本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種緩解體力疲勞、抗氧化功能的生物制品及制備方法。

背景技術(shù)：

隨著人們生活節(jié)奏的加快，生活和工作壓力的不斷增加，疲勞已成為不可忽視的問題。who調(diào)查，全球有35％以上的人處于疲勞狀態(tài),由于長時間進(jìn)行復(fù)雜的腦力勞動，血液里的葡萄糖、多種氨基酸耗量過大，引起腦的血流和氧氣供應(yīng)不足，腦細(xì)胞的興奮、抑制失去平衡，生理功能低下，就會產(chǎn)生疲勞感，中年男性人群疲勞狀態(tài)達(dá)60％。

運(yùn)動時產(chǎn)生大量的自由基，當(dāng)線粒體受到自由基攻擊時，atp的生成量和供給量就會減少，肌肉工作能力下降。因此，氧化應(yīng)激是機(jī)體產(chǎn)生疲勞的重要原因。

抗氧化是指抗氧化自由基的簡稱，人體因?yàn)榕c外界的持續(xù)接觸，包括呼吸、外界污染、放射線照射等因素不斷的在人體體內(nèi)產(chǎn)生自由基?？茖W(xué)研究表明，癌癥、衰老或其它疾病大都與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)。研究抗氧化可以有效克服其所帶來的危害，所以抗氧化被保健品、化妝品企業(yè)列為主要的研發(fā)方向之一，也是市場最重要的功能性訴求之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種緩解體力疲勞、抗氧化功能的生物制品。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種緩解體力疲勞、抗氧化功能的生物制品，包括牡蠣水提物、殼寡糖及林蛙油肽，所述牡蠣水提物的百分比含量為50％～90％，殼寡糖的百分比含量為5％～30％，林蛙油肽的百分比含量為5％～20％。

進(jìn)一步，所述牡蠣水提物中水溶性多糖占總質(zhì)量的28％～32％，水溶性蛋白占總質(zhì)量的15～25％，對超氧陰離子清除率ic50為55-65μg/ml。進(jìn)一步，所述殼寡糖的分子量為2000～3000da，脫乙酰度≥90％，對超氧陰離子清除率ic50為550-650μg/ml。(ic50表示清除50％的超氧陰離子所需要的牡蠣水提物的濃度)。

進(jìn)一步，所述林蛙油肽分子量小于3000da，肽含量≥90％，對超氧陰離子清除率ic50為6-10mg/ml。

一種緩解體力疲勞、抗氧化功能的生物制品的制備方法，該方法的步驟包括：牡蠣水提物、殼寡糖及林蛙油肽的制備；將制備好的牡蠣水提物按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％～90％、殼寡糖按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％～30％及林蛙油肽按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％～20％混合均勻，裝入膠囊，得到生物制品。

進(jìn)一步，所述牡蠣水提物的制備：取新鮮牡蠣脫殼，勻漿后，向牡蠣肉勻漿中加水，40℃～60℃提取2～4小時，離心10～30分鐘，取上清液，將上清液40℃～60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至初始體積的1/4～1/5后，冷凍干燥，得到牡蠣水提物。

進(jìn)一步，所述牡蠣肉勻漿與水得比例為1:0.5～1:0.8。進(jìn)一步，所述殼寡糖的制備：取分子量為170kda～190kda的殼聚糖，用2％～4％醋酸溶解，配制2％～4％的殼聚糖溶液，向殼聚糖溶液中加入h2o2，至體系中h2o2的體積濃度為0.4％～0.6％，在微波功率700w～900w，溫度70℃～90℃，降解20-30分鐘，得到分子量為2000～3000kda的殼寡糖溶液，將殼寡糖溶液噴霧干燥后得殼寡糖粉末。進(jìn)一步，所述林蛙油肽的制備：取林蛙油粉加入去離子水，用0.5mol/l的naoh溶液調(diào)ph為7.5，加入胰蛋白酶，至胰蛋白酶與林蛙油粉質(zhì)量比為1％～3％，在40℃的恒溫水浴中攪拌酶解5～7小時，酶解結(jié)束后，沸水浴中加熱5～15min，使酶鈍化；將酶解液冷卻至室溫，用0.5mol/l的hcl溶液調(diào)ph為中性，離心10～20分鐘，取上清液，將上清液在45～55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至初始體積的1/4～1/5后，冷凍干燥，得到林蛙油肽。

進(jìn)一步，林蛙油粉與去離子水質(zhì)量比為1:3～1:5。

本發(fā)明有益效果在于：本發(fā)明采用牡蠣水提物、殼寡糖及林蛙油肽的成分與成分比例，使得殼寡糖和林蛙油肽將促進(jìn)牡蠣水提物中蛋白質(zhì)，多糖及礦物質(zhì)的吸收；同時本發(fā)明具有無毒、無副作用以及易吸收的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中牡蠣水提物、殼寡糖及林蛙油肽具有較強(qiáng)的超氧陰離子清除率從而增大了本發(fā)明抗氧化性能。本發(fā)明小分子的林蛙油肽和低分子量殼寡糖利于人體吸收，促進(jìn)人體人蛋白質(zhì)的合成。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：(1)制備100g牡蠣水提物：新鮮牡蠣脫殼、勻漿后，按照料液比1:0.5(牡蠣肉勻漿：水)加水，50℃提取3小時，離心20分鐘，取上清液，將上清液在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至初始體積的1/5后，冷凍干燥，得到牡蠣水提物100g；檢測牡蠣水提物水溶性多糖含量為28～32％，水溶性蛋白含量15～25％，對超氧陰離子清除率ic50為55-65μg/ml。

(2)制備60g殼寡糖：取分子量為180kda的殼聚糖(脫乙酰度≥90％)，用3％醋酸溶解，配制3％的殼聚糖溶液，向殼聚糖溶液中加入適量的h2o2，至體系中h2o2的濃度為0.6％，在微波功率800w，溫度80℃，降解20-30分鐘，得到分子量為2000～3000kda的殼寡糖溶液，將殼寡糖噴霧干燥后得殼寡糖粉末；檢測殼寡糖的分子量為2000～3000da，脫乙酰度≥90％，對超氧陰離子清除率ic50為550-650μg/ml。

(3)制備40g林蛙油肽：取林蛙油粉液固質(zhì)量比為4:1的比例加入去離子水，用0.5mol/l的naoh溶液調(diào)ph為7.5，加入胰蛋白酶，至酶與林蛙油粉質(zhì)量比為2％，在40℃的恒溫水浴中攪拌酶解6小時，酶解結(jié)束后，沸水浴中加熱10min，使酶鈍化；將酶解液冷卻至室溫，用0.5mol/l的hcl溶液調(diào)ph為中性，離心15分鐘，取上清液，將上清液在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至初始體積的1/5后，冷凍干燥，得到林蛙油肽；檢測林蛙油肽分子量小于3000da，肽含量≥90％，對超氧陰離子清除率ic50為6-10mg/ml。

(4)將步驟(1)、(2)、(3)中的原料按照牡蠣水提100g、殼寡糖60g、林蛙油肽40g的比例混合均勻后，得制品1。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1不同在于制備180g牡蠣水提物，制備10g殼寡糖，制備10g林蛙油肽，混合均勻，得到制品2。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1不同在于制備160g牡蠣水提物，制備20g殼寡糖，制備20g林蛙油肽，混合均勻，得到制品3。

實(shí)施例4

與實(shí)施例1不同在于制備160g牡蠣水提物，制備40g殼寡糖，制備20g林蛙油肽，混合均勻，得到制品4。

實(shí)施例5

與實(shí)施例1不同在于制備140g牡蠣水提物，制備20g殼寡糖，制備40g林蛙油肽，混合均勻，得到制品5。

實(shí)施例6

與實(shí)施例1不同在于制備120g牡蠣水提物，制備40g殼寡糖，制備40g林蛙油肽，混合均勻，得到制品6。

實(shí)施例7

與實(shí)施例1不同在于制備100g牡蠣水提物，制備60g殼寡糖，制備40g林蛙油肽，混合均勻，得到制品7。

實(shí)施例8

與實(shí)施例1不同在于制備120g牡蠣水提物，制備60g殼寡糖，制備20g林蛙油肽，混合均勻，得到制品8。

實(shí)施例9

與實(shí)施例1不同在于制備150g牡蠣水提物，制備30g殼寡糖，制備20g林蛙油肽，混合均勻，得到制品9。

實(shí)施例10

與實(shí)施例1不同在于制備160g牡蠣水提物，制備10g殼寡糖，制備30g林蛙油肽，混合均勻，得到制品10。

下面將通過動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來證明本發(fā)明具有的技術(shù)效果。

本發(fā)明產(chǎn)品具有緩解體力疲勞功效：緩解體力疲勞試驗(yàn)方法參考保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)規(guī)范(2003版，中國人民共和國衛(wèi)生部)

試驗(yàn)例1

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

1.1受試物

實(shí)施例1、實(shí)施例7、實(shí)施例9中制備的生物制品1、7、9。

1.2實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠48只，雄性，體重為18-22克，隨機(jī)分為4組，每組12只。

1.3劑量設(shè)計和分組

受試物的推薦劑量為成人(按體重60kg計算)2.8g，按人體推薦量的10倍即467mg/kg.d對小鼠進(jìn)行給藥，對照組灌胃蒸餾水，給藥頻率為1次/日，給藥時間為30天。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟

末次給受試樣品30min后，將尾根部負(fù)荷5％體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水溫25℃±1.0℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，即小鼠負(fù)重游泳時間。

結(jié)果見表1。

試驗(yàn)例2

血清尿素測定

2.1受試物

實(shí)施例1、實(shí)施例7、實(shí)施例9中制備的生物制品1、7、9。

2.2實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠48只，雄性，體重為18-22克，隨機(jī)分為4組，每組12只。

2.3劑量設(shè)計和分組

受試物的推薦劑量為成人(按體重60kg計算)2.8g，按人體推薦量的10倍即467mg/kg.d對小鼠進(jìn)行給藥，對照組灌胃蒸餾水，給藥頻率為1次/日，給藥時間為30天。

2.4實(shí)驗(yàn)方法

末次給受試樣品30min后，在溫度為30℃的水中不負(fù)重游泳90min，休息60min后采血。小鼠拔眼球采全血約0.5ml(不加抗凝劑)。置4℃冰箱約3h，血凝固后2000pm/min離心15min，取血清備用。血清中的尿素在室溫下可穩(wěn)定24h，在4-6℃可穩(wěn)定7天以上。用二乙酰-肟法測定血清尿素含量。結(jié)果見表2。

試驗(yàn)例3

肝糖原測定

3.1受試物

實(shí)施例1、實(shí)施例7、實(shí)施例9中制備的生物制品1、7、9。

3.2實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠48只，雄性，體重為18-22克，隨機(jī)分為4組，每組12只。

3.3劑量設(shè)計和分組

受試物的推薦劑量為成人(按體重60kg計算)2.8g，按人體推薦量的10倍即467mg/kg.d對小鼠進(jìn)行給藥，對照組灌胃蒸餾水，給藥頻率為1次/日，給藥時間為30天。

3.4實(shí)驗(yàn)方法

末次給受試樣品30min后處死動物，取肝臟，蒽酮法測定肝糖原。結(jié)果見表2。

試驗(yàn)例4

乳酸測定

4.1受試物

實(shí)施例1、實(shí)施例7、實(shí)施例9中制備的生物制品1、7、9。

4.2實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠48只，雄性，體重為18-22克，隨機(jī)分為4組，每組12只。

4.3劑量設(shè)計和分組

受試物的推薦劑量為成人(按體重60kg計算)2.8g，按人體推薦量的10倍即467mg/kg.d對小鼠進(jìn)行給藥，對照組灌胃蒸餾水，給藥頻率為1次/日，給藥時間為30天。

4.4實(shí)驗(yàn)方法

末次給受試樣品30min后采血，然后不負(fù)重在溫度為30℃的水中游泳10min后停止。在游泳前各采血20ul加入40ul破膜液中，立即充分振蕩破碎細(xì)胞；游泳后立即采血20ul加入40ul破膜液中，立即充分振蕩破碎細(xì)胞；休息20min后再各采血20ul加入40ul破膜液中，用乳酸儀測定。小鼠用毛細(xì)管從內(nèi)眥采血。結(jié)果見表2。

緩解體力疲勞功能判定：

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，且血乳酸、血清尿素、肝糖原三項(xiàng)生化指標(biāo)中任二項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。從表1、表2可以看出，本發(fā)明產(chǎn)品與對照相比，能夠明顯提高小鼠負(fù)重游泳時間，提高肝糖原含量，降低血清尿素和血乳酸含量，且p<0.05，說明本發(fā)明產(chǎn)品具有緩解體力疲勞的功效。

表1.本發(fā)明產(chǎn)品對小鼠力竭游泳時間的影響(n＝10)

*p<0.05,表明樣品與對照相比，存在顯著性差異

表2.本發(fā)明產(chǎn)品對小鼠血清尿素、肝糖原、血乳酸的影響(n＝10)

*p<0.05,表明樣品與對照相比，存在顯著性差異

以下試驗(yàn)表明本發(fā)明產(chǎn)品具有抗氧化功效：

抗氧化實(shí)驗(yàn)方法參考國家食品藥品監(jiān)督管理局以國食藥監(jiān)?；?012〕107號文件《抗氧化功能評價方法》(2012.4.23印發(fā))

1受試物

實(shí)施例1、實(shí)施例7、實(shí)施例9中制備的生物制品1、7、9。

2實(shí)驗(yàn)動物

昆明種健康成年小鼠48只，雄性，體重為25-30克，隨機(jī)分為4組，每組12只。

3劑量設(shè)計和分組

受試物的推薦劑量為成人(按體重60kg計算)2.8g，按人體推薦量的10倍即467mg/kg.d對小鼠進(jìn)行給藥，對照組灌胃蒸餾水，給藥頻率為1次/日，給藥時間為30天。

4實(shí)驗(yàn)步驟

選25-30g健康成年小鼠，隨機(jī)分為4個組，1個模型對照組和3個受試樣品組。3個樣品組按照467mg/kg.d進(jìn)行灌胃給藥，模型對照組灌胃蒸餾水，給藥頻率為1次/日，給藥時間為30天。末次灌胃后，模型組對照組和3個樣品組禁食16小時(過夜)，然后1次性灌胃給予50％乙醇12ml/kgbw，6小時后取材，測血清或肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。結(jié)果見表3。

抗氧化功能判定：

過氧化脂質(zhì)含量、蛋白質(zhì)羰基、抗氧化酶活性、還原性谷胱甘肽四項(xiàng)指標(biāo)中三項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品抗氧化動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。從表3中可以看出，與對照組相比，本發(fā)明產(chǎn)品能夠明顯降低過氧化脂質(zhì)含量(mda)、蛋白質(zhì)羰基(pco)的含量，明顯提高抗氧化酶活性(sod)、還原性谷胱甘肽(gsh-px)的活性，且p<0.05，說明本發(fā)明產(chǎn)品具有抗氧化功效。

表3本發(fā)明產(chǎn)品對小鼠mda、pco、sod、gsh-px含量的影響

*p<0.05,表明樣品與對照相比，存在顯著性差異。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。