本發(fā)明屬于桐花樹(shù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物及其制備和治療前列腺癌的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桐花樹(shù)(aegicerascorniculatum(linn.)blanco)是紫金?？苖yrsinaceae桐花樹(shù)屬aegiceras的紅樹(shù)植物，生于海邊灘涂，分布于我國(guó)海南、福建、廣東、廣西、浙江、香港、澳門(mén)等地，印度、中南半島至菲律賓及澳大利亞南部等地也均有產(chǎn)。傳統(tǒng)應(yīng)用上，將桐花樹(shù)的樹(shù)皮和樹(shù)葉熬汁治療哮喘、糖尿病和風(fēng)濕等疾病，而現(xiàn)代藥理研究表明桐花樹(shù)具有明顯抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、細(xì)胞毒性等藥理活性。桐花樹(shù)藥理活性相關(guān)的報(bào)道中，多以其樹(shù)皮和枝為研究點(diǎn)，以莖為研究點(diǎn)的較少；對(duì)于其抗腫瘤研究多集中在果和樹(shù)皮的甲醇提取物上，目前尚未有桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物抗腫瘤研究的報(bào)道。

腫瘤是指異常細(xì)胞在人體內(nèi)不受控制的生長(zhǎng)，已成為全球性危害健康的重大問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織的一份報(bào)告顯示，到2020年，新生癌癥病例將達(dá)到1500萬(wàn)例，到2030年，全球每年將有1320萬(wàn)人因癌癥死亡。前列腺癌(prostatecancer，pca)是西方發(fā)達(dá)地區(qū)老年男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家前列腺癌每年的發(fā)病率已超過(guò)肺癌，躍居腫瘤發(fā)病率榜首。雖然我國(guó)前列腺癌發(fā)病率及死亡率較低，但近年來(lái)其發(fā)病率成快速上升的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)前列腺癌將超越膀胱癌成為我國(guó)男性泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的腫瘤。目前治療前列腺癌的醫(yī)療方式主要以西醫(yī)為主，但副作用較大，大大降低了患者的生存質(zhì)量，而作為輔助治療方式的中醫(yī)藥因發(fā)揮了很好的輔助治療作用受到了越來(lái)越多的關(guān)注。因此，從中醫(yī)藥中尋求新型、安全有效的的治療藥物是目前治療前列腺癌的重要研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物及其制備和治療前列腺癌的應(yīng)用，以擴(kuò)大桐花樹(shù)的使用范圍，為癌癥治療開(kāi)辟新途徑。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物在制備治療前列腺癌藥物方面的應(yīng)用。

藥物為膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膏劑、合劑、混懸劑，該藥物以桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位為活性成分，加入常規(guī)輔料按照常規(guī)工藝制成。

前列腺癌源于人前列腺癌細(xì)胞pc3、du145。

桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物的制備方法，將桐花樹(shù)莖加入乙醇浸泡得到桐花樹(shù)葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，獲取上層乙酸乙酯部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。

上述桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物的制備方法，按以下操作進(jìn)行：將桐花樹(shù)莖曬干打成粗粉，加入25倍量95％乙醇浸泡7天；通過(guò)減壓濃縮得到桐花樹(shù)莖乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無(wú)乙醇味后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，將下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，得到上層乙酸乙酯部位提取物，將上層乙酸乙酯部位提取物水浴干燥，即得桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物。

上述制備方法得到的桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物。

為充分開(kāi)發(fā)桐花樹(shù)資源，發(fā)明人建立了一種桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物的制備方法，將桐花樹(shù)莖加入乙醇浸泡得到桐花樹(shù)葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，獲取上層乙酸乙酯部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞pc3、du145具有增殖抑制作用，并可明顯抑制人前列腺癌細(xì)胞pc3、du145的克隆形成。因此，桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物在制備治療前列腺癌藥物方面具有潛在應(yīng)用前景，可用于制備抗前列腺癌藥物。深入開(kāi)發(fā)桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物可以擴(kuò)大桐花樹(shù)的使用范圍，為癌癥治療開(kāi)辟新途徑。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖抑制作用的結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞活性影響的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞活性影響的結(jié)果柱狀圖。

具體實(shí)施方式

一、桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位提取物(eacs)的制備

1.藥材：桐花樹(shù)莖采于廣西防城港，經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本鑒定為金?？葡灎T果屬植物桐花樹(shù)的莖。

2.提取與分離：將桐花樹(shù)莖曬干打成粗粉(2500g)，加入25倍量(62.5l)95％乙醇浸泡7天；通過(guò)減壓濃縮得到桐花樹(shù)莖乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無(wú)乙醇味后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，將下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，得到上層乙酸乙酯部位提取物，將上層乙酸乙酯部位提取物水浴干燥，即得桐花樹(shù)莖乙酸乙酯提取物。

二、桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用研究

1.實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株——人前列腺癌細(xì)胞du145和pc3由廣西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供。

藥材——桐花樹(shù)莖

主要試劑和耗材——

主要試劑——

細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(mts)：美國(guó)promega公司；

結(jié)晶紫染色液：中國(guó)碧云天公司；

1640培養(yǎng)液：維森特公司

胎牛血清：美國(guó)gibco公司

氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、水合氯醛等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

主要耗材——

25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶：美國(guó)bd公司；

10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿：美國(guó)bd公司；

96孔板：美國(guó)bd公司；

15毫升離心管、50毫升離心管：美國(guó)bd公司；

凍存管：美國(guó)bd公司；

移液管：美國(guó)corning公司；

槍頭盒、ep管、pcr管：美國(guó)axygen公司；

主要儀器——

電動(dòng)移液器、可調(diào)式移液器、低溫高速離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司生產(chǎn)；

細(xì)胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、液氮罐：美國(guó)thermo科學(xué)公司；

-80℃生物超低溫冰箱：美國(guó)thermo科學(xué)公司；

超凈工作臺(tái)：蘇州金凈公司；

37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱、烤箱：中國(guó)精宏公司；

倒置熒光顯微鏡：日本olympus公司；

掌上離心機(jī)：美國(guó)thermofisherscientific公司；

高壓滅菌鍋、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱：中國(guó)海爾公司；

碎冰制冰機(jī)：日本sanyo公司；

計(jì)算機(jī)：中國(guó)聯(lián)想公司；

nanodrop2000分光光度計(jì)：美國(guó)thermoscientific公司；

電磁攪拌器、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)thermoscientific公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(mts)

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入dpbs清洗細(xì)胞，棄掉dpbs后加入0.25％胰酶進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞欲脫離瓶壁時(shí)加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吸取培養(yǎng)液將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放入離心機(jī)中離心，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基重懸、混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞重懸后調(diào)整密度為2×10⁴個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，即每個(gè)孔2000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，共設(shè)5個(gè)給藥梯度組(50，75，100，150，200μg/ml)，以及培養(yǎng)液對(duì)照組、dmso對(duì)照組。置于37℃，5％co2恒溫孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

(2)配置待測(cè)藥物母液：用分析天平稱(chēng)取待測(cè)藥物溶于dmso中配成100mg/ml的母液，設(shè)置超聲儀水浴溫度60℃，超聲溶解，并用0.22μm尼龍過(guò)濾篩過(guò)濾后分裝于ep管，保存于-20℃。

(3)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，每組細(xì)胞分別加入不同濃度梯度的桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位提取物(50，75，100，150，200μg/ml)，對(duì)照組加入等體積的含對(duì)應(yīng)濃度dmso的完全培養(yǎng)基，以及單獨(dú)只含完全培養(yǎng)基的對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。

(4)分別在培養(yǎng)24、48、72h后，用排槍于每孔加入20μl完全融化后的celltiter96aqueousonesolutionreagent，然后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，于酶標(biāo)儀上在490nm波光處處讀取吸光度值。將無(wú)細(xì)胞僅含培養(yǎng)基的孔作為空白孔扣除由于藥物顏色產(chǎn)生的誤差。并用軟件計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，其公式為：

(5)以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用spss21檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性；并用graphpadprism5作線(xiàn)性圖，求出ic50。

2.2單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞常規(guī)消化，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到15ml離心管，置于離心機(jī)離心。棄掉上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻，盡量使細(xì)胞充分分散，使分散度達(dá)到95％以上。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為400個(gè)/ml，每孔接種1ml于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。

(2)第二天加入桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位提取物進(jìn)行處理，設(shè)兩個(gè)藥物濃度，分別為12.5，25μg/ml，另設(shè)一個(gè)空白組(完全培養(yǎng)液)。

(3)細(xì)胞經(jīng)藥物作用4天后，棄掉培養(yǎng)液，重新給予同樣的藥物。

(4)當(dāng)有細(xì)胞團(tuán)交合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，加dpbs緩沖液清洗兩次，然后用4％的多聚甲醛固定15min。

(5)吸棄多聚甲醛，用結(jié)晶紫染色液染色35min。

(6)回收結(jié)晶紫，用dpbs緩沖液清洗細(xì)胞兩次，棄掉dpbs緩沖液，待孔板晾干后，用掃描儀掃描六孔板。

(7)用spss21檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次的結(jié)果，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性，并用graphpadprism5作柱狀圖；

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)軟件處理分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行組間比較，*，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**，p＜0.01差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞du145和pc3的增殖具有抑制作用。其ic50如表1所示，細(xì)胞活性曲線(xiàn)如圖1所示。

表1桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位提取物作用于前列腺癌細(xì)胞的ic50(μg/ml)

3.2單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

桐花樹(shù)莖乙酸乙酯部位提取物可明顯抑制人前列腺癌細(xì)胞du145和pc3的克隆形成，并與給藥濃度呈濃度依賴(lài)性。du145細(xì)胞的對(duì)照組克隆形成率為41.50％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為10.25％、28.75％；pc3細(xì)胞的對(duì)照組克隆形成率為39.25％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為7.130％、39.00％。細(xì)胞克隆形成數(shù)如圖2和圖3所示。