本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，更具體地講，涉及二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備治療肺癌藥物中的應用。

背景技術：

肺癌為臨床常見的惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤中女性的肺癌發(fā)病率和死亡率均占第二位，男性發(fā)病率和死亡率占第一位。我國是世界第一肺癌大國，采取積極措施防治肺癌成為我國目前研究重點。雖然肺癌的治療方法在在持續(xù)改進，但患者預后仍然很差，根據(jù)流行病學調(diào)查顯示，自診斷之日起肺癌的5年生存率只有16％。目前，肺癌治療的主要手段有早期手術治療、放療和化療。但由于肺癌在早期缺乏典型臨床癥狀，約70％-80％的患者在確診肺癌時已是晚期，會錯失手術機會，而可以進行手術的有僅20％-30％，且高達50％以上的患者會有術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移。故大部分患者，特別是晚期肺癌患者，仍需采用以化療為主的綜合治療，但多數(shù)晚期病人卻面臨復發(fā)和耐藥的問題。因此開發(fā)新的化療藥物對于肺癌的治療有重要意義。而誘導腫瘤細胞凋亡是化療藥物抗腫瘤治療的一個關鍵因素，已成為國際腫瘤研究的一個熱點。

二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物屬于聯(lián)烯類化合物的范疇,聯(lián)烯類化合物含有1,2-丙二烯結構，官能團化的聯(lián)烯通常顯示廣泛的抗菌、細胞毒和酶抑制活性，而本研究的二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物就是官能團化的聯(lián)烯化合物。早期的聯(lián)烯化合物多從天然產(chǎn)物里提取，到目前為止，人們已經(jīng)成功分離得到150多種含有聯(lián)烯結構的天然產(chǎn)物分子，其中大多數(shù)顯示出良好的生物活性。海洋生物是提取聯(lián)烯化合物的重要來源，1996年，國內(nèi)的林永成教授率先對南海的海洋植物“紅樹林”內(nèi)生真菌xylariasp的代謝產(chǎn)物開展了研究，從中分離出包括聯(lián)烯在內(nèi)的新化合物五十多種，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其中有些聯(lián)烯化合物有著極好的生理活性。但由于通過分離方法所得的聯(lián)烯化合物的量比較少,難以進行大規(guī)?；钚詼y試和藥理研究，故參考天然聯(lián)烯化合物的結構進行人工合成是研究該類化合物的重要方向。本研究使用的(1-苯基-1,2-丙二烯-1-基)二苯基氧膦是通過合成得到的新型化合物,其制備方法參考:haoguo,rongqian,yinlongguo,andshengmingma.neighboringgroupparticipationofphosphineoxidefunctionalityinthehighlyregio-andstereoselectiveiodohydroxylationof1,2-allenylicdiphenylphosphineoxides.j.org.chem.2008,73(20),7934-7938。2016年在《oncotarget》雜志已有文獻報道此化合物可以抑制卵巢癌細胞增殖，并可增強順鉑的化療效果，通過多種途徑誘導卵巢癌細胞凋亡。但通過中英文數(shù)據(jù)庫檢索均未發(fā)現(xiàn)該化合物在肺癌方面的研究和應用，尚處于空白狀態(tài)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備治療肺癌藥物中的應用。

本發(fā)明的第二個目的在于提供二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備誘導腫瘤細胞的lc3a/b蛋白表達增高藥物中的應用。

本發(fā)明的第三個目的在于提供二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物與抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。

為實現(xiàn)本發(fā)明第一個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備治療肺癌藥物中的應用。

作為一個優(yōu)選方案，所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物的結構式如下：

作為一個優(yōu)選方案，所述肺癌為肺腺癌和肺鱗癌。

為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備誘導腫瘤細胞的自噬因子lc3a/b蛋白表達增高藥物中的應用，所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物的結構式如下：

作為一個優(yōu)選方案，所述腫瘤是指肺腺癌和肺鱗癌。

為實現(xiàn)本發(fā)明第三個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物與抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥在制備治療抗腫瘤藥物中的應用，所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物的結構式如下：

作為一個優(yōu)選方案，所述腫瘤是指肺腺癌和肺鱗癌。

作為一個優(yōu)選方案，所述抗腫瘤藥物是指鉑類、靶向藥物和紫杉醇類。

本發(fā)明所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物可采用本領域此類化合物常規(guī)制備方法制得。化合物的命名為：(1-苯基-1,2-丙二烯-1-基)二苯基氧膦，簡稱phpo，上述化合物制備方法具體可參見haoguo,rongqian,yinlongguo,andshengmingma.neighboringgroupparticipationofphosphineoxidefunctionalityinthehighlyregio-andstereoselectiveiodohydroxylationof1,2-allenylicdiphenylphosphineoxides.j.org.chem.2008,73(20),7934-7938。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：本化合物能夠很好地抑制肺癌腫瘤細胞的生長，機制涉及通過促進自噬和激活mapk通路促進其凋亡，無毒副作用。

附圖說明

圖1為不同濃度的化合物phpo在各時間點對肺癌a549細胞的生長抑制作用的抑制率圖。

圖2為不同濃度的化合物phpo在各時間點對肺癌ncl-h520細胞的生長抑制作用的抑制率圖

圖3為不同濃度的為化合物phpo影響肺癌a549細胞凋亡的流式分析圖。

圖4為不同濃度的為化合物phpo影響肺癌ncl-h520細胞凋亡的流式分析圖。

圖5為phpo對肺癌a549細胞自噬因子lc3a/b影響的免疫熒光圖。

圖6為phpo對肺癌ncl-h520細胞自噬因子lc3a/b影響的免疫熒光圖。

圖7phpo對肺癌a549細胞和ncl-h520細胞自噬因子lc3a/b影響的蛋白印跡圖。

圖8為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組影響肺癌a549細胞凋亡的流式分析圖。

圖9為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組影響肺癌ncl-h520細胞凋亡的流式分析圖。

圖10為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組抑制肺癌a549細胞增殖的柱狀比較圖。

圖11為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組影響抑制肺癌ncl-h520細胞增殖的柱狀比較圖。

圖12為phpo誘導肺癌a549細胞和肺癌ncl-h520細胞g1期阻滯的流式分析圖。

圖13為為phpo影響肺癌a549細胞和肺癌ncl-h520細胞遷移的顯微鏡圖。

圖14為phpo和對照組影響肺癌a549細胞遷移的柱狀比較圖。

圖15為phpo和對照組影響肺癌ncl-h520細胞細胞遷移的柱狀比較圖。

圖16為抑制腫瘤生長試驗中，對照組和phpo組治療后，人肺癌a549裸鼠移植瘤模型的腫瘤體積隨治療時間的變化圖。

圖17為抑制腫瘤生長試驗中，對照組和phpo組治療后，人肺癌ncl-h520裸鼠移植瘤模型的腫瘤體積隨治療時間的變化圖。

圖18為抑制皮下腫瘤a549和ncl-h520生長試驗中，對照組、phpo組治療后各組小鼠體內(nèi)腫瘤體積大小比較圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例

1.材料和方法

1.1、藥物：[(1-苯基-1,2-丙二烯-1-基)二苯基氧膦，簡稱phpo]，制備方法具體可參見haoguo,rongqian,yinlongguo,andshengmingma.neighboringgroupparticipationofphosphineoxidefunctionalityinthehighlyregio-andstereoselectiveiodohydroxylationof1,2-allenylicdiphenylphosphineoxides.j.org.chem.2008,73(20),7934-7938。

1.2、細胞系：人肺腺癌細胞系a549(貨號為htb-77)和人肺鱗癌細胞系ncl-h520(貨號為htb-182)購自美國模式菌種收集中心(atcc)；細胞系培養(yǎng)基為rpmi1640，含青霉素100u/ml和鏈霉素100μg/ml，10％的胎牛血清(gibco產(chǎn)品，10099141)，培養(yǎng)條件為37℃,5％co2,thermo細胞培養(yǎng)箱。參考文獻：1.songl,lid,guy,wenzm,jiej,zhaod,penglp.microrna-126targetingpik3r2inhibitsnsclsa549cellproliferation,migration,andinvasionbyregulationofpten/pi3k/aktpathway.clinicallungcancer.2016sep；15(5):e65-e75.2.liuc,huangx,hous,etal.silencingoftripartitemotif(trim)29inhibitsproliferationandinvasionandincreaseschemosensitivitytocisplatininhumanlungsquamouscancernci-h520cells.[j].thoraciccancer,2014,6(1):31-7。

1.3、細胞毒性實驗：細胞以不同藥物濃度，不同作用時間下測定細胞的半數(shù)致死量。

1.4、細胞凋亡分析：細胞用藥物處理后，用凋亡染色試劑盒染色，然后用流式細胞技術分析。

1.5、細胞自噬實驗：細胞分別用phpo、phpo聯(lián)合自噬抑制劑氯喹處理后，用流式細胞儀檢測細胞增殖和細胞凋亡的變化情況。

1.6、免疫印跡實驗：蛋白免疫印跡檢測細胞主要信號通路中相關主要蛋白的變化。

1.7、免疫熒光實驗:檢測細胞主要信號通路中相關主要蛋白的變化。

1.8、細胞周期實驗細胞用藥物處理后，染色后用流式細胞技術分析。

1.9、劃痕實驗：在6孔細胞培養(yǎng)板的貼壁細胞層劃痕后加入含phpo的培養(yǎng)基的方式測定phpo對肺癌細胞遷移能力的影響。

1.10、動物實驗：用小鼠移植瘤模型檢測藥物對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的效果。

1.11、統(tǒng)計分析：用卡方、t檢驗等方法。

2.結果

2.1、phpo抑制細胞增殖

用肺癌細胞系a549和ncl-h520做cck-8實驗，檢測phpo的抗增殖作用。用不同濃度(見表1)的phpo處理24小時、48小時和72小時后，采用cck-8實驗分別檢測細胞活性，結果表明phpo以濃度依賴的方式成功抑制細胞的增殖。且隨著時間的增長，phpo對a549細胞的ic50的值也隨之下降。具體見圖1和圖2。圖1-2分別為不同濃度的化合物phpo在各時間點對肺癌a549細胞和ncl-h520細胞和的生長抑制作用的抑制率圖。phpo對兩種細胞系的ic50數(shù)值見表1

表1.phpo處理細胞不同時間測得半數(shù)致死量(ic50)

2.2、phpo誘導腫瘤細胞凋亡

為了證實phpo對肺癌細胞的促凋亡作用，對a549和ncl-h520細胞用av/pi雙染后做流式分析。分別用dmso和phpo處理24小時后雙染檢測(處理48小時后，對照組和加藥組檢測顯示機械損傷的比例較高，所以改成處理24小時檢測)。phpo組凋亡和壞死的總比例明顯高于對照組，其中對ncl-h520細胞的促凋亡作用更為明顯。結果表明phpo有促進肺癌細胞凋亡的作用(p<0.05)，且作用強弱與劑量相關。具體見圖3和圖4。圖3-4為不同濃度的為化合物phpo影響肺癌a549和ncl-h520細胞凋亡的流式分析圖。

2.3、phpo可以誘導腫瘤細胞自噬

分別用dmso和phpo處理24小時后，利用westernblot及免疫熒光檢測自噬相關蛋白lc3a/b。結果顯示，phpo可以誘導a549細胞和ncl-h520的lc3a/b蛋白表達增高(p<0.05)，且呈劑量依賴，說明phpo可以誘導a549和ncl-h520細胞的lc3a/b蛋白表達增高從而促進發(fā)生自噬。具體見圖5-7。圖5-6為采用免疫熒光實驗檢測肺癌a549細胞和ncl-h520的lc3a/b變化圖。圖7為采用免疫印跡法檢測肺癌a549細胞和ncl-h520的lc3a/b變化圖。

2.4、phpo通過自噬抑制肺癌細胞增殖

為了驗證自噬在phpo抑制肺癌細胞增殖中的作用，分別用phpo(40μm)及自噬抑制劑氯喹(chloroquine，cq，5μm)處理a549細胞24小時，用phpo(25μm)及cq(5μm)處理ncl-h520細胞24小時。利用annexinv/pi及cck-8法檢測細胞凋亡及細胞增殖，結果發(fā)現(xiàn)cq可以顯著抑制phpo誘導的細胞凋亡，減弱其抑制增殖的能力。具體見圖8-11。圖8-9為流式細胞儀檢測phpo對肺癌細胞自噬影響的分析圖，圖10-11為cck-8法檢測phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組對肺癌a549和ncl-h520細胞增殖影響的柱狀比較圖。

2.5、phpo誘導腫瘤細胞g1期阻滯

為了證實phpo能誘導肺癌細胞g1期阻滯，將a549細胞和ncl-h520細胞用rpmi1640完全培養(yǎng)液和phpo(分別為40μmol/l和25μmol/l)處理24h后，將實驗組和對照組的細胞分別進行收集，用冰凍乙醇固定細胞過夜后，離心5min棄上層乙醇，分別用pbs進行重懸，用含0.1％tritonx-100和rnase的pbs混合液重懸細胞，加入pi避光孵育30分鐘，用流式細胞儀進行檢測分析，具體實驗結果見圖12。結果表明phpo有誘導肺癌細胞g1期阻滯的作用(p<0.05)。圖12為phpo誘導肺癌a549細胞和肺癌ncl-h520細胞g1期阻滯的流式分析圖。

2.6、phpo能抑制肺癌細胞的遷移

肺癌a549、ncl-h520的對照組以及藥物phpo組在6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，在貼壁細胞層用10μl加樣槍頭豎向劃寬度均勻、一致的細胞傷口模型，然后分別將phpo加入含1％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基(終濃度分別為35um和20um)，對組加入不含藥物的等體積培養(yǎng)液(含與藥物相同劑量的dmso)，分別在細胞培養(yǎng)箱中孵育48h后，于光學顯微鏡下測算各劃痕的寬度。結果表明，phpo對肺癌細胞的遷移有抑制作用(p<0.05)。具體實驗結果見圖13-15。圖13為phpo影響肺癌a549細胞和肺癌ncl-h520細胞遷移顯微鏡圖。圖14-15為phpo影響肺癌a549細胞和肺癌ncl-h520細胞遷移的柱狀比較圖。

2.7phpo抑制體外肺癌腫瘤生長

皮下接種腫瘤細胞數(shù)量5百萬，1-2周后腫瘤體積達到50mm³的時候開始給藥，分別給dmso，phpo(30mg/kg)，腹腔注射，隔天給藥。每兩天用游標卡尺測量腫瘤直徑，腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(mm³)＝0.5×長徑(mm)×短徑²(mm³)。每兩天稱量小鼠體重以評價phpo毒性。實驗結束后，所有裸鼠安樂死，并盡快剝除腫瘤測量。結果顯示，phpo可顯著抑制移植瘤小鼠腫瘤的生長，且無明顯毒性。見圖16-18，圖16-17為注射藥物和dmso后不同時間腫瘤組織的變化圖。圖18為對抑制皮下腫瘤a549和ncl-h520生長試驗中，對照組、phpo組治療后腫瘤體積比較比較圖。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。