本發(fā)明屬于桐花樹技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種桐花樹葉石油醚提取物及其制備和治療結(jié)腸癌的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桐花樹(aegicerascorniculatum)為紫金?？葡灎T果屬植物，是紅樹植物中分布很廣的一種植物，生長于海邊潮漲潮落的污泥灘上。目前研究顯示其化學(xué)成分主要含有萜類、甾體、黃酮、多酚等，藥理作用主要有細(xì)胞毒性，抗真菌、止瀉、抗氧化等。由于植物化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性，即使是同一種植物，其不同藥用部位的功效及其所含化學(xué)成分也會存在很大差異，如麻黃和麻黃根，麻黃主要含麻黃堿和偽麻黃堿，而麻黃根則主要為大環(huán)精胺類生物堿。而對于桐花樹的研究，多見于桐花樹莖、枝和皮，且多關(guān)注于其乙醇、水提部位，對桐花樹葉石油醚部位抗癌的研究尚未見有報道。

隨著發(fā)病率以及死亡率的上升，惡性腫瘤已成為中國城市和農(nóng)村居民的第1位死亡原因。結(jié)腸癌屬于大腸癌，是消化系統(tǒng)惡性腫瘤。在我國發(fā)病率及病死率較高。近年來，城市人口結(jié)腸癌發(fā)病率比10年前上升1/3，農(nóng)村上升9％。早期診斷率只有11％～15％，80％以上患者確診時已屬中晚期，如能早期發(fā)現(xiàn)、治療，術(shù)后5年生存率可達(dá)90％以上，而晚期結(jié)腸癌五年生存率低于20％。由于癌癥多重復(fù)雜的病機，日益發(fā)達(dá)的醫(yī)療技術(shù)仍未能解決這一醫(yī)學(xué)難題。目前治療癌癥主要采用手術(shù)、放療、化療以及三者聯(lián)合治療等方案，但其毒副作用較大，且易引起腫瘤變異及耐藥性的產(chǎn)生。中醫(yī)藥在提高患者生存質(zhì)量，減輕臨床癥狀，延長生存期等方面顯示出了一定的優(yōu)勢。近年來研究表明，傳統(tǒng)中醫(yī)藥作為結(jié)腸癌手術(shù)及放化療的輔助治療手段，在提高患者生存質(zhì)量，減輕臨床癥狀，延長生存期等方面顯示出了一定的優(yōu)勢。如扶正抗癌方與化療藥或免疫療法聯(lián)用都能起到協(xié)同增效的作用，不僅可以減輕毒副作用，降低復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，還能增強癌細(xì)胞對放化療的敏感性，提高結(jié)腸癌患者體力指數(shù)。因此，從中醫(yī)藥中尋求新型、安全有效的的治療藥物是目前治療結(jié)腸癌的重要研究方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種桐花樹葉石油醚提取物及其制備和治療結(jié)腸癌的應(yīng)用，以擴大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

桐花樹葉石油醚提取物在制備治療結(jié)腸癌藥物方面的應(yīng)用。

藥物為膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膏劑、合劑、混懸劑，該藥物以桐花樹葉石油醚部位為活性成分，加入常規(guī)輔料按照常規(guī)工藝制成。

結(jié)腸癌源于人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29、sw480、dld-1。

桐花樹葉石油醚提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進行萃取獲取上層石油醚部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。

上述桐花樹葉石油醚提取物的制備方法，按以下操作進行：將桐花樹葉曬干打成粗粉，加入25倍量95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進行萃取，獲取上層石油醚部位提取物，將上層石油醚部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉石油醚提取物。

上述制備方法得到的桐花樹葉石油醚提取物。

為充分開發(fā)桐花樹資源，發(fā)明人建立了一種桐花樹葉石油醚提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進行萃取獲取上層石油醚部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。體外分子生物學(xué)實驗研究表明，桐花樹葉石油醚提取物對人結(jié)腸癌ht-29、sw480、dld-1細(xì)胞具有增殖抑制作用，并可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29、sw480、dld-1的克隆形成。因此，桐花樹葉石油醚提取物在制備治療結(jié)腸癌藥物方面具有潛在應(yīng)用前景，可用于制備抗結(jié)腸癌藥物。深入開發(fā)桐花樹葉石油醚提取物可以擴大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明桐花樹葉石油醚提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明桐花樹葉石油醚提取物對結(jié)腸細(xì)胞活性影響的平板克隆形成實驗結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明桐花樹葉石油醚提取物對結(jié)腸細(xì)胞活性影響的結(jié)果柱狀圖。

具體實施方式

一、桐花樹葉石油醚部位提取物(pacl)的制備

1.藥材：桐花樹葉采于廣西防城港，經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本鑒定為金?？葡灎T果屬植物桐花樹的葉子。

2.提取與分離：將桐花樹葉曬干打成粗粉(2500g)，加入25倍量(62.5l)95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，加熱揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進行萃取，獲取上層石油醚部位提取物，將上層石油醚部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉石油醚提取物。

二、桐花樹葉石油醚部位提取物對多種癌細(xì)胞的增殖抑制作用研究

1.實驗材料

細(xì)胞株——人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29，sw480，dld-1，由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

藥材——桐花樹葉

主要試劑和耗材——

主要試劑——

細(xì)胞增殖檢測試劑盒(mts)：美國promega公司；

結(jié)晶紫染色液：中國碧云天公司；

1640培養(yǎng)液：維森特公司

胎牛血清：美國gibco公司

氯仿、異丙醇、無水乙醇、水合氯醛等為國產(chǎn)分析純試劑。

主要耗材——

25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶：美國bd公司；

10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿：美國bd公司；

96孔板：美國bd公司；

15毫升離心管、50毫升離心管：美國bd公司；

凍存管：美國bd公司；

移液管：美國corning公司；

槍頭盒、ep管、pcr管：美國axygen公司；

主要儀器——

電動移液器、可調(diào)式移液器、低溫高速離心機：德國eppendorf公司生產(chǎn)；

細(xì)胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、液氮罐：美國thermo科學(xué)公司；

-80℃生物超低溫冰箱：美國thermo科學(xué)公司；

超凈工作臺：蘇州金凈公司；

37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱、烤箱：中國精宏公司；

倒置熒光顯微鏡：日本olympus公司；

掌上離心機：美國thermofisherscientific公司；

高壓滅菌鍋、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱：中國海爾公司；

碎冰制冰機：日本sanyo公司；

計算機：中國聯(lián)想公司；

nanodrop2000分光光度計：美國thermoscientific公司；

電磁攪拌器、酶聯(lián)免疫檢測儀：美國thermoscientific公司。

2.實驗方法

2.1細(xì)胞增殖實驗(mts)

(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入dpbs清洗細(xì)胞，棄掉dpbs后加入0.25％胰酶進行消化，當(dāng)細(xì)胞欲脫離瓶壁時加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吸取培養(yǎng)液將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放入離心機中離心，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基重懸、混勻，進行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞重懸后調(diào)整密度為2×10⁴個/ml，接種于96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，即每個孔2000個細(xì)胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔，共設(shè)5個給藥梯度組(37.5，50，75，100，150μg/ml)，以及培養(yǎng)液對照組、dmso對照組。置于37℃，5％co2恒溫孵箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

(2)配置待測藥物母液：用分析天平稱取待測藥物溶于dmso中配成100mg/ml的母液，設(shè)置超聲儀水浴溫度60℃，超聲溶解，并用0.22μm尼龍過濾篩過濾后分裝于ep管，保存于-20℃。

(3)細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，每組細(xì)胞分別加入不同濃度梯度的桐花樹葉石油醚部位提取物(37.5，50，75，100，150μg/ml)，對照組加入等體積的含對應(yīng)濃度dmso的完全培養(yǎng)基，以及單獨只含完全培養(yǎng)基的對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。

(4)分別在培養(yǎng)24、48、72h后，用排槍于每孔加入20μl完全融化后的celltiter96aqueousonesolutionreagent，然后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，于酶標(biāo)儀上在490nm波光處處讀取吸光度值。將無細(xì)胞僅含培養(yǎng)基的孔作為空白孔扣除由于藥物顏色產(chǎn)生的誤差。并用軟件計算細(xì)胞生長抑制率，其公式為：

(5)以上實驗重復(fù)3次，用spss21檢驗統(tǒng)計分析，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性；并用graphpadprism5作線性圖，求出ic50。

2.2單細(xì)胞克隆形成實驗

(1)將對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)消化，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到15ml離心管，置于離心機離心。棄掉上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻，盡量使細(xì)胞充分分散，使分散度達(dá)到95％以上。進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為400個/ml，每孔接種1ml于6孔板中，培養(yǎng)過夜。

(2)第二天加入桐花樹葉石油醚部位提取物進行處理，設(shè)兩個藥物濃度，分別為12.5，25μg/ml，另設(shè)一個空白組(完全培養(yǎng)液)。

(3)細(xì)胞經(jīng)藥物作用4天后，棄掉培養(yǎng)液，重新給予同樣的藥物。

(4)當(dāng)有細(xì)胞團交合時，棄掉培養(yǎng)液，加dpbs緩沖液清洗兩次，然后用4％的多聚甲醛固定15min。

(5)吸棄多聚甲醛，用結(jié)晶紫染色液染色35min。

(6)回收結(jié)晶紫，用dpbs緩沖液清洗細(xì)胞兩次，棄掉dpbs緩沖液，待孔板晾干后，用掃描儀掃描六孔板。

(7)用spss21檢驗統(tǒng)計分析本實驗重復(fù)三次的結(jié)果，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性，并用graphpadprism5作柱狀圖；

2.3統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用spss統(tǒng)計軟件處理分析數(shù)據(jù)，進行組間比較，*，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，**，p＜0.01差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

3.實驗結(jié)果

3.1細(xì)胞增殖實驗結(jié)果

桐花樹葉石油醚部位提取物對人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29，sw480，dld-1的增殖具有抑制作用。其ic50如表1所示，細(xì)胞活性曲線如圖1所示。

表1桐花樹葉石油醚部位提取物作用于癌細(xì)胞的ic50(μg/ml)

3.2單細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果

桐花樹葉石油醚部位提取物可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29，sw480，dld-1的克隆形成，并與給藥濃度呈濃度依賴性。ht-29細(xì)胞的對照組克隆形成率為86.50％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為18.13％、81.25％；dld-1細(xì)胞的對照組克隆形成率為75.13％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為2.50％、33.75％；sw480細(xì)胞的對照組克隆形成率為100％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為13.75％、56.75％。細(xì)胞克隆形成數(shù)如圖2和圖3所示。