本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及白介素25在銀屑病的發(fā)育中的作用。更具體地，本發(fā)明涉及試劑在制備藥物中的用途、制劑在制備藥物中的用途、激活免疫細胞的方法、抑制免疫細胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。

背景技術(shù)：

銀屑病俗稱牛皮癬，是一種慢性炎癥性皮膚病，病程較長，有易復發(fā)傾向，有的病例幾乎終生不愈。該病發(fā)病以青壯年為主，對患者的身體健康和精神狀況影響較大。其特征是表皮的過度增殖和真皮的炎癥細胞浸潤，臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑為主，全身均可發(fā)病，以頭皮、四肢伸側(cè)較為常見，多在冬季加重。

然而，目前對于銀屑病仍有待研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。為此，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途、制劑在制備藥物中的用途、激活免疫細胞的方法、抑制免疫細胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。

在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于抑制免疫系統(tǒng)激活，所述試劑選自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，從而抑制免疫系統(tǒng)的激活。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述試劑在制備藥物中的用途還可以具有下列附加技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于治療自身免疫性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療自身免疫性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于治療銀屑病。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療銀屑病的效果。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了制劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于激活免疫系統(tǒng)，所述制劑選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的制劑能夠有效地促進免疫細胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于治療免疫缺陷性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的制劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統(tǒng)，從而起到治療免疫缺陷性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述分泌白介素25的細胞為角質(zhì)形成細胞。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的制劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統(tǒng)。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種激活免疫細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的方法能夠有效地激活免疫細胞。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種抑制免疫細胞激活的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的方法能夠有效地抑制免疫細胞激活。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的方法能夠有效地促進免疫細胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生相應的抗體。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將候選試劑與細胞接觸，所述細胞分泌白介素25；以及確定所述接觸前后，所述細胞的白介素25表達水平，其中，所述接觸后所述白介素25表達升高，是所述候選試劑作為免疫缺陷性疾病藥物的指示；所述接觸后所述白介素25表達降低，是所述候選試劑作為自身免疫性疾病藥物的指示。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的白介素25誘導小鼠皮膚增厚和炎癥的分析示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的銀屑病皮膚炎癥在白介素25敲除的小鼠中的表型分析示意圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的白介素17介導的銀血病發(fā)育過程中起始白介素25表達的分析示意圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的角質(zhì)形成細胞中白介素25的敲除對小鼠銀屑病癥狀影響的分析示意圖；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的白介素25的受體il-17rb在非髓系中的敲除對imq誘導的銀屑病表型影響的分析示意圖；

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的銀屑病25促進皮膚表皮細胞的增殖且調(diào)節(jié)皮膚增殖與炎癥相關(guān)基因的表達的分析示意圖；

圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的接頭蛋白act1和stat3的信號通路對于白介素25誘導角質(zhì)形成細胞增殖影響的分析示意圖；以及

圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的白介素25激活接頭蛋白act1和stat3來發(fā)揮在角質(zhì)形成細胞上的功能的分析示意圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

定義和一般術(shù)語

本發(fā)明意圖涵蓋所有的替代、修改和等同技術(shù)方案，它們均包括在如權(quán)利要求定義的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應認識到，許多與本文所述類似或等同的方法和材料能夠用于實踐本發(fā)明。本發(fā)明絕不限于本文所述的方法和材料。在所結(jié)合的文獻、專利和類似材料的一篇或多篇與本申請不同或相矛盾的情況下(包括但不限于所定義的術(shù)語、術(shù)語應用、所描述的技術(shù)，等等)，以本申請為準。

應進一步認識到，本發(fā)明的某些特征，為清楚可見，在多個獨立的實施方案中進行了描述，但也可以在單個實施例中以組合形式提供。反之，本發(fā)明的各種特征，為簡潔起見，在單個實施方案中進行了描述，但也可以單獨或以任意適合的子組合提供。

除非另外說明，本發(fā)明所使用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解相同的含義。本發(fā)明涉及的所有專利和公開出版物通過引用方式整體并入本發(fā)明。

除非另有說明或者上下文中有明顯的沖突，本文所使用的冠詞“一”、“一個(種)”和“所述”旨在包括“至少一個”或“一個或多個”。因此，本文所使用的這些冠詞是指一個或多于一個(即至少一個)賓語的冠詞。例如，“一組分”指一個或多個組分，即可能有多于一個的組分被考慮在所述實施方案的實施方式中采用或使用。

術(shù)語“含有”為開放式表達，即包括本發(fā)明所指明的內(nèi)容，但并不排除其他方面的內(nèi)容。

術(shù)語“功能類似物”是指具有相似功能的物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)不限定相同，只要具有相同或類似的功能即可。

術(shù)語“激動劑”是指與某生物活性物質(zhì)的受體結(jié)合，呈現(xiàn)該活性物質(zhì)的作用的物質(zhì)或藥品。

術(shù)語“拮抗劑”是指能與受體結(jié)合，但不具備內(nèi)在活性的一類物質(zhì)。拮抗劑分為競爭性拮抗劑和非競爭性拮抗劑。

本發(fā)明所使用的“自身免疫性疾病”是指與體液或細胞介導的對身體自身組分應答相關(guān)的組織損傷的任意疾病的集合。

本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途、制劑在制備藥物中的用途、激活免疫細胞的方法、抑制免疫細胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。下面將分別對其進行詳細描述。

試劑在制備藥物中的用途

在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于抑制免疫系統(tǒng)激活，所述試劑選自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素25能夠激活免疫系統(tǒng)，導致一些自身免疫性疾病的發(fā)生，例如銀屑病。白介素25在銀屑病人的皮膚中以及銀屑病小鼠模型中高表達，在小鼠皮膚中注射白介素25可以直接誘導出類似銀屑病的表型，而類似銀屑病表型在白介素25敲除的銀屑病小鼠模型中有顯著下降。體外實驗證明白介素25對角質(zhì)形成細胞的刺激可以引起多種炎癥細胞因子和趨化因子的高表達，且這種作用是通過stat3的激活實現(xiàn)的。發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，白介素25可以刺激其受體il-17rb的酪氨酸磷酸化，從而招募并且激活stat3來產(chǎn)生下游反應。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素17可以顯著誘導白介素25的表達，而白介素17的缺失使得白介素25的表達不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，推斷出白介素25在銀屑病的發(fā)病過程中作為白介素17的一個重要的下游因子。為此，白介素25拮抗劑或其功能類似物、il-17rb拮抗劑或其功能類似物、stat3拮抗劑或其功能類似物、白介素25表達抑制劑、il-17rb表達抑制劑以及stat3表達抑制劑均能夠有效地抑制炎癥細胞因子和趨化因子的高表達，抑制免疫系統(tǒng)激活，從而可以起到預防或者治療自身免疫性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于治療自身免疫性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療自身免疫性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于治療銀屑病。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療銀屑病的效果。

制劑在制備藥物中的用途

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了制劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于激活免疫系統(tǒng)，所述制劑選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素25能夠激活免疫系統(tǒng)，體外實驗證明白介素25對角質(zhì)形成細胞的刺激可以引起多種細胞因子和趨化因子的高表達，且這種作用是通過stat3的激活實現(xiàn)的。發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，白介素25可以刺激其受體il-17rb的酪氨酸磷酸化，從而招募并且激活stat3來產(chǎn)生下游反應。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素17可以顯著誘導白介素25的表達，而白介素17的缺失使得白介素25的表達不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，推斷出白介素25作為白介素17的一個重要的下游因子。為此，上述制劑能夠有效地促進免疫細胞的高表達，激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物用于治療免疫缺陷性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的制劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統(tǒng)，從而起到治療免疫缺陷性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述分泌白介素25的細胞為角質(zhì)形成細胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細胞是白介素25的主要來源。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的制劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統(tǒng)。

激活免疫細胞的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種激活免疫細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的方法能夠有效地激活免疫細胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，前面針對制劑在制備藥物中的用途所描述的特征和優(yōu)點，同樣適用于該激活免疫細胞的方法，在此不再贅述。

抑制免疫細胞激活的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種抑制免疫細胞激活的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的方法能夠有效地抑制免疫細胞激活。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，前面針對試劑在制備藥物中的用途所描述的特征和優(yōu)點，同樣適用于該抑制免疫細胞激活的方法，在此不再贅述。

疫苗

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的方法能夠有效地促進免疫細胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生相應的抗體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，前面針對制劑在制備藥物中的用途所描述的特征和優(yōu)點，同樣適用于該疫苗，在此不再贅述。

篩選藥物的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將候選試劑與細胞接觸，所述細胞分泌白介素25；以及確定所述接觸前后，所述細胞的白介素25表達水平，其中，所述接觸后所述白介素25表達升高，是所述候選試劑作為免疫缺陷性疾病藥物的指示；所述接觸后所述白介素25表達降低，是所述候選試劑作為自身免疫性疾病藥物的指示。

如前所述，白介素25的高表達能夠促進免疫細胞活化，進而激活免疫系統(tǒng)，起到預防和治療免疫缺陷性疾病的效果；白介素25表達被抑制會抑制免疫細胞活化，進而抑制免疫系統(tǒng)，起到預防和治療自身免疫性疾病的效果。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。

需要說明的是，“細胞分泌白介素25”應作廣義理解，主要是指該細胞能夠分泌白介素25或者具有分泌白介素25的潛能。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所述細胞為角質(zhì)形成細胞。

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

為了研究白介素25在銀屑病中的作用，首先檢測了在銀屑病病人中白介素25的表達。和正常病人的皮膚相比，銀屑病病人皮膚中的白介素25的表達在mrna和蛋白水平都有顯著上升。imq是一種普遍用來在小鼠身上誘導銀屑病表型的一種藥，采用該方法建立了小鼠銀屑病模型，在小鼠皮膚中，白介素25在mrna和蛋白水平均高表達。

為了進一步探索25的作用，采用在皮膚中直接注射白介素25的蛋白。在一段時間的注射之后，皮膚表現(xiàn)出類似銀屑病的特征，包括表皮的過度增殖，真皮炎癥細胞的浸潤。更為重要的是，白介素25的注射顯著地在皮膚中提高了白介素25本身以及其受體的表達，還包括白介素17、白介素17c的表達，而白介素17和17c是已經(jīng)被證實在銀屑病發(fā)育過程中起重要作用的。

以上的數(shù)據(jù)暗示了白介素25在銀屑病的發(fā)育過程中可能的重要作用。為了進一步確證這種作用，在白介素25缺失的小鼠上誘導了imq銀屑病模型，結(jié)果如圖1和圖2所示。圖1中，a：白介素25在正常皮膚和牛皮癬患者中的基因表達；b：白介素25在正常和銀屑病患者皮膚石蠟切片中的免疫熒光染色；c：白介素25在正常和imiquimod處理的小鼠皮膚中mrna水平的表達；d：在正常小鼠皮膚以及imq處理過的小鼠皮膚切片中白介素25的免疫熒光染色；e：分別用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射的c57bl/6小鼠背部皮膚然后進行色；f：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠的耳朵，進行的h&e染色；g：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠耳朵，每天測試小鼠耳朵厚度；h：用pbs或者il-25注射小鼠皮膚后兩組間部分基因的表達變化。實驗結(jié)果重復三次，結(jié)果一致。比例尺在(b)和(d)中代表100μm，在(e)和(f)中代表50μm(放大圖)或100μm(縮小圖)。*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數(shù)據(jù)以平均值正負標注誤的形式來表示。

圖2中，a：野生型小鼠和白介素25基因敲除小鼠分別涂抹imq(咪喹莫特)來誘導銀屑病，持續(xù)3.5天做h&e染色并做表皮與真皮厚度統(tǒng)計。同時，分離真皮細胞并做流式分析髓系細胞比例，即cd45+細胞在各組中的比例(見b)；c：分析真皮髓系細胞同時分析在cd45+細胞中各種類型細胞的比例變化。實驗結(jié)果重復三次,結(jié)果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數(shù)據(jù)以平均值正負標注誤的形式來表示。

結(jié)果表明，這種小鼠的銀屑病表型的嚴重程度要遠遠輕于野生型的誘導了銀屑病模型的小鼠，而且這種小鼠皮膚中免疫細胞的數(shù)量和比例也要遠低于野生型的小鼠。真皮中減少的免疫細胞包括樹突狀細胞、巨噬細胞和γδt細胞。除了中性粒細胞的比例相對于野生型有略微上升，這些細胞的比例和總細胞數(shù)都相對于野生型有較明顯的下降。同時，白介素25的缺失還導致了例如白介素17、22、6、23的mrna表達量下降。

總之，以上數(shù)據(jù)表明白介素25確實在銀屑病的發(fā)生發(fā)育過程中起重要作用。

實施例2

免疫熒光的數(shù)據(jù)證明了白介素25只在銀屑病皮膚的表皮層有表達，暗示了角質(zhì)形成細胞可能是白介素25的主要來源。由于缺乏托樣受體7/8，角質(zhì)形成細胞不能直接對imq做出反應。為了證實白介素25是如何在皮膚中被起始表達的，在體外培養(yǎng)了角質(zhì)形成細胞并用不同的已經(jīng)被證實在銀屑病發(fā)生過程中有作用的因子去刺激這些細胞來檢測白介素25的表達被誘導的情況，這些因子包括白介素17、17c和tnf-α等。結(jié)果如圖3所示。其中a：在體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞并用不同的細胞因子去刺激來檢測白介素25的表達被誘導的情況；b和c：在銀屑病模型中，白介素25的表達在白介素17的缺失小鼠中不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。實驗結(jié)果重復三次，結(jié)果一致。比例尺在(c)中代表100μm，*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數(shù)據(jù)以平均值正負標注誤的形式來表示。

結(jié)果表明，在這些因子當中，只有白介素17可以顯著地誘導白介素25的表達。而白介素17的缺失導致在銀屑病模型中白介素25的表達不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，白介素25可能在銀屑病的發(fā)病過程中作為白介素17的一個重要的下游因子。

實施例3

因為白介素25的表達主要局限于高增生角質(zhì)形成細胞在銀屑病人的損傷皮膚中，從而假設(shè)在角質(zhì)形成細胞中表達的白介素25可促進銀屑病的發(fā)展。圖4表明了角質(zhì)形成細胞中特異性的白介素25敲除使得小鼠中銀屑病癥狀下降。其中，a：野生型小鼠和白介素25特異性皮膚表皮細胞基因敲除小鼠(il-25f/fk5cre)分別涂抹imq(咪喹莫特)來誘導銀屑病，持續(xù)3.5天做h&e染色并做表皮與真皮厚度統(tǒng)計，同時，分離真皮細胞并做流式分析髓系細胞比例，即cd45+細胞在各組中的比例(見圖b)；c：分析真皮髓系細胞同時分析在cd45+細胞中各種類型細胞的比例變化。實驗結(jié)果重復三次,結(jié)果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數(shù)據(jù)以平均值正負標注誤的形式來表示。

白介素25基因(il25)的floxed小鼠與k5cre基因小鼠雜交可在角質(zhì)形成細胞中選擇性去除角質(zhì)形成細胞的il25表達。il25的表達在誘導了銀屑病模型的小il25f/fk5cre小鼠相比imq誘導wt小鼠皮損中明顯降低。類似于il25生殖系基因敲除小鼠，白介素25在角質(zhì)形成細胞中的缺乏大大降低表皮棘細胞增生，真皮厚度和真皮層免疫細胞浸潤。此外，樹突狀細胞(cd45⁺、cd11c⁺)、中性粒細胞(cd45⁺、cd3^-、cd11b⁺、gr1⁺)和δt細胞(cd45⁺、cd3⁺、δt⁺)的數(shù)量和百分比的都降低，但與il25f/fk5cre的銀屑病模型小鼠相比，il25f/f組中，巨噬細胞(cd45+cd3-cd11b+f4/80+)的數(shù)量沒有明顯減少。這些數(shù)據(jù)表明，表皮角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生的白細胞介素25可以作為驅(qū)動的牛皮癬病理發(fā)展的主要來源。

實施例4

白細胞介素25可以通過靶標到白介素受體復合物il17rb和il17ra作用到機體的免疫及非免疫細胞。為了確認白介素25如何通過激活的il17rb的活動，首先用重組白細胞介素25來刺激小鼠角質(zhì)形成細胞。結(jié)果如圖5所示。其中，a：在體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞并用白介素25去刺激來檢測白介素25和其受體il-17rb的表達；b：野生型小鼠和白介素25基因受體敲除小鼠分別涂抹imq(咪喹莫特)來誘導銀屑病，持續(xù)3.5天做h&e染色并做表皮與真皮厚度統(tǒng)計，同時，分離真皮細胞并做流式分析髓系細胞比例，即cd45⁺細胞在各組中的比例(見圖c)；d：分析白介素25受體在白介素25敲除的小鼠的銀屑病模型皮膚的mrna水平的表達。實驗結(jié)果重復三次，結(jié)果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別。p值用t-test來決定，數(shù)據(jù)以平均值正負標注誤的形式來表示。

白細胞介素25的刺激大大增強原發(fā)性角質(zhì)形成細胞中il17rb和il25的表達(圖5a)。接下來，應用il17rb^/-小鼠銀屑病模型，發(fā)現(xiàn)銀屑病病理在imq誘導il17rb^-/-的小鼠中大大減輕(圖5b)。此外，還觀察到il17rb的表達在il25缺陷小鼠的表皮中大大減少(圖5c，5d)。為了進一步評估銀屑病模型中白介素25的靶細胞，進行了骨髓轉(zhuǎn)移實驗，從骨髓細胞分離的wt和il17rb^/-小鼠分別轉(zhuǎn)入受致死劑量照射wt或il17rb^-/-小鼠，8周后，受鼠用imq誘發(fā)銀屑病。il17rb^-/-受體小鼠有明顯緩解的銀屑病樣癥狀，而il17rb^-/-的供體骨髓細胞則無此表型(圖5e)。綜上所述，白介素25調(diào)節(jié)很大程度上是通過靶向非造血細胞來調(diào)節(jié)銀屑病的發(fā)生，且很有可能是通過自分泌的形式。

實施例5

為了確定白介素25中角質(zhì)形成細胞的功能下游因子，用白介素25刺激角質(zhì)形成細胞8小時，然后用rna測序的方法研究白介素25調(diào)節(jié)的基因mrna情況?？傮w上，在白介素25的刺激下，8,449種基因表達上調(diào)，7,272種基因表達下調(diào)。白細胞介素-25誘導的基因中，其中有大量的趨化因子和細胞因子可以吸引或誘導各種銀屑病相關(guān)免疫細胞到皮膚中，包括ccl2可以招募單核細胞、t細胞和樹突狀細胞，ccl7可以招募單核細胞、單核細胞和t細胞，cx3cl1和csf3可刺激粒系造血細胞。此外，許多白細胞介素25誘導的基因曾被報道可調(diào)控細胞增殖和細胞周期進程，包括ccl2，fn1。

因此，白介素25可能通過調(diào)節(jié)細胞增殖和誘導炎癥基因來促進銀屑病發(fā)展。為了做進一步的證實，用白細胞介素25在體外刺激角質(zhì)形成細胞。具體地，從小鼠中分離培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞并用白介素25刺激8h，以培養(yǎng)基作為對照，提取rna做表達譜測序檢測。結(jié)果如圖6所示。其中，a：對白介素25調(diào)節(jié)的差異表達基因信號通路的分析；b：白介素25調(diào)節(jié)的基因的散點圖；c：原代角質(zhì)形成細胞用白介素25或是培養(yǎng)基刺激在不同濃度和時間點計算細胞數(shù)變化；e：培養(yǎng)小鼠皮膚角質(zhì)細胞并用白介素25去刺激，48h后染ki67去看細胞增殖狀態(tài)；f：培養(yǎng)小鼠皮膚角質(zhì)細胞用白介素25去刺激，24h后染dapi看細胞周期變化；g：在野生型和白介素25缺失的小鼠皮膚中做ki67的免疫熒光染色(10x)；比例尺代表50μm；*p<0.05。**p<0.01；n.s.，沒有差別。p值用t-test來決定。數(shù)據(jù)以平均值正負標注誤的形式來表示。

發(fā)現(xiàn)白介素25在較后的時間點(圖6d)以劑量依賴的方式(圖6c)促進促進細胞增殖提高細胞數(shù)量。同樣地，白介素25也提高了增殖標記ki67的表達比例(圖6e)，且有更多的細胞進入活躍細胞周期(s和g2/m期)(圖6f)。相反，il25缺失大大減少誘導銀屑病的小鼠皮膚表皮層組化染色的ki67的比例和數(shù)量(圖6g和圖6a)，進一步表明白介素25在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞在銀屑病發(fā)病中的增殖的必不可少的作用。

實施例6

在此將研究白介素25介導角質(zhì)形成細胞增殖和炎癥因子產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導機制。此前已知act1作為接頭蛋白，介導白細胞介素25信號通路，我們比較了wt和act1/-小鼠角質(zhì)形成細胞中幾種白介素25介導的相關(guān)基因表達與細胞增殖或或與炎癥反應有關(guān)的基因。結(jié)果如圖7所示。其中，a：在野生型和act1缺失的角質(zhì)形成細胞中用白介素25刺激或是不刺激8h，觀察由rnaseq挑選出的基因的表達誘導情況；b：在野生型和act1缺失的角質(zhì)形成細胞中，用白介素25刺激或是不刺激24h去看細胞增殖標記ki67(左)以及細胞周期(右)變化；c：角質(zhì)形成細胞用白介素25刺激或者24小時，觀察stat3在兩組中的磷酸化情況；d：磷酸化stat3(p-stat3)在用pbs或是經(jīng)過白介素25注射誘導16天后的皮膚中的免疫組化；e：角質(zhì)形成細胞用白介素25刺激或者不刺激24h，在stat3磷酸化抑制劑或者白介素6抗體處理或是不處理的情況下的ki67和細胞周期分析；f：角質(zhì)形成細胞用白介素25刺激或是不刺激或是加上stat3的磷酸酶抑制劑之后并處理8h之后，觀察挑選出來的rnaseq相關(guān)基因的表達變化。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別。p值用t-test來決定。數(shù)據(jù)以平均值正負標注誤的形式來表示。

act1的缺失會使白介素25的刺激作用消失。此外，正如所預測的那樣，被白介素25誘導的角質(zhì)形成細胞增殖依賴于act1(圖7b)。

stat3是眾所周知的在不同細胞中控制細胞周期和細胞增殖的因子，其中包括角質(zhì)形成細胞，并已被證明能夠參與銀屑病樣皮膚炎癥。為了確定白介素25是否可以調(diào)節(jié)通過活化stat3來調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞增殖，我們測試了角質(zhì)形成細胞在白介素25的刺激下stat3的磷酸化。結(jié)果表明，白介素25的刺激在24個小時導致了明顯的stat3磷酸化(圖7c)。同樣地，皮膚注射白細胞介素25也誘導明顯stat3磷酸化(圖7d)。此外，阻斷stat3激活的stat3的抑制劑sttatic顯著減少白細胞介素25誘導的角質(zhì)形成細胞增殖和細胞周期變化，且這個過程是獨立于白細胞介素6的作用的(圖7e)。我們還發(fā)現(xiàn)與角質(zhì)形成細胞增殖相關(guān)的基因表達或與招募炎癥細胞相關(guān)的基因中，如ccl2、ccl7和csf3，取決于stat3的激活，而其他的基因，如naip5和dclre1c，則獨立的stat3激活(圖7f)。總之，act1和stat3信號對于白介素25誘導角質(zhì)形成細胞增殖和細胞因子和趨化因子的表達是非常必要的。

實施例7

上述的數(shù)據(jù)表明，白介素25對角質(zhì)形成細胞的有絲分裂影響依賴stat3激活但獨立白細胞介素6介導的信號(圖7e和7f)，由此，預測白介素25可以直接激活stat3。為了檢驗這種可能性，用白介素25體外刺激角質(zhì)形成細胞，在較短的時間內(nèi)進行stat3激活的檢測以排除這種作用是二級作用。圖8表明了白介素25可激活接頭蛋白act1和stat3來發(fā)揮在角質(zhì)形成細胞上的功能。其中，a：用白介素25刺激從野生型和act1缺失的乳鼠中分離的原代角質(zhì)形成細胞細胞，在不同時間點收集細胞做免疫印跡實驗，研究p-stat3和stat3的蛋白表達；b：野生型角質(zhì)形成細胞用白介素25刺激，在白介素6中和抗體或是jak1/2抑制劑處理或者不處理情況下研究p-stat3和stat3的表達；c：在293t細胞中過表達ha標簽的白介素25受體il-17rb和stat3或是空質(zhì)粒和stat3，收集細胞裂解，免疫共沉淀il-17rb，接著免疫印跡stat3和ha標簽；d：在293t細胞中過表達ha標簽的白介素25受體il-17rb，不同的時間點用白介素25刺激，收集細胞免疫共沉淀ha標簽蛋白，免疫印跡酪氨酸磷酸化抗體和ha標簽抗體；e：培養(yǎng)小鼠原代角質(zhì)形成細胞用白介素25刺激一小時，用受體白介素25的另一受體il-17ra進行免疫共沉淀，免疫印跡il-17ra和stat3。

與功能檢測(圖7e)結(jié)果一致，白介素25在10分鐘后誘導明顯stat3磷酸化，且這個過程依賴于act1，但是獨立于白細胞介素6。并且，與報道的一樣，這種作用在jak1/2抑制劑處理下完全消失(圖8a、8b)。這一結(jié)果表明stat3可能被白介素25直接激活。接下來我們在293t細胞中用ha標記的il-17rb檢驗了stat3是否能與il-17rb直接相互作用。意外發(fā)現(xiàn)，在免疫沉淀后的含il-17rb的蛋白復合物中檢測到stat3(圖8c)。此外，白介素25能在10分鐘后誘導il17rb上的酪氨酸磷酸化(圖8d)。因為白介素25是通過結(jié)合到il-17ra/il-17rb復合物受體來進行下游信號轉(zhuǎn)導，我們研究在小鼠角質(zhì)形成細胞中白細胞介素25的刺激是否能促進il-17ra/rb復合物與stat3的相互作用。內(nèi)源性白細胞介素-17ra被發(fā)現(xiàn)與stat3基因共同沉淀(圖8e)。綜上所述，研究結(jié)果為白介素25在角質(zhì)形成細胞中可以直接激活stat3的磷酸化的提供了實驗證據(jù)。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

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