本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌是中國(guó)死亡率最高的癌癥，肺癌患者的5年生存率只有8％-10％。近年來在肺癌的診斷和治療上具有許多新的發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)早期肺癌采用外科治療、化療和放療的手段能夠得到良好的效果。但是這些方法對(duì)于已經(jīng)廣泛轉(zhuǎn)移的iv期肺癌患者并不十分適用，肺癌的播散轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌死亡率居高不下的重要因素。因此，對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制和轉(zhuǎn)移過程的研究是目前肺癌治療研發(fā)平臺(tái)的迫切需求。

肺癌的轉(zhuǎn)移方式主要有以下三種：直接擴(kuò)散、淋巴道轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。其中血行轉(zhuǎn)移是轉(zhuǎn)移程度最大的一種，癌細(xì)胞可隨肺靜脈回流到左心后，可轉(zhuǎn)移到體內(nèi)任何部位，常見轉(zhuǎn)移部位為肝、腦、肺、骨骼系統(tǒng)、腎上腺、胰等器官。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs，circulatingtumorcells)是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落，大部分ctc在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。目前，血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞是研究癌癥轉(zhuǎn)移的主要方向。由于ctcs數(shù)目稀少，取材困難，目前對(duì)ctcs的應(yīng)用主要在體外活檢。

此外，現(xiàn)有技術(shù)中，cn103320387a公開了一種建立小鼠可移植乳腺癌實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型的方法，將小鼠自發(fā)乳腺癌瘤塊在網(wǎng)篩中研磨，離心沉淀，用培養(yǎng)液調(diào)配細(xì)胞濃度(1-2)×10⁷cell/ml的腫瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞懸液0.1-0.3ml，常規(guī)條件下飼養(yǎng)，正常繁殖25-35天，完成肺部轉(zhuǎn)移模型。cn105696087a公開了pdx人源腫瘤異種移植模型，是將患者的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的微環(huán)境進(jìn)行生長(zhǎng)，腫瘤的分化程度、形態(tài)特征、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及分子特性等與人本身的腫瘤特點(diǎn)更接近?，F(xiàn)有技術(shù)中還有將ctcs移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建成異種移植模型，上述技術(shù)都是直接將相關(guān)的腫瘤細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，其樣本受限于每個(gè)病人的個(gè)體差異，導(dǎo)致樣本的不同，具有不可重復(fù)的特性，不利于后續(xù)的研究，不能廣泛的推廣應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)人體上皮細(xì)胞來源的腫瘤ctc細(xì)胞的定義并不明確，從人體中通過抗體標(biāo)記、識(shí)別和分選人體腫瘤ctc細(xì)胞常規(guī)使用人表皮細(xì)胞表面標(biāo)記物，hepcam(epithelialcelladhesionmolecule)/hcks(cytokeratins)+hcd45-即認(rèn)定為ctc細(xì)胞。然而，通過該方法分析的ctc細(xì)胞并不準(zhǔn)確，原因如下：1)因?yàn)椴糠值哪[瘤ctc細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中，表皮的表面標(biāo)記物會(huì)丟失，所以通過以上方法分析的腫瘤ctc細(xì)胞并不完全覆蓋所有的腫瘤ctc細(xì)胞，如丟失表皮表面標(biāo)記物的腫瘤ctc細(xì)胞；2)此外，通過以上方法標(biāo)記的細(xì)胞也可能是脫落到血液中的正常細(xì)胞，所以該檢測(cè)、分選方法是存在缺陷的。而現(xiàn)有技術(shù)中，從人腫瘤小鼠模型中標(biāo)記、識(shí)別和分選人體腫瘤ctc細(xì)胞的方法也同樣存在上述問題。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中人體腫瘤ctc細(xì)胞分析不準(zhǔn)確和分選不純的問題，建立一種具有穩(wěn)定的重復(fù)性的小鼠模型用于對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制和轉(zhuǎn)移過程，獲得高純度的人體腫瘤ctc細(xì)胞的研究是一個(gè)亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足及實(shí)際的需求，本發(fā)明提高一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，所述模型可用于癌癥ctcs體內(nèi)轉(zhuǎn)移機(jī)制和轉(zhuǎn)移過程的研究，通過流式細(xì)胞等技術(shù)分析、分離獲得高純度的人體腫瘤ctc細(xì)胞。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)皮下移植：將原代腫瘤組織樣本移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建原代癌癥異種移植模型pdx(patientderivedxenografts)；

(2)采集循環(huán)腫瘤細(xì)胞：采集步驟(1)所述的原代癌癥異種移植模型的外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

(3)腎囊膜移植：將步驟(2)采集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠的腎囊膜內(nèi)，即構(gòu)建成功所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型。

本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)在所述模型小鼠外周血hla陽(yáng)性細(xì)胞中存在hhla+mcd45+雙陽(yáng)性細(xì)胞群，該細(xì)胞群可能并非人體腫瘤ctc細(xì)胞，該雙陽(yáng)性細(xì)胞群的存在，將導(dǎo)致通過hepcam/hcks+hcd45-標(biāo)記分選的腫瘤ctc細(xì)胞不純，含有非人腫瘤ctc細(xì)胞的hhla+mcd45+雜質(zhì)細(xì)胞，而通過本發(fā)明所述方法構(gòu)建的循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型，其通過二次移植ctcs細(xì)胞，建立ctcs來源的肺癌小鼠模型，采用本方法可有效地得到大量ctcs來源的肺癌小鼠模型，且模型來源于同一病人樣本，生物學(xué)背景一致，能篩選到純度很高的腫瘤ctc細(xì)胞。

本發(fā)明中，所述原代腫瘤組織樣本來源于三甲醫(yī)院的腫瘤組織樣本庫(kù)，所述腫瘤組織樣本需浸泡于rmpi-1640培養(yǎng)基中并保存于冰上運(yùn)輸，所述原代腫瘤組織樣本優(yōu)先選擇肉色部分腫瘤組織樣本，其次選擇白色部分腫瘤組織樣本。

本發(fā)明中，所述方法還包括對(duì)腫瘤組織樣本的前處理，采用濃度為0.5-3％，優(yōu)選為1％的pbs進(jìn)行清洗1-5次，優(yōu)選為2-3次，并將樣本分成三個(gè)部分；

所述第一部分用于凍存保種；

所述第二部分用于腫瘤組織切片和免疫組化分析；

所述第三部分用于腫瘤移植備用。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)所述的腫瘤為實(shí)體瘤，優(yōu)選為上皮細(xì)胞來源的實(shí)體瘤，進(jìn)一步優(yōu)選為為肺癌、肝癌、胃癌、直腸癌或乳腺癌中的任意一種或至少兩種的組合，最優(yōu)選為肺癌。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)所述的腫瘤組織樣本移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)需要進(jìn)行修剪，所述修剪的形狀和大小只要能夠?qū)⒛[瘤組織樣本成功移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)都是可行的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要自行選擇，本發(fā)明將所述的腫瘤組織樣本剪成體積為10-30mm³，例如可以是10mm³、12mm³、15mm³、18mm³、20mm³、22mm³、25mm³、28mm³或30mm³，優(yōu)選為15mm³的腫瘤組織小塊，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)所述的腫瘤組織樣本修剪后采用matrixgel(基質(zhì)膠)包裹備用。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)所述免疫缺陷小鼠為c57bl/6-nu、nod、cb17-scid、nod-scid、c57bl/6-rag1–/–、balb/c-rag2–/–、c57bl/6-il2rg–/–、nsg、nog或nsi中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為nsi。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述采集步驟(1)所述的原代癌癥異種移植模型的外周血中的ctcs具體包括：處死步驟(1)所述pdx小鼠模型，采集全部外周血，離心收集全部血細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液，離心收集白細(xì)胞即得所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述處死的pdx小鼠模型為步驟(1)將腫瘤組織樣本移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后20-80天，例如可以是20天、21天、23天、25天、26天、28天、30天、31天、32天、33天、35天、36天、38天、40天、42天、45天、46天、48天、50天、52天、53天、55天、56天、58天、60天、62天、63天、65天、66天、68天、70天、72天、73天、75天、76天、78天或80天，優(yōu)選為30-60天，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

根據(jù)本發(fā)明，所述處死步驟(1)所述pdx小鼠模型只要能夠處死pdx小鼠模型的方式都可行，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)條件自行選擇，本申請(qǐng)采用co2處死小鼠模型。

本發(fā)明中，將pdx小鼠模型處死后，取pdx小鼠模型的腫瘤組織，對(duì)腫瘤組織樣本的前處理，剪取腫瘤脂質(zhì)外層肉色部分，采用濃度為0.5-3％，優(yōu)選為1％的pbs進(jìn)行清洗1-5次，優(yōu)選為2-3次，并將樣本分成三個(gè)部分；

所述第一部分用于凍存保種；

所述第二部分用于腫瘤組織切片和免疫組化分析；

所述第三部分用于腫瘤移植備用。

根據(jù)本發(fā)明，所述離心的離心力為100-400g，例如可以是100g、120g、130g、150g、160g、180g、200g、220g、230g、250g、260g、280g、300g、310g、320g、330g、350g、360g、380g或400g，優(yōu)選為200-350g，進(jìn)一步優(yōu)選為300g，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述ctcs可以采用pbs進(jìn)行調(diào)節(jié)濃度，本申請(qǐng)中的采用的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濃度為40-300ctcs/μl，例如可以是40ctcs/μl、42ctcs/μl、45ctcs/μl、48ctcs/μl、50ctcs/μl、55ctcs/μl、60ctcs/μl、65ctcs/μl、70ctcs/μl、75ctcs/μl、80ctcs/μl、85ctcs/μl、90ctcs/μl、95ctcs/μl、100ctcs/μl、105ctcs/μl、110ctcs/μl、115ctcs/μl、120ctcs/μl、125ctcs/μl、130ctcs/μl、135ctcs/μl、140ctcs/μl、145ctcs/μl、150ctcs/μl、160ctcs/μl、170ctcs/μl、180ctcs/μl、190ctcs/μl、200ctcs/μl、210ctcs/μl、220ctcs/μl、230ctcs/μl、240ctcs/μl、250ctcs/μl、260ctcs/μl、270ctcs/μl、280ctcs/μl、290ctcs/μl或300ctcs/μl，優(yōu)選為40ctcs/μl，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的移植體積為5-20μl，例如可以是5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl或20μl，優(yōu)選為10μl，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述的免疫缺陷小鼠為c57bl/6-nu、nod、cb17-scid、nod-scid、c57bl/6-rag1–/–、balb/c-rag2–/–、c57bl/6-il2rg–/–、nsg、nog或nsi中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為nsi。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述移植到腎囊膜內(nèi)為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在此不做特殊限定，本申請(qǐng)采用如下具體方式移植：將免疫缺陷小鼠麻醉，選取小鼠一側(cè)腎臟，用青霉素-生理鹽水濕潤(rùn)腎包囊，用胰島素針吸取細(xì)胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)前處理：將肺癌組織樣本采用濃度為0.5-3％的pbs進(jìn)行清洗1-5次；

(2)皮下移植：將前處理后的肺癌組織樣本剪成體積為10-30mm³的小塊，采用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建原代癌癥異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)采集循環(huán)腫瘤細(xì)胞：當(dāng)步驟(2)所述pdx小鼠模型培養(yǎng)20-80天后，用co2處死，采集全部外周血，100-400g離心收集全部血細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液，100-400g離心收集白細(xì)胞即得所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)采集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞采用pbs進(jìn)行調(diào)節(jié)濃度，調(diào)節(jié)到濃度為30-50ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側(cè)腎臟，用青霉素-生理鹽水濕潤(rùn)腎包囊，用胰島素針吸取5-20μl細(xì)胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒，即構(gòu)建成功所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型。

第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的構(gòu)建方法制備得到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型。

第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型用于制備人體的病理和生理的研究的模型鼠，優(yōu)選作為腫瘤疾病研究的模型鼠。

本發(fā)明中，通過將構(gòu)建小鼠模型培養(yǎng)60-90天后，采用co2處死小鼠，取小鼠外周血、肺臟、肝臟、脾臟和腫瘤組織，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其中的腫瘤細(xì)胞的比例和遷移，用于研究ctcs的擴(kuò)散情況。

第四方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型的人循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法，包括如下步驟：將人實(shí)體瘤細(xì)胞特異表面標(biāo)記物和所述小鼠模型外周血細(xì)胞特異表面標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，通過分析技術(shù)分析小鼠模型外周血白細(xì)胞中人循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

所述人循環(huán)腫瘤細(xì)胞為人實(shí)體瘤細(xì)胞特異表面標(biāo)記物陽(yáng)性，且所述小鼠模型外周血細(xì)胞特異表面標(biāo)記物陰性的細(xì)胞群。

本發(fā)明中，所述人實(shí)體瘤細(xì)胞特異表面標(biāo)記物陽(yáng)性為所述人實(shí)體瘤細(xì)胞特異表面標(biāo)記物進(jìn)行了相關(guān)的表達(dá)，所述小鼠模型外周血細(xì)胞特異表面標(biāo)記物陰性為所述小鼠模型外周血細(xì)胞特異表面標(biāo)記物沒有進(jìn)行相關(guān)表達(dá)，同時(shí)滿足這兩個(gè)條件的細(xì)胞群才能確定為所述人循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，所述人實(shí)體瘤細(xì)胞特異表面標(biāo)記物為hla(humanleukocyteantigen，人類白細(xì)胞抗原)、epcam(epithelialcelladhesionmolecule，上皮細(xì)胞粘附分子)、cks(cytokeratins，細(xì)胞角蛋白家族)或cd44(clusterofdifferentiation，分化抗原44)中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為hla。

根據(jù)本發(fā)明，所述小鼠模型外周血細(xì)胞特異表面標(biāo)記物為cd45(leukocytecommonantigen，白細(xì)胞共同抗原)和/或mhci(majorhistocompatibilitycomplexclassimolecule，主要組織相容性復(fù)合體i類分子)，優(yōu)選為cd45。

根據(jù)本發(fā)明，所述分析技術(shù)選自但不限于流式細(xì)胞技術(shù)和/或免疫組化技術(shù)。

第五方面，本發(fā)明提供一種制備人循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟：采用分選技術(shù)分離如第二方面所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型中的人循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

所述人循環(huán)腫瘤細(xì)胞為所述小鼠模型中外周血白細(xì)胞中人實(shí)體瘤細(xì)胞特異表面標(biāo)記物陽(yáng)性，且所述小鼠模型外周血細(xì)胞特異表面標(biāo)記物陰性的細(xì)胞群；

根據(jù)本發(fā)明，所述人實(shí)體瘤細(xì)胞特異表面標(biāo)記物為hla、epcam、cks或cd44中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為hla。

根據(jù)本發(fā)明，所述小鼠模型外周血細(xì)胞特異表面標(biāo)記物為cd45和/或mhci，優(yōu)選為cd45。

優(yōu)選地，所述分選技術(shù)選自但不限于流式細(xì)胞和/或磁珠分選技術(shù)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明方法采用二次移植的方式，將原代腫瘤異種移植模型中的ctcs通過腎囊膜移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可用于研究ctcs體內(nèi)轉(zhuǎn)移的機(jī)制及擴(kuò)散情況以及針對(duì)ctcs的藥效實(shí)驗(yàn)；

(2)采用本發(fā)明所訴的方式，能夠有效地得到大量ctcs來源的肺癌腫瘤模型，且模型來源于同一病人樣本，生物學(xué)背景一致，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

附圖說明

圖1是本發(fā)明通過免疫組化對(duì)比肺癌病人原代腫瘤組織和pdx模型腫瘤組織，其中，圖1(a)為通過免疫組化對(duì)比肺癌病人原代腫瘤組織和pdx模型腫瘤組織的結(jié)果圖，圖1(b)為通過免疫組化分析原代肺癌在pdx小鼠中的轉(zhuǎn)移情況的結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明通過流式細(xì)胞術(shù)分析原代肺癌在pdx小鼠中的轉(zhuǎn)移情況的結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明通過流式細(xì)胞術(shù)分析ctc模型小鼠中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

本發(fā)明所有動(dòng)物飼養(yǎng)、繁殖于spf(specificpathogenfree)級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

本發(fā)明所有原代腫瘤組織樣本來源于三甲醫(yī)院的腫瘤組織樣本庫(kù)。

實(shí)施例1：肺癌pdx模型的構(gòu)建

1)原代肺癌樣本處理：原代肺癌腫瘤組織樣本來源于三甲醫(yī)院的腫瘤組織樣本庫(kù)，肺癌樣本需浸泡于rmpi-1640培養(yǎng)基并保存于冰上運(yùn)輸。獲取腫瘤樣本后，使用pbs(1％p/s)清洗2-3次將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進(jìn)行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用于腫瘤移植備用。

2)肺癌組織移植與檢測(cè)：可通過肝癌樣本大小選擇合適的腫瘤組織移植方式。移植方式如下：

(1)皮下移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成15mm³的腫瘤組織小塊，將肺癌腫瘤組織小塊用matrixgel包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側(cè)剪開小口，用鑷子將matrixgel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；

(2)腎囊膜移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm³的腫瘤組織小塊備用；將小鼠麻醉，選取小鼠一側(cè)腎臟，在腎包囊上開小口(開口大小與移植管口相當(dāng))，用青霉素-生理鹽水濕潤(rùn)腎包囊，以移植管吸取帶一只的聚合卵巢并移植入受體小鼠腎囊膜下(遠(yuǎn)離手術(shù)開口)，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒。

實(shí)施例2：肺癌pdx模型的多次傳代

肺癌pdx小鼠模型傳代：將實(shí)施例1的肺癌pdx小鼠通過co2處死后，取小鼠腫瘤組織，剪取腫瘤組織外層肉色部分，使用pbs(1％p/s)清洗2-3次，將樣本分成三份，一份凍存保種；一份進(jìn)行腫瘤組織切片和免疫組化分析；一份用于腫瘤移植；

(1)皮下移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成15mm³的腫瘤組織小塊，將肺癌腫瘤組織小塊用matrixgel包裹備用，用剪刀在小鼠下腹部一側(cè)剪開小口，用鑷子將matrixgel包裹的腫瘤組織塊夾入小口中，用傷口夾將小口縫合；

(2)腎囊膜移植：用剪刀將原代腫瘤組織樣本剪成體積為2mm³的腫瘤組織小塊備用；將小鼠麻醉，選取小鼠一側(cè)腎臟，在腎包囊上開小口(開口大小與移植管口相當(dāng))，用青霉素-生理鹽水濕潤(rùn)腎包囊，以移植管吸取帶一只的聚合卵巢并移植入受體小鼠腎囊膜下(遠(yuǎn)離手術(shù)開口)，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒。

所述傳代可以傳代3-5次。

實(shí)施例3：肺癌pdx模型的檢測(cè)

腫瘤移植30-60天內(nèi)，co2處死實(shí)施例1和實(shí)施例2的pdx模型，取小鼠外周血、肺臟、肝臟、脾臟和腫瘤組織，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其中的腫瘤細(xì)胞的比例(hhla+)和遷移(除腫瘤組織外的器官hhla+細(xì)胞比例)，結(jié)果如圖1-2所示。

結(jié)果分析：從圖1(a)免疫組化的結(jié)果顯示pdx小鼠體內(nèi)的腫瘤和病人腫瘤表達(dá)一致的腫瘤標(biāo)記物(甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(ttf1)、細(xì)胞角蛋白7(ck7)、天冬氨酸蛋白酶a(napsina)，表明在免疫缺陷小鼠體內(nèi)傳代后，腫瘤保留原有組織結(jié)構(gòu)特征。圖1(b)免疫組化結(jié)果顯示肺癌可以在免疫缺陷小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移到肺部、脾臟和肝臟等主要器官，可見采用構(gòu)建pdx模型后再采集ctcs進(jìn)行移植是可行的。從圖2流式數(shù)據(jù)圖可知病人原代肺癌可以在免疫缺陷小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移到骨、脾臟、肝臟和肺部。人白細(xì)胞抗原(hhla)標(biāo)記人腫瘤細(xì)胞，鼠白細(xì)胞共同抗原(mcd45)標(biāo)記鼠細(xì)胞。

實(shí)施例4：構(gòu)建循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型

(1)前處理：將肺癌組織樣本采用濃度為1％的pbs進(jìn)行清洗2-3次；

(2)皮下移植：將前處理后的肺癌組織樣本剪成體積為15mm³的小塊，采用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建原代癌癥異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)采集循環(huán)腫瘤細(xì)胞：當(dāng)步驟(2)所述pdx小鼠模型培養(yǎng)30-60天后，用co2處死，采集全部外周血，300g離心收集全部血細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液，300g離心收集白細(xì)胞即得所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)采集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞采用pbs進(jìn)行調(diào)節(jié)濃度，調(diào)節(jié)到濃度為40ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側(cè)腎臟，用青霉素-生理鹽水濕潤(rùn)腎包囊，用胰島素針吸取10μl細(xì)胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒，即構(gòu)建成功所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型。

實(shí)施例5：構(gòu)建循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型

(1)前處理：將肺癌組織樣本采用濃度為3％的pbs進(jìn)行清洗2-3次；

(2)皮下移植：將前處理后的肺癌組織樣本剪成體積為10mm³的小塊，采用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建原代癌癥異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)采集循環(huán)腫瘤細(xì)胞：當(dāng)步驟(2)所述pdx小鼠模型培養(yǎng)30-60天后，用co2處死，采集全部外周血，400g離心收集全部血細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液，400g離心收集白細(xì)胞即得所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)采集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞采用pbs進(jìn)行調(diào)節(jié)濃度，調(diào)節(jié)到濃度為50ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側(cè)腎臟，用青霉素-生理鹽水濕潤(rùn)腎包囊，用胰島素針吸取5μl細(xì)胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒，即構(gòu)建成功所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型。

實(shí)施例6：構(gòu)建循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型

(1)前處理：將肺癌組織樣本采用濃度為0.5％的pbs進(jìn)行清洗5次；

(2)皮下移植：將前處理后的肺癌組織樣本剪成體積為30mm³的小塊，采用matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建原代癌癥異種移植模型pdx小鼠模型；

(3)采集循環(huán)腫瘤細(xì)胞：當(dāng)步驟(2)所述pdx小鼠模型培養(yǎng)30-60天后，用co2處死，采集全部外周血，100g離心收集全部血細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液，100g離心收集白細(xì)胞即得所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

(4)腎囊膜移植：將步驟(3)采集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞采用pbs進(jìn)行調(diào)節(jié)濃度，調(diào)節(jié)到濃度為30ctcs/μl，將免疫缺陷小鼠麻醉，選取免疫缺陷小鼠一側(cè)腎臟，用青霉素-生理鹽水濕潤(rùn)腎包囊，用胰島素針吸取20μl細(xì)胞重懸液，移植入受體小鼠腎囊膜下，將腎臟放回體腔中，并向體腔中注入適量青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚，于傷口涂抹碘酒消毒，即構(gòu)建成功所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型。

由于實(shí)施例5-6制備的小鼠模型的結(jié)果與實(shí)施例4類似，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)都采用實(shí)施例4制備的小鼠模型。

實(shí)施例7：循環(huán)腫瘤細(xì)胞小鼠模型的檢測(cè)

將實(shí)施例1構(gòu)建的循環(huán)腫瘤小鼠模型，腫瘤移植60-90天內(nèi)，co2處死小鼠，取小鼠外周血、肺臟、肝臟、脾臟和腫瘤組織，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其中的腫瘤細(xì)胞的比例(hhla+)和遷移(除腫瘤組織外的器官hhla+細(xì)胞比例)，結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果分析：從圖3流式數(shù)據(jù)圖可知ctcs可以在免疫缺陷小鼠體內(nèi)長(zhǎng)成腫瘤，并且轉(zhuǎn)移到骨、脾臟、肝臟和肺部。人白細(xì)胞抗原(hhla)標(biāo)記人腫瘤細(xì)胞，鼠白細(xì)胞共同抗原(mcd45)標(biāo)記鼠細(xì)胞。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。