本發(fā)明涉及生物材料的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法。

背景技術(shù)：

血管內(nèi)植入材料或器械（如，血管支架、人工血管等）表面的抗凝血性能及內(nèi)皮修復(fù)性能仍然是其臨床應(yīng)用面臨的主要問(wèn)題，通過(guò)改變材料的表面性能來(lái)調(diào)控植入周?chē)h(huán)境響應(yīng)并進(jìn)而提高植入材料的性能和功能對(duì)血管內(nèi)植入材料或器械的臨床應(yīng)用具有非常重要的關(guān)鍵意義。迄今為止，諸多表面改性技術(shù)被用來(lái)提高材料的抗凝血性能及誘導(dǎo)內(nèi)皮原位再生，但其效果仍不理想，特別是很難同時(shí)賦予材料以?xún)?yōu)異的抗凝血性能和快速內(nèi)皮修復(fù)性能。通過(guò)在材料表面引入兩種或兩種以上的生物活性分子構(gòu)建具有調(diào)控血液、血管組織及細(xì)胞行為的多功能生物活性層是賦予材料表面優(yōu)異的抗凝血性能及內(nèi)皮修復(fù)性能的常用手段。然而，目前的方法（如，共價(jià)接枝、靜電吸附、固定生物分子復(fù)合物、層層自組裝等）表面生物分子固定量、生物分子活性以及在血管流場(chǎng)環(huán)境中的持續(xù)作用能力等都還有待提高，如，共價(jià)固定的生物分子由于化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致生物分子活性降低，而靜電吸附以及層層自組裝（lbl）引入的生物分子結(jié)合力較弱，在體內(nèi)流場(chǎng)環(huán)境中生物分子的快速流失很難滿(mǎn)足體內(nèi)抗凝血及內(nèi)皮原位快速再生的要求。

納米技術(shù)可從細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)以及細(xì)胞功能調(diào)控、生物活性因子的裝載控釋以及材料綜合性能調(diào)控等不同角度調(diào)控生物材料的性能和功能，為血管內(nèi)植入材料或器械的表面改性提供新的突破口。將裝載了生物活性因子的納米顆粒固定在材料表面可望用于血管內(nèi)植入材料的表面修飾，進(jìn)而通過(guò)活性因子的原位持續(xù)釋放達(dá)到調(diào)控血液及內(nèi)皮細(xì)胞行為的目的。

肝素具有優(yōu)異的抗凝血性能，可以調(diào)控大量的生物及生理反應(yīng)，并且表面固定肝素具有一定的促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)性能。目前常用的肝素化方法（如，離子鍵合、靜電吸附、共價(jià)結(jié)合等）很難保證肝素的持續(xù)控釋行為及其活性，并且表面肝素固定量也很難保證血管內(nèi)植入材料長(zhǎng)期持續(xù)作用的要求。將肝素裝載在介孔硅納米顆?？椎纼?nèi)，不僅可以大大提高肝素分子的裝載量，并且由于肝素的釋放要經(jīng)歷介孔狹長(zhǎng)的孔道可以實(shí)現(xiàn)肝素的可控持續(xù)釋放，其裝載量與釋放行為也可以通過(guò)介孔參數(shù)和表面修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，cu²⁺可作為酶輔因子參與細(xì)胞信號(hào)通路及生物學(xué)應(yīng)答調(diào)控，可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及增強(qiáng)血管發(fā)生，當(dāng)與細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合使用時(shí)，效果更為顯著。此外，cu²⁺還具有催化血液內(nèi)no供體分解釋放no的能力，而no則是調(diào)控血管內(nèi)平衡及維持血運(yùn)通暢的重要分子，因此，在裝載肝素的介孔硅納米顆?？椎纼?nèi)進(jìn)一步裝載cu²⁺，可望實(shí)現(xiàn)抗凝血及促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法，通過(guò)該方法對(duì)血管內(nèi)植入材料或器械進(jìn)行表面改性，可以有效控制材料表面肝素和cu²⁺的裝載量和釋放行為，賦予材料良好的血液相容性，并能顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮再生，從而有效提高材料的生物相容性和植入成功率；多巴胺是一種可以在幾乎所有材料表面進(jìn)行自聚合的化學(xué)分子，并形成牢固結(jié)合的涂層，涂層具有較強(qiáng)的與氨基反應(yīng)的能力，因此，本發(fā)明所采用的方法幾乎可以用于所有生物材料的表面改性，用于固定載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法，包括以下步驟：

1）首先對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面改性，從而獲得氨基修飾的介孔硅納米顆粒（msn-nh2）；

2）進(jìn)而在介孔孔道內(nèi)裝載肝素與cu²⁺；

3）然后用白蛋白對(duì)納米顆粒表面進(jìn)行修飾；

4）最后將納米顆粒固定在多巴胺改性的生物材料表面，得到載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒（msn-nh2@he/cu）的涂層。

本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟1）中，對(duì)介孔硅納米顆粒（msn-nh2）進(jìn)行表面改性方法為：

1.1）將介孔硅納米顆粒與氨基硅烷分子溶液充分混合；

1.2）振蕩反應(yīng)24~48小時(shí)，離心收集納米顆粒；

1.3）乙醇清洗三次；

1.4）在80攝氏度的條件下，真空干燥后得到msn-nh2。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟1.1）中，所述氨基硅烷分子溶液為濃度在10~100mm范圍內(nèi)的3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液或3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液或3-氨丙基三甲氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟2）中，裝載肝素與cu²⁺的方法為：

2.1）將步驟1）得到的msn-nh2加入到濃度在1~10mg/ml范圍內(nèi)的肝素溶液中；

2.2）在37攝氏度的條件下吸附4~12小時(shí)，離心得到載肝素的介孔硅納米顆粒（msn-nh2@he）；

2.3）繼續(xù)將msn-nh2@he溶解到濃度在0.1~1mol/l范圍內(nèi)的cucl2溶液中；

2.4）在37攝氏度的條件下吸附4~12小時(shí)，離心干燥后得到msn-nh2@he/cu。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟3）中，納米顆粒表面修飾的方法為：

3.1）將步驟2）中得到的msn-nh2@he/cu浸沒(méi)到白蛋白、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（edc）及n-羥基丁二酰亞胺（nhs）的混合溶液中；

3.2）在室溫條件下充分反應(yīng)4～12小時(shí)后，離心干燥后得到白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟3.1）中，白蛋白、edc及nhs的混合溶液中的edc與nhs的摩爾比為3:1。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟4）中，納米顆粒固定的方法為：

4.1）將多巴胺修飾的生物材料浸沒(méi)到步驟3）得到的白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu的分散液中；

4.2）在室溫條件下重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)4~12小時(shí)，得到msn-nh2@he/cu的涂層。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟4.1）中，生物材料的多巴胺修飾的方法為：

4.1.1）將生物材料浸沒(méi)到濃度在0.1~1mg/ml范圍內(nèi)的弱堿性的多巴胺溶液中；

4.1.2）重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)12~48小時(shí)。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述多巴胺溶液的ph值在8~8.5的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的有益效果在于，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)勢(shì)：

第一、本發(fā)明的在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法，通過(guò)該方法對(duì)血管內(nèi)植入材料或器械進(jìn)行表面改性，可以有效控制材料表面肝素和cu²⁺的裝載量和釋放行為，賦予材料良好的血液相容性，并能顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮再生，從而有效提高材料的生物相容性和植入成功率。

第二、本發(fā)明的在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法，多巴胺是一種可以在幾乎所有材料表面進(jìn)行自聚合的化學(xué)分子，并形成牢固結(jié)合的涂層，涂層具有較強(qiáng)的與氨基反應(yīng)的能力，因此，本發(fā)明所采用的方法幾乎可以用于所有生物材料的表面改性，用于固定載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒。

附圖說(shuō)明：

圖1為載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒的制備步驟示意圖；

圖1中包括以下步驟：首先用氨基硅烷對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面修飾，然后依次在介孔孔道內(nèi)吸附肝素和cu²⁺，最后用碳二亞胺將白蛋白固定在納米顆粒表面。

圖2為生物材料表面固定納米顆粒的制備步驟示意圖；

圖2中包括以下步驟：首先基體材料表面首先沉積聚多巴胺涂層，進(jìn)而利用納米顆粒表面白蛋白中氨基與多巴胺涂層的化學(xué)反應(yīng)，將載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒固定在材料表面，獲得載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層。

圖3為鈦表面沉積多巴胺涂層及固定納米顆粒后的表面血小板粘附的掃描電鏡圖。

圖4為鈦表面沉積多巴胺涂層及固定納米顆粒后的表面內(nèi)皮細(xì)胞粘附的熒光顯微鏡圖。

具體實(shí)施方式：

為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

此外，應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1

在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法，包括以下步驟：

1）首先對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面改性，從而獲得msn-nh2；

2）進(jìn)而在介孔孔道內(nèi)裝載肝素與cu²⁺；

3）然后用白蛋白對(duì)納米顆粒表面進(jìn)行修飾；

4）最后將納米顆粒固定在多巴胺改性的生物材料表面，得到msn-nh2@he/cu的涂層。

所述步驟1）中，對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面改性方法為：

1.1）將介孔硅納米顆粒與氨基硅烷分子溶液充分混合；

1.2）振蕩反應(yīng)30小時(shí)，離心收集納米顆粒；

1.3）乙醇清洗三次；

1.4）在80攝氏度的條件下，真空干燥后得到msn-nh2。

所述步驟1.1）中，所述氨基硅烷分子溶液為濃度為40mm的3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液。

所述步驟2）中，裝載肝素與cu²⁺的方法為：

2.1）將步驟1）得到的msn-nh2加入到濃度為6mg/ml的肝素溶液中；

2.2）在37攝氏度的條件下吸附9小時(shí)，離心得到msn-nh2@he；

2.3）繼續(xù)將msn-nh2@he溶解到濃度為0.7mol/l的cucl2溶液中；

2.4）在37攝氏度的條件下吸附8小時(shí)，離心干燥后得到msn-nh2@he/cu。

所述步驟3）中，納米顆粒表面修飾的方法為：

3.1）將步驟2）中得到的msn-nh2@he/cu浸沒(méi)到白蛋白、edc及nhs的混合溶液中；

3.2）在室溫條件下充分反應(yīng)10小時(shí)后，離心干燥后得到白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu。

所述步驟3.1）中，白蛋白、edc及nhs的混合溶液中的edc與nhs的摩爾比為3:1。

所述步驟4）中，納米顆粒固定的方法為：

4.1）將多巴胺修飾的生物材料浸沒(méi)到步驟3）得到的白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu的分散液中；

4.2）在室溫條件下重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)10小時(shí)，得到msn-nh2@he/cu的涂層。

所述步驟4.1）中，生物材料的多巴胺修飾的方法為：

4.1.1）將生物材料浸沒(méi)到濃度為0.5mg/ml的弱堿性的多巴胺溶液中；

4.1.2）重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)40小時(shí)。

所述多巴胺溶液的ph值為8.2。

實(shí)施例2

在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法，包括以下步驟：

1）首先對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面改性，從而獲得msn-nh2；

2）進(jìn)而在介孔孔道內(nèi)裝載肝素與cu²⁺；

3）然后用白蛋白對(duì)納米顆粒表面進(jìn)行修飾；

4）最后將納米顆粒固定在多巴胺改性的生物材料表面，得到msn-nh2@he/cu的涂層。

所述步驟1）中，對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面改性方法為：

1.1）將介孔硅納米顆粒與氨基硅烷分子溶液充分混合；

1.2）振蕩反應(yīng)30小時(shí)，離心收集納米顆粒；

1.3）乙醇清洗三次；

1.4）在80攝氏度的條件下，真空干燥后得到msn-nh2。

所述步驟1.1）中，所述氨基硅烷分子溶液為濃度為60mm的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液。

所述步驟2）中，裝載肝素與cu²⁺的方法為：

2.1）將步驟1）得到的msn-nh2加入到濃度為8mg/ml的肝素溶液中；

2.2）在37攝氏度的條件下吸附6小時(shí)，離心得到msn-nh2@he；

2.3）繼續(xù)將載msn-nh2@he溶解到濃度為0.8mol/l的cucl2溶液中；

2.4）在37攝氏度的條件下吸附9小時(shí)，離心干燥后得到msn-nh2@he/cu。

所述步驟3）中，納米顆粒表面修飾的方法為：

3.1）將步驟2）中得到的msn-nh2@he/cu浸沒(méi)到白蛋白、edc及nhs的混合溶液中；

3.2）在室溫條件下充分反應(yīng)7小時(shí)后，離心干燥后得到白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu。

所述步驟3.1）中，白蛋白、edc及nhs的混合溶液中的edc與nhs的摩爾比為3:1。

所述步驟4）中，納米顆粒固定的方法為：

4.1）將多巴胺修飾的生物材料浸沒(méi)到步驟3）得到的白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu的分散液中；

4.2）在室溫條件下重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)9小時(shí)，得到msn-nh2@he/cu的涂層。

所述步驟4.1）中，生物材料的多巴胺修飾的方法為：

4.1.1）將生物材料浸沒(méi)到濃度為0.6mg/ml的弱堿性的多巴胺溶液中；

4.1.2）重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)36小時(shí)。

所述多巴胺溶液的ph值為8.1。

實(shí)施例3

在生物材料表面制備載肝素及cu²⁺的介孔硅納米顆粒涂層的方法，包括以下步驟：

1）首先對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面改性，從而獲得msn-nh2；

2）進(jìn)而在介孔孔道內(nèi)裝載肝素與cu²⁺；

3）然后用白蛋白對(duì)納米顆粒表面進(jìn)行修飾；

4）最后將納米顆粒固定在多巴胺改性的生物材料表面，得到msn-nh2@he/cu的涂層。

所述步驟1）中，對(duì)介孔硅納米顆粒進(jìn)行表面改性方法為：

1.1）將介孔硅納米顆粒與氨基硅烷分子溶液充分混合；

1.2）振蕩反應(yīng)30小時(shí)，離心收集納米顆粒；

1.3）乙醇清洗三次；

1.4）在80攝氏度的條件下，真空干燥后得到msn-nh2。

所述步驟1.1）中，所述氨基硅烷分子溶液為濃度為55mm的3-氨丙基三甲氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液。

所述步驟2）中，裝載肝素與cu²⁺的方法為：

2.1）將步驟1）得到的msn-nh2加入到濃度為8mg/ml的肝素溶液中；

2.2）在37攝氏度的條件下吸附8小時(shí)，離心得到msn-nh2@he；

2.3）繼續(xù)將載msn-nh2@he溶解到濃度為0.8mol/l的cucl2溶液中；

2.4）在37攝氏度的條件下吸附8小時(shí)，離心干燥后得到msn-nh2@he/cu。

所述步驟3）中，納米顆粒表面修飾的方法為：

3.1）將步驟2）中得到的msn-nh2@he/cu浸沒(méi)到白蛋白、edc及nhs的混合溶液中；

3.2）在室溫條件下充分反應(yīng)7小時(shí)后，離心干燥后得到白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu。

所述步驟3.1）中，白蛋白、edc及nhs的混合溶液中的edc與nhs的摩爾比為3:1。

所述步驟4）中，納米顆粒固定的方法為：

4.1）將多巴胺修飾的生物材料浸沒(méi)到步驟3）得到的白蛋白修飾的msn-nh2@he/cu的分散液中；

4.2）在室溫條件下重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)8小時(shí)，得到msn-nh2@he/cu的涂層。

所述步驟4.1）中，生物材料的多巴胺修飾的方法為：

4.1.1）將生物材料浸沒(méi)到濃度為0.6mg/ml的弱堿性的多巴胺溶液中；

4.1.2）重復(fù)反應(yīng)三次，每次均充分反應(yīng)32小時(shí)。

所述多巴胺溶液的ph值為8.4。

由圖3可知，原始鈦表面（a）及沉積多巴胺（b）的樣品表面有大量的血小板粘附，并且粘附的血小板大量聚集和激活，而固定載肝素及cu²⁺介孔硅納米顆粒后，血小板粘附數(shù)量大大減少，表明血液相容性得到提高。

由圖4可知，原始鈦表面（a）及沉積多巴胺（b）的樣品表面內(nèi)皮細(xì)胞粘附數(shù)量較少，并且其鋪展?fàn)顟B(tài)較差，而固定納米顆粒后（c），內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量大大增加，表明載肝素及cu²⁺的納米顆粒表面可以顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。