-fltd4-fc；e.fp5，由flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和kdr的第3-5免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3,4,5-fc；或f.fp6，由flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域，kdr的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和flt-1的第4-5免疫球蛋白樣區(qū)域與人免疫球蛋白fc片段融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3-fltd4,5-fc；g.fp7，由flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和kdr的第3-4免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3,4；h.fp8，由flt-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和kdr的第3免疫球蛋白樣區(qū)域融合而成的蛋白：fltd2-kdrd3。以上flt-1和kdr免疫球蛋白樣區(qū)域的氨基酸flt-1d2、flt-1d4、kdrd1、kdrd3、kdrd4見序列表1-5，fp3蛋白的氨基酸序列見序列表6、fp1蛋白的氨基酸序列見序列表7，fp7蛋白的氨基酸序列見序列表8，fp8蛋白的氨基酸序列見序列表9。本發(fā)明提供的滴眼液中，還可以含有以下組分的一種或多種：(a)5-100mm緩沖液，其中的酸選自tris-hcl，檸檬酸，磷酸、磷酸氫鈉，磷酸二氫鈉，醋酸，丁二酸，鹽酸中的一種或多種；(b)5-500mm堿性氨基酸選自賴氨酸，精氨酸，和組氨酸中的一種或其組合；(c)0.1-30％鹽滲透壓劑調(diào)節(jié)劑，其中的糖選自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一種或多種，鹽選自氯化鈉或其它藥學(xué)上可以接受的鹽中的一種或其組合；(d)0.005-0.1％的一種或多種表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇，吐溫20，吐溫80，丙二醇，二甲基亞砜或其它藥學(xué)上可以接受的表面活性劑中的一種或多種；上述組分之一或多種配成的溶液ph為6～8.3。上述滴眼液中所述的vegf拮抗劑最優(yōu)選為如seqidno:6的融合蛋白。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了含有如下組分的滴眼液，具體組分如下：(a)0.05-9mg/ml的如seqidno:6的融合蛋白；(b)5-250mm的檸檬酸；(c)5-500mm的精氨酸或組氨酸的一種或兩種；(d)4-30％的蔗糖或海藻糖；(e)0.01-0.1％的表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇或吐溫20的一種或兩種；(f)調(diào)節(jié)ph為7.5～8.3。本發(fā)明再進(jìn)一步提供了含有如下組分的滴眼液，具體組分如下：(a)0.1-1mg/ml的如seqidno:6的融合蛋白；(b)10-50mm的檸檬酸；(c)50-100mm的精氨酸或組氨酸的一種或兩種；(d)5-20％的蔗糖；(e)0.01-0.1％的表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇或吐溫20的一種或兩種；(f)調(diào)節(jié)ph為7.5～8.3。本發(fā)明更進(jìn)一步提供了含有如下組分的滴眼液，具體組分如下：(a)0.5mg/ml的如seqidno:6的融合蛋白；(b)50mm的檸檬酸；(c)250mm的精氨酸；(d)12.5％的蔗糖；(e)0.05％的吐溫-20；(f)調(diào)節(jié)ph為7.5～8.3。本發(fā)明還提供了上述滴眼液在制備治療由血管新生或生長引起的眼表疾病的藥物中的用途；優(yōu)選為眼表疾病為角膜移植術(shù)后新生血管、角膜新生血管、眼表新生血管或翼狀胬肉的任一種或其并發(fā)癥。中國專利zl200510073595.4和zl200610066257.2公開的技術(shù)內(nèi)容作為本申請的參考；中國未公開專利cn201010267503.7的技術(shù)內(nèi)容也作為本申請的參考。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其優(yōu)勢在于：滴眼液中融合蛋白的含量極低、且療效確切，在低濃度滴眼液較高的穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上能夠大幅度節(jié)約生產(chǎn)成本。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例僅作為對本發(fā)明的進(jìn)一步解釋，不能作為是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1、康柏西普滴眼液對堿燒傷致角膜新生血管研究藥品：鹽酸金霉素眼膏，規(guī)格批號：2.0g/支，411002，有效期至2014.12，重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司；鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格批號：5ml/支，0.1g/支，有效期至2012.04.，天津藥物焦作有限公司。試劑：氫氧化鈉(naoh)，規(guī)格批號：500g/瓶，20091223，成都市科龍化工試劑廠。受試樣品：a，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)10mg/ml，無色透明液體，1ml/支，批號：fr1108001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；b，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)9mg/ml，無色透明液體，1ml/支，批號：fr1108002，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；c，地塞米松，無色透明液體，1ml/支，批號：fr1108003，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；d，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.1mg/ml，無色透明液體，1ml/支，批號：fr1108004，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；e，不含康柏西普制劑緩沖液(buffer)(按照實(shí)施例16制備)，無色透明液體，1ml/支，批號：fr1108005，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；f，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)5mg/ml，無色透明液體，1ml/支，批號：fr1108006，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；均由康弘藥業(yè)集團(tuán)企業(yè)技術(shù)中心中化藥研究部制劑室提供。實(shí)驗方法及結(jié)果：取健康無眼疾病新西蘭兔48只，稱其體重，用3％戊巴比妥鈉麻醉(1ml/kg)，并于眼睛表面施予局麻藥鹽酸利多卡因液，劑量為20μl/眼；制備9mm直徑濾紙片，浸泡于1mol/lnaoh溶液中約10s，用鑷子將濾紙片放置于干燥的濾紙上吸去多余的naoh溶液，將浸有naoh的濾紙片置于家兔雙眼眼角膜正中60s后取下，迅速取洗瓶用約20ml生理鹽水沖洗角膜，并給予預(yù)防抗生素防止感染(鹽酸金霉素眼膏)，3次/2天。造模后隨即分為燒傷、a(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)10mg/ml)、b(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)9mg/ml)、c(地塞米松)、d(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.1mg/ml)、e(不含康柏西普的制劑緩沖溶液(按照實(shí)施例16制備))和f(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)5mg/ml)七個組，造模當(dāng)天為0天，從第1天開始，a～f組給予相應(yīng)藥物，給藥頻率6次/天，給藥劑量每次50μl/眼，連續(xù)給藥10天，另取2只新西蘭兔設(shè)為正常組。每天給藥同時，觀察眼角膜nv生長狀態(tài)及眼部是否有炎癥反應(yīng)。于給藥第10天，以3％戊巴比妥鈉溶液麻醉動物(1ml/kg)，并于眼睛表面施予局麻藥鹽酸利多卡因液，劑量為20μl/眼，在裂隙燈10倍物鏡下觀察兔眼角膜nv鐘點(diǎn)方向，同時在10倍和16倍物鏡下照相。采集圖像在photoshopcs進(jìn)行鐘點(diǎn)數(shù)校正，角膜新生面積采用imageproplus處理；面積公式：s＝c/12×3.1416×[r2-(r-l)2]，c表示在圖片中角膜邊緣從有nv到無nv生長時點(diǎn)所占的鐘點(diǎn)數(shù)，r表示在圖片中從角膜與鞏膜接觸的邊緣到角膜中心的長度，l表示在圖片中從角膜與鞏膜接觸邊緣nv的根部到角膜中nv的末端nv長度，每個鐘點(diǎn)中取最長的一根血管長度。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用t檢驗方差分?jǐn)?shù)據(jù)表示，是平均值，s是標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過一般眼表觀察發(fā)現(xiàn)，燒傷第1,2天各組燒傷眼角膜邊緣血管網(wǎng)充血明顯；燒傷第3天，角膜邊緣有nv生長；第5天康柏西普滴眼液5mg/ml和不含康柏西普的制劑緩沖溶液眼角膜表面nv生長明顯，地塞米松、康柏西普滴眼液10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml和康柏西普滴眼液0.1mg/ml組nv生長不明顯；第7天各組眼角膜表面nv生長明顯，燒傷組和不含康柏西普的制劑緩沖溶液組角膜nv向燒傷角膜生長，部分nv已生長到燒傷角膜邊緣，而地塞米松、康柏西普滴眼液10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普滴眼液5mg/ml和康柏西普滴眼液0.1mg/ml組很少有nv生長到燒傷角膜邊緣；第10天時燒傷組和不含康柏西普的制劑緩沖溶液組已有nv長入燒傷角膜內(nèi)，而地塞米松、康柏西普10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普5mg/ml和康柏西普0.1mg/ml組nv長入燒傷角膜較少。角膜新生血管面積影響：第10天角膜nv面積數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，與堿燒傷組和不含康柏西普的制劑緩沖溶液組相比，地塞米松、康柏西普10mg/ml、康柏西普滴眼液9mg/ml、康柏西普5mg/ml和康柏西普0.1mg/ml能夠明顯抑制角膜nv生長，減少nv面積，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，其中地塞米松與康柏西普0.1mg/ml抑制nv生長最佳(p<0.01)。雖然不含康柏西普的制劑緩沖溶液無抑制角膜新生血管生長作用，且nv面積大于燒傷組，但無顯著性差異。結(jié)果如表1。表1各藥物對堿燒傷致兔眼角膜nv的影響注：陰性對照為不含藥物的緩沖液，陽性對照為地塞米松，與燒傷組比較，*p<0.05,**p<0.01；與b組比較，#p<0.05,##p<0.01；與e組比較，^p<0.05,^^p<0.01。實(shí)施例2低劑量康柏西普滴眼液對堿燒傷致角膜nv生長影響藥品：鹽酸金霉素眼膏，規(guī)格批號：2.0g/支，411002，有效期至2014.12，重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司；鹽酸利多卡因注射液，規(guī)格批號：5ml/支，0.1g/支，有效期至2012.04.，天津藥物焦作有限公司。試劑：氫氧化鈉(naoh)，規(guī)格批號：500g/瓶，20091223，成都市科龍化工試劑廠。受試樣品：a，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.5mg/ml，無色透明液體，800μl/支，批號：20111001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；b，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.1mg/ml，無色透明液體，800μl/支，批號：20111001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；c，不含康柏西普的制劑緩沖溶液，無色透明液體，800μl/支，批號：20111001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；d，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.01mg/ml，無色透明液體，800μl/支，批號：20111001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；e，地塞米松，無色透明液體，800μl/支，批號：20111001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；f，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.05mg/ml，無色透明液體，800μl/支，批號：20111001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；g，康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)1mg/ml，無色透明液體，800μl/支，批號：20111001，保存于2～8℃，使用時滴加入眼睛表面；均由康弘藥業(yè)集團(tuán)企業(yè)技術(shù)中心中化藥研究部制劑室提供。實(shí)驗方法及結(jié)果：試驗分為a(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.5mg/ml)、b(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.1mg/ml)、c(不含康柏西普的制劑緩沖液(按照實(shí)施例16制備)buffer)、d(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.01mg/ml)、e(地塞米松)、f(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)0.05mg/ml)和g(康柏西普滴眼液(按照實(shí)施例3制備)1mg/ml)八個組。試驗方法操作同實(shí)施例1。通過眼表觀察發(fā)現(xiàn)，燒傷第1,2天各組燒傷眼角膜邊緣血管網(wǎng)充血明顯，部分眼瞼紅腫現(xiàn)象；燒傷第3天，角膜邊緣有nv生長趨勢，眼瞼紅腫消退；第5天，各組角膜表面有nv生長，但是有部分兔眼瞼又出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象；第7天各組眼角膜表面nv生長明顯，有明顯地向心性生長，而地塞米松組角膜nv較少，但兔眼瞼紅腫現(xiàn)象更加嚴(yán)重；第10天，含有康柏西普的各組角膜nv生長明顯，部分角膜新生血管已長入燒傷部位，而地塞米松組nv長入角膜燒傷部位較少，兔眼瞼紅腫現(xiàn)象未見恢復(fù)，而含有康柏西普的各組未有兔眼瞼紅腫現(xiàn)象。角膜新生血管面積影響：第10天角膜nv面積數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，與不含康柏西普的制劑緩沖溶液組相比，地塞米松、康柏西普滴眼液0.5mg/ml能夠明顯抑制角膜nv生長，減少nv面積，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)?？蛋匚髌盏窝垡?mg/ml、康柏西普滴眼液0.1mg/ml也能抑制角膜nv生長。而康柏西普滴眼液0.01mg/ml無抑制角膜新生血管生長作用，且nv面積大于燒傷組，但無顯著性差異。見表2。表2各藥物對堿燒傷致兔眼角膜nv的影響注：buffer對照，*p<0.05,**p<0.01。實(shí)施例3、康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：fp3融合蛋白10mg/ml、9mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有55mm檸檬酸、12.5％蔗糖、250mm精氨酸和0.05％吐溫20的緩沖液、濾過、分別調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至10mg/ml、9mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml，ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例4、康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：fp3融合蛋白0.5mg/ml制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有10mm檸檬酸、8.0％蔗糖、5mm精氨酸和0.05％吐溫20的緩沖液，濾過、調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至0.5mg/ml,ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例5康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有100mm檸檬酸、20.0％蔗糖、250mm精氨酸和0.10％吐溫20的緩沖液，濾過，調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至1.0mg/ml,ph為7.5～8.3無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例6康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有5mm磷酸二氫鈉、10.0％海藻糖、100mm精氨酸和0.01％peg400的緩沖液，濾過，調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至0.1mg/ml,ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例7康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有5mm檸檬酸、4.0％蔗糖、4.0％氯化鈉、100mm精氨酸、100mm組氨酸、0.05％吐溫20、0.05％peg400的緩沖液，濾過，調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至0.05mg/ml、ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例8康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有10mm檸檬酸、30.0％蔗糖、500mm精氨酸、0.1％吐溫20的緩沖液，濾過，調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至5.0mg/ml、ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例9康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有10mm檸檬酸、5.0％蔗糖、100mm精氨酸、0.05％吐溫20的緩沖液、濾過，調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至0.5mg/ml、ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例10康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有250mm檸檬酸、8.0％蔗糖、100mm組氨酸、0.10％吐溫20的緩沖液、濾過，調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至0.5mg/ml、ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例13康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp3融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有10mm檸檬酸、5.0％蔗糖、100mm精氨酸、0.05％吐溫20的緩沖液、濾過，調(diào)節(jié)fp3融合蛋白至0.5mg/ml、ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例14系列融合蛋白滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的各種融合蛋白(fp1、fp2、fp4、fp5、fp6、fp7、fp8)原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有55mm檸檬酸、12.5％蔗糖、250mm精氨酸和0.05％吐溫20的緩沖液、過濾，分別調(diào)節(jié)融合蛋白至9mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml或0.05mg/ml，ph為6.0～8.3,無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例15fp1融合蛋白滴眼液的制備處方：制備方法：將濃縮換液后的fp1融合蛋白原液化凍后，在c級潔凈去潔凈臺(無菌柜)中，按無菌操作法加入過濾除菌的含有5mm磷酸、5mm檸檬酸、100mm氯化鈉和0.005％吐溫20的緩沖液、濾過，調(diào)節(jié)融合蛋白至1.0mg/ml，ph為6.0-8.0，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例16不含康柏西普(fp3融合蛋白)的制劑緩沖液制備處方：制備方法：將按無菌操作法加入過濾除菌的含有55mm檸檬酸、12.5％蔗糖、250mm精氨酸和0.05％吐溫20的緩沖液、濾過、分別調(diào)節(jié)ph為7.5～8.3，無菌分裝到盛裝滴眼液的容器中，存放于2-8℃。實(shí)施例170.1mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液在25℃的穩(wěn)定性1、按照實(shí)施例3制備0.1mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液2、將上述0.1mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液，25℃留樣，在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12月測定樣品，通過sec-hplc確定穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，該處方能有效抑制聚合物的生成，產(chǎn)品純度基本不下降，融合蛋白與vegf的親和力幾乎不變。具體結(jié)果見表3。表3.0.1mg/mlfp3融合蛋白在25℃的穩(wěn)定性時間(月)外觀ph值聚合物(％)親和力(pm)0合格7.20.0110.61合格7.40.0310.52合格7.50.0310.43合格7.50.0510.46合格7.70.0710.29合格7.60.0810.312合格7.50.0910.1實(shí)施例1810mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液在4℃的穩(wěn)定性1、按照實(shí)施例3制備10mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液2、將上述10mg/ml康柏西普(fp3融合蛋白)滴眼液，4℃留樣，在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12月測定樣品，通過sec-hplc確定穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，該處方能有效抑制聚合物的生成，產(chǎn)品中聚合物增加緩慢，融合蛋白與vegf的親和力幾乎不變。具體結(jié)果見表4。表4.10mg/mlfp3融合蛋白在4℃的穩(wěn)定性sequencelisting<110>成都康弘生物科技有限公司<120>一種含有vegf拮抗劑的滴眼液<130>zl200610066257.2<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>93<212>prt<213>flt-1d2<400>1prophevalglumettyrsergluileprogluileilehismetthr151015gluglyarggluleuvalileprocysargvalthrserproasnile202530thrvalthrleulyslyspheproleuaspthrleuileproaspgly354045lysargileiletrpaspserarglysglypheileileserasnala505560thrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglualathrvalasngly65707580hisleutyrlysthrasntyrleuthrhisargglnthr8590<210>2<211>96<212>prt<213>flt-1d4<400>2pheilethrvallyshisarglysglnglnvalleugluthrvalala151015glylysargsertyrargleusermetlysvallysalapheproser202530progluvalvaltrpleulysaspglyleuproalathrglulysser354045alaargtyrleuthrargglytyrserleuileilelysaspvalthr505560glugluaspalaglyasntyrthrileleuleuserilelysglnser65707580asnvalphelysasnleuthralathrleuilevalasnvallyspro859095<210>3<211>86<212>prt<213>kdrd1<400>3proargleuserileglnlysaspileleuthrilelysalaasnthr151015thrleuglnilethrcysargglyglnargaspleuasptrpleutrp202530proasnasnglnserglysergluglnargvalgluvalthrglucys354045seraspglyleuphecyslysthrleuthrileprolysvalilegly505560asnaspthrglyalatyrlyscysphetyrarggluthraspleuala65707580servaliletyrvaltyr85<210>4<211>102<212>prt<213>kdrd3<400>4valvalleuserproserhisglyileileglugluleuservalgly151015glulysleuvalleuasncysthralaargthrgluleuasnvalgly202530ileasppheasntrpglutyrproserserlyshisglnhislyslys354045leuvalasnargaspleulysthrglnserglyserglumetlyslys505560pheleuserthrleuthrileaspglyvalthrargseraspglngly65707580leutyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlyslysasnser859095thrphevalargvalhis100<210>5<211>92<212>prt<213>kdrd4<400>5phevalalapheglyserglymetgluserleuvalglualathrval151015glygluargvalargileproalalystyrleuglytyrpropropro202530gluilelystrptyrlysasnglyileproleugluserasnhisthr354045ilelysalaglyhisvalleuthrilemetgluvalsergluargasp505560thrglyasntyrthrvalileleuthrasnproileserlysglulys65707580glnserhisvalvalserleuvalvaltyrvalpro8590<210>6<211>552<212>prt<213>人工序列<400>6metvalsertyrtrpaspthrglyvalleuleucysalaleuleuser151015cysleuleuleuthrglyserserserglyglyargprophevalglu202530mettyrsergluileprogluileilehismetthrgluglyargglu354045leuvalileprocysargvalthrserproasnilethrvalthrleu505560lyslyspheproleuaspthrleuileproaspglylysargileile65707580trpaspserarglysglypheileileserasnalathrtyrlysglu859095ileglyleuleuthrcysglualathrvalasnglyhisleutyrlys100105110thrasntyrleuthrhisargglnthrasnthrileileaspvalval115120125leuserproserhisglyilegluleuservalglyglulysleuval130135140leuasncysthralaargthrgluleuasnvalglyileasppheasn145150155160trpglutyrproserserlyshisglnhislyslysleuvalasnarg165170175aspleulysthrglnserglyserglumetlyslyspheleuserthr180185190leuthrileaspglyvalthrargseraspglnglyleutyrthrcys195200205alaalaserserglyleumetthrlyslysasnserthrphevalarg210215220valhisglulysprophevalalapheglyserglymetgluserleu225230235240valglualathrvalglygluargvalargleuproalalystyrleu245250255glytyrproproprogluilelystrptyrlysasnglyileproleu260265270gluserasnhisthrilelysalaglyhisvalleuthrilemetglu275280285valsergluargaspthrglyasntyrthrvalileleuthrasnpro290295300ileserlysglulysglnserhisvalvalserleuvalvaltyrval305310315320proproglyproglyasplysthrhisthrcysproleucysproala325330335progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro340345350lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval355360365valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval370375380aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln385390395400tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln405410415asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala420425430leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro435440445arggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthr450455460lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser465470475480aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr485490495lysalathrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr500505510serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe515520525sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys530535540serleuserleuserproglylys545550<210>7<211>455<212>prt<213>人工序列<400>7metvalsertyrtrpaspthrglyvalleuleucysalaleuleuser151015cysleuleuleuthrglyserserserglyglyargprophevalglu202530mettyrsergluileprogluileilehismetthrgluglyargglu354045leuvalileprocysargvalthrserproasnilethrvalthrleu505560lyslyspheproleuaspthrleuileproaspglylysargileile65707580trpaspserarglysglypheileileserasnalathrtyrlysglu859095ileglyleuleuthrcysglualathrvalasnglyhisleutyrlys100105110thrasntyrleuthrhisargglnthrasnthrileileaspvalval115120125leuserproserhisglyilegluleuservalglyglulysleuval130135140leuasncysthralaargthrgluleuasnvalglyileasppheasn145150155160trpglutyrproserserlyshisglnhislyslysleuvalasnarg165170175aspleulysthrglnserglyserglumetlyslyspheleuserthr180185190leuthrileaspglyvalthrargseraspglnglyleutyrthrcys195200205alaalaserserglyleumetthrlyslysasnserthrphevalarg210215220valhisglulysasplysthrhisthrcysproleucysproalapro225230235240gluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys245250255aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval260265270aspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalasp275280285glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyr290295300asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp305310315320trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleu325330335proalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg340345350gluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlys355360365asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp370375380ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys385390395400alathrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser405410415lysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalpheser420425430cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser435440445leuserleuserproglylys450455<210>8<211>308<212>prt<213>人工序列<400>8glyargprophevalglumettyrsergluileprogluileilehis151015metthrgluglyarggluleuvalileprocysargvalthrserpro202530asnilethrvalthrleulyslyspheproleuaspthrleuilepro354045aspglylysargileiletrpaspserarglysglypheileileser505560asnalathrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglualathrval65707580asnglyhisleutyrlysthrasntyrleuthrhisargglnthrasn859095thrileileaspvalvalleuserproserhisglyilegluleuser100105110valglyglulysleuvalleuasncysthralaargthrgluleuasn115120125valglyileasppheasntrpglutyrproserserlyshisglnhis130135140lyslysleuvalasnargaspleulysthrglnserglyserglumet145150155160lyslyspheleuserthrleuthrileaspglyvalthrargserasp165170175glnglyleutyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlyslys180185190asnserthrphevalargvalhisglulysprophevalalaphegly195200205serglymetgluserleuvalglualathrvalglygluargvalarg210215220ileproalalystyrleuglytyrproproprogluilelystrptyr225230235240lysasnglyileproleugluserasnhisthrilelysalaglyhis245250255valleuthrilemetgluvalsergluargaspthrglyasntyrthr260265270valileleuthrasnproileserlysglulysglnserhisvalval275280285serleuvalvaltyrvalproproasplysthrhisthrcysproleu290295300cysproalapro305<210>9<211>214<212>prt<213>人工序列<400>9glyargprophevalglumettyrsergluileprogluileilehis151015metthrgluglyarggluleuvalileprocysargvalthrserpro202530asnilethrvalthrleulyslyspheproleuaspthrleuilepro354045aspglylysargileiletrpaspserarglysglypheileileser505560asnalathrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglualathrval65707580asnglyhisleutyrlysthrasntyrleuthrhisargglnthrasn859095thrileileaspvalvalleuserproserhisglyilegluleuser100105110valglyglulysleuvalleuasncysthralaargthrgluleuasn115120125valglyileasppheasntrpglutyrproserserlyshisglnhis130135140lyslysleuvalasnargaspleulysthrglnserglyserglumet145150155160lyslyspheleuserthrleuthrileaspglyvalthrargserasp165170175glnglyleutyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlyslys180185190asnserthrphevalargvalhisglulysasplysthrhisthrcys195200205proleucysproalapro210當(dāng)前第1頁12