本發(fā)明涉及α-倒捻子素的新用途，尤其涉及α-倒捻子素在制備用于治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
約5％人口患有自身免疫疾病，大約70多種人類疾病都和自免疫失調(diào)有關(guān)(goodnowetal.,2005)。目前自身免疫疾病的治療主要依賴于一些非選擇性的免疫抑制劑，其療效有限且副作用大，臨床中還沒有非常特效的治療自身免疫疾病的藥物。因此，臨床上急需開發(fā)一種新型的高療效且低副作用的自免疫藥物。
最新研究表明一種新的t細胞亞群th17細胞和人類自身免疫疾病和相關(guān)動物模型的發(fā)生密切相關(guān)(kiklyetal.,2006)。在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特征性皮炎、炎癥性腸炎等自身免疫疾病中，th17細胞的特征細胞因子il17a表達上調(diào)，而抑制il17a表達和th17細胞分化可以減輕自身免疫疾病的發(fā)生或臨床嚴重程度(bowmanetal.,2006；kiklyetal.,2006)?，F(xiàn)有研究表明th17細胞的分化形成受到轉(zhuǎn)錄因子rorγt的控制，而在rorγt基因敲除的小鼠中，th17細胞的分化能力下降，數(shù)量減少，同時誘導(dǎo)發(fā)生的小鼠eae自身免疫疾病概率和臨床打分指標(biāo)均有顯著的降低(ivanovetal.,2006)。這意味著rorγt的功能抑制劑可以作為開發(fā)th17介導(dǎo)的自身免疫疾病治療藥物的定向靶標(biāo)。
rorγt是類固醇類核受體家族成員，蛋白分子中包括一個保守的dna結(jié)合域和有12個螺旋構(gòu)成的配體結(jié)合域，而配體結(jié)合域是結(jié)合配體、核定位和二聚體形成的重要區(qū)域。類固醇類受體共激活分子srcs能夠通過結(jié)合配體結(jié)構(gòu)域的af2區(qū)域來解聚轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，招募轉(zhuǎn)錄激活分子，啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄(glassandrosenfeld,2000)。目前，rorγt的天然配體還沒有找到，但最近兩個研究發(fā)現(xiàn)人工合成分子地高辛及其衍生物(huhetal.,20011；fujita-satoetal.,2011)和sr1001(soltetal.,2011)能夠特異性地結(jié)合到rorγt的配體結(jié)構(gòu)域，抑制rorγt的功能并降低th17細胞的分化能力，減弱小鼠自身免疫疾病eae的臨床癥狀。然而，地高辛及其衍生物具有很強的毒性(paulaetal.,2005)；sr1001分子盡管在體外能夠有效抑制th17細胞的分化，但在體內(nèi)實驗中高濃度給藥下(40mg/kg)，也只能略微減輕eae的臨床癥狀。此外，sr1001能夠同其他的rors作用，選擇性較差(soltetal.,2011)。這些研究一方面表明抑制rorγt的功能來治療自身免疫疾病是一個可行的方案，但目前還沒有找到一個理想的靶標(biāo)藥物。因此尋找高效低毒且具有較強特異性的rorγt功能抑制劑將是開發(fā)th17介導(dǎo)的自身免疫疾病藥物的一個重要方向。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供α-倒捻子素在制備用于治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：α-倒捻子素在制備用于治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用，所述α-倒捻子素的結(jié)構(gòu)式為：
作為上述技術(shù)方案的改進，所述自身免疫疾病為th17細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病。
作為上述技術(shù)方案的改進，所述自身免疫疾病包括牛皮癬、多發(fā)性硬發(fā)癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特征性皮炎、哮喘和炎癥性腸道病。
另外，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括α-倒捻子素和藥學(xué)上可接受的載體，所述α-倒捻子素的結(jié)構(gòu)式為：
在上述技術(shù)方案中，“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。藥學(xué)上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一個或多個以及它們的組合。在很多情況下，優(yōu)選的是將等滲劑例如糖、多元醇或氯化鈉包括在組合物中。藥學(xué)上可接受的載體還可包含少量的能提高抗體或抗體部分的貨架期或有效性的輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。
作為上述技術(shù)方案的改進，所述藥物組合物的劑型是注射液或凍干制劑。
在上述技術(shù)方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以為多種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液劑(例如可注射和可輸注溶液劑)、分散劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于預(yù)定的給藥方式和治療應(yīng)用。典型的優(yōu)選組合物為可注射或可輸注溶液劑形式。優(yōu)選的給藥方式是胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))給藥。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物通過腹膜注射給予。還可將輔助性活性化合物摻入到組合物中。
另外，本發(fā)明還提供所述藥物組合物在制備用于治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用。
作為上述技術(shù)方案的改進，所述自身免疫疾病為th17細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病。
作為上述技術(shù)方案的改進，所述自身免疫疾病包括牛皮癬、多發(fā)性硬發(fā)癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特征性皮炎、哮喘和炎癥性腸道病。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供α-倒捻子素在制備用于治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明利用基于轉(zhuǎn)錄因子活性的熒光素酶活性篩選系統(tǒng)，通過篩選獲得活性分子α-倒捻子素，α-倒捻子素具有抑制th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子rorγt的表達；體外th17細胞分化實驗驗證這些化合物具有抑制th17分化的功能，能夠抑制rorγt的靶基因il17a和il17f分子的轉(zhuǎn)錄表達；用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)的il17a表達也得到明顯抑制；證實α-倒捻子素具有明顯抑制th17細胞活性的功能；α-倒捻子素作為th17細胞活性的抑制劑，可以用于自身免疫疾病的治療中。
附圖說明
圖1為α-倒捻子素對rorγt表達的抑制率的曲線圖；圖中α-倒捻子素的簡寫為α-d，以下相同；
圖2為α-倒捻子素抑制th17細胞體外誘導(dǎo)分化過程中il17a的mrna轉(zhuǎn)錄的柱狀圖；
圖3顯示α-倒捻子素抑制il-17a蛋白表達。
具體實施方式
為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例、和附圖對本發(fā)明作進一步說明。
試劑來源
細胞系jurkat為本實驗室保存；dh5α細菌菌株由北京中科院遺傳所馬潤林教授饋贈；限制性內(nèi)切酶購自美國fermentas公司；dna連接酶購自美國neb公司；報告基因序列ires-gfp為發(fā)明人自有保存(也可以采用其他現(xiàn)有的報告基因序列)；報告質(zhì)粒pgl4.31[luc2p/gal4uas/hygro]和pbind質(zhì)粒購自美國promega公司；dmem培養(yǎng)基和rpmi1640培養(yǎng)基以及培養(yǎng)細胞用的丙酮酸鈉、谷氨酰胺、β巰基乙醇、非必須氨基酸、雙抗是購自美國life公司；胎牛血清(fbs)購自美國hyclone公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國promega公司；lipo2000購自美國life公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自sigma公司；8～12周齡的c57小鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心(spf級)；t細胞電轉(zhuǎn)試劑盒和電穿孔儀購自瑞士lonza公司；潮霉素b購自瑞士roche公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連takara公司；realtime檢測試劑盒購自美國promega公司；細胞因子htgf-β和mil-6購自美國rd公司；小鼠cd3、cd4、il17a和cd28抗體購自美國ebioscience公司；其他常用化學(xué)試劑購自sigma公司和上海生工公司；本發(fā)明所采用的α-倒捻子素可購買，也可以自行制備。
α-倒捻子素的制備方法
山竹果皮100g，粉碎，5倍量95％乙醇回流提取3次，每次1小時；合并提取液，減壓濃縮得浸膏9.6g,將此浸膏懸浮于100ml水中，依次以等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取萃取，每種溶劑萃取3次；合并氯仿萃取部分，濃縮后得浸膏3.2g，經(jīng)硅膠柱層析(200～300目)，乙酸乙酯/石油醚洗脫，得黃色固體160mg。
質(zhì)粒構(gòu)建
將熒光蛋白基因ires-gfp目的片段通過not1單酶切位點插入到pbind載體中完成pbind-ires-gfp的質(zhì)粒構(gòu)建；用pcr法從pbmc(外周血單個核細胞)的cdna中調(diào)取人的rorγt基因(hrorγt)，hrorγt調(diào)取時兩端加上bamh1的單酶切位點；再將hrorγt基因克隆到pbind-ires-gfp質(zhì)粒中，完成pbind-gal4dbd-hrorγt-ires-gfp重組質(zhì)粒的構(gòu)建(gal4dbd的序列是pbind質(zhì)粒自帶的)。
細胞培養(yǎng)
jurkat細胞培養(yǎng)在含10％fbs(胎牛血清)，1％雙抗，2mm谷氨酰胺，1mm丙酮酸鈉，50μm的β巰基乙醇的rpmi1640完全培養(yǎng)基中。細胞置于5％co2，37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，約每兩天傳代一次。
pgl4.31+hrorγt+jurkat穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建
將20μg經(jīng)not1單酶切的質(zhì)粒pgl4.31[luc2p/gal4uas/hygro]電轉(zhuǎn)入jurkat細胞(1×107)中，再用200μg/ml的潮霉素b進行抗性篩選；篩選進行2～3周后，再將20μg用限制性內(nèi)切酶eam1105酶切的pbind-gal4dbd-hrorγt-ires-gfp重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至經(jīng)潮霉素b篩選后的jurkat細胞中，再次轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)2～3周，之后用gfp熒光蛋白標(biāo)記進行流式分選，并收集gfp+陽性jurkat細胞。
ec50的測定
ec50的測定基于構(gòu)建的gal4/hrorγt的報告體系：將pgl4.31+hrorγt+jurkat細胞鋪板至96孔圓底板中，每孔2×104個細胞，5％co2，37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)過夜，然后按濃度梯度設(shè)置不同濃度值，在不同濃度的α-倒捻子素下作用6h，之后收集細胞，進行l(wèi)uciferase活性檢測以得到α-倒捻子素的ec50的值；結(jié)果如圖1所示。
如圖1所示，α-倒捻子素具有抑制th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子rorγt的表達，根據(jù)計算公式測得α-倒捻子素抑制rorγt轉(zhuǎn)錄因子表達的ec50為0.5312μm。
α-倒捻子素對th17細胞的體外分化的影響
實驗前一天晚上用含有5μg/mlcd3抗體、1μg/mlcd28抗體的pbs溶液包被六孔板，每孔1ml，4℃包被過夜。第二天開展實驗，首先用miltenyi磁珠分選小鼠脾臟的cd4+t細胞，分選后的細胞按1×106個/ml的細胞密度重懸細胞，向包被后的六孔板的每個孔加2ml的細胞懸液，即每孔細胞數(shù)為2×106個，激活24h。24h后，收集六孔板中的細胞至50ml離心管中，再向溶液中加入終濃度為5ng/ml的htgf-β和30ng/ml的mil-6的細胞因子，混勻，體外誘導(dǎo)cd4+t細胞向th17細胞分化?；靹蚝蟮募毎麘乙?，按每孔100μl分配至96孔板中，再向每孔加1μl的終濃度為1μmα-倒捻子素(并設(shè)置3個孔的dmso對照組)，37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)48h。48h后，每孔補加100μlrpmi1640完全培養(yǎng)基以及終濃度為5ng/ml的htgf-β、30ng/ml的mil-6的細胞因子和1μl的終濃度為5μmα-倒捻子素，補加完成后再培養(yǎng)48h。至此，cd4+t細胞體外誘導(dǎo)th17分化培養(yǎng)了約5天，5天后收集細胞，用于抽提rna和細胞染色后的流式細胞儀檢測。
1)cdna的合成及熒光定量pcr的檢測
trizol法提取細胞的總rna，并按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明反轉(zhuǎn)總rna合成cdna。然后用合成的cdna按promega公司的使用說明進行il17a、il17f基因的熒光定量pcr檢測(以gapdh基因為內(nèi)參)，結(jié)果如圖2所示。
如圖2所示，體外th17細胞分化實驗驗證α-倒捻子素能夠抑制rorγt的靶基因il17a分子的轉(zhuǎn)錄表達。
2)流式細胞儀檢測
用il17a和cd4的抗體進行細胞內(nèi)染色，elisa試劑盒檢測凍存的細胞上清中il17a的含量。實驗操作嚴格按照ebioscience細胞內(nèi)染色試劑盒和流式細胞儀操作說明進行，結(jié)果如圖3所示。
如圖3所示，細胞內(nèi)的il17a表達受到α-倒捻子素明顯的抑制。
最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
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