本發(fā)明屬于聯(lián)合藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是一個(gè)全球性的健康問題，已位居世界男性最常見的癌癥的第二位，占男性癌癥的。前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見腫瘤之一近年來，隨著人口老齡化、生活水平及診斷技術(shù)的提高我國(guó)的發(fā)病率呈顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)。目前治療前列腺癌的方法主要包括根治性手術(shù)切除、放射治療、內(nèi)分泌治療和化學(xué)治療，但是，采用單藥治療時(shí)，雖然增加劑量可以提高療效，但隨之而來的是毒副作用的增加。并且治療時(shí)具有組織浸潤(rùn)性強(qiáng)、易于早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)臨床診斷時(shí)大多數(shù)患者已經(jīng)處于進(jìn)展期出現(xiàn)局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移手術(shù)效果不理想或者失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。多西他賽是紫杉醇類抗腫瘤藥，通過干擾細(xì)胞有絲分裂和分裂間期細(xì)胞功能所必需的微管網(wǎng)絡(luò)而起抗腫瘤作用，主要用于先期化療失敗的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌、使用以順鉑為主的化療失敗的晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌等的治療，它可通過加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，使細(xì)胞形成穩(wěn)定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，并阻滯細(xì)胞于g2/m期，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。但是經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽在進(jìn)行a和p微管蛋白的過度表達(dá)、微管蛋白的突變和微管蛋白翻譯后的修飾可以拮抗紫杉醇的微管穩(wěn)定作用，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，并能對(duì)抗紫杉醇誘導(dǎo)的聚合，降低微管聚合率，從而導(dǎo)致耐藥。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物。該藥物組合物通過將簕菜中兩個(gè)三萜化合物分別和多西他賽進(jìn)行聯(lián)合用藥，以前列腺中的vcap細(xì)胞作為研究對(duì)象，該藥物組合物對(duì)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生存率，細(xì)胞凋亡形態(tài)，細(xì)胞遷移程度等具有顯著的抑制作用，并且對(duì)可能引起抑制nf-κb通路轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行檢測(cè)等具有顯著的抑制作用。本發(fā)明另一目的在于提供上述協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，該藥物包含活性成分和藥物學(xué)上可接受的輔料，其特征在于，所述的活性成分包含多西他賽和三萜化合物，所述三萜化合物為3α，11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸或3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸。優(yōu)選地，所述的三萜化合物和多西他賽的摩爾比為(5000～45000)∶(0.8～3)。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的三萜化合物和多西他賽的摩爾比為(6500～30000)∶(0.9～2.5)。更為優(yōu)選地，所述的三萜化合物和多西他賽的摩爾比為10000∶1。優(yōu)選地，所述的抗前列腺癌的藥物組合物為口服制劑。更為優(yōu)選地，所述的口服制劑為膠囊劑、片劑、顆粒劑或液劑。上所述藥物組合物在制備抗癌細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述癌細(xì)胞為前列腺癌細(xì)胞。本發(fā)明的藥物組合物依靠所述的三萜化合物和多西他賽作為活性成分發(fā)揮抗前列腺癌的協(xié)同作用，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)對(duì)這三種組分的用量比進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述三萜化合物和多西他賽的摩爾比為(5000～45000)∶(0.8～3)的范圍內(nèi)時(shí)，其抗前列腺癌的增值效果較好，為降低多西他賽的毒副作用以及耐藥性，本發(fā)明減少了該藥物的用量，因此在本發(fā)明最優(yōu)選的體外實(shí)施例中，三萜化合物與多西他賽的摩爾比為10000∶1。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述抗抗前列腺癌的藥物組合物中含有的三萜化合物和多西他賽均可以通過腸道以較快的速度吸收并發(fā)揮生物活性，因此本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為口服制劑。藥物單位制劑可以是常規(guī)的制劑工藝制成的藥物學(xué)上可接受的任意常規(guī)口服制劑，如膠囊劑、片劑、顆粒劑或液劑，為使上述制劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備的過程中加入藥學(xué)上可接受的輔料，所述藥物學(xué)上可接受的輔料為填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助懸劑、粘合劑或甜味劑。在本發(fā)明的實(shí)施例中用到填充劑為淀粉、乳糖、微晶纖維素或蔗糖中的一種，也可以使用上述填充劑的任意混合物；使用的崩解劑為淀粉、羧甲基淀粉鈉或預(yù)膠化淀粉中的一種，也可使用其他已知的崩解劑如低取代羥丙纖維素或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，還可以使用上述崩解劑的任意混合物，使用的潤(rùn)滑劑為硬脂酸鎂或二氧化硅，也可使用其他已知的中的潤(rùn)滑劑如十二烷基硫酸鈉，還可以使用上述潤(rùn)滑劑的任意混合物；所述助懸劑為聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或羥丙基甲基纖維素中的一種以上；所述粘合劑為羥丙基甲基纖維素、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮中的一種以上；所述甜味劑為糖精鈉、甘草次酸、蔗糖、阿斯帕坦或甜蜜素中的一種以上。本發(fā)明三萜化合物是簕菜的分離提取物。簕菜，學(xué)名為白簕(acanthopanaxtrifoliatus(linn.)merr.)，又稱鵝掌簕、三葉五加、三加皮、苦刺、刺三加，為五加科(araliaceae)五加屬(acanthopanax)的一種攀援狀灌木。簕菜是藥食同源植物，我國(guó)資料對(duì)其早有記載，李時(shí)珍曰：“五加治風(fēng)濕瘓庫，壯筋骨，其功良深”；明代《食物本草》中記載“五加，葉作蔬食，去皮膚風(fēng)濕”。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的基礎(chǔ)研究從簕菜中分離到兩個(gè)三萜類化合物3α，11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸和3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸，如圖1所示，并且對(duì)其進(jìn)行了基礎(chǔ)活性的測(cè)試，結(jié)果表明，此類化合物具有抗腫瘤，抗炎，抑制ɑ-葡萄糖苷酶(專利cn104922173a)等作用。本發(fā)明以前列腺中的vcap細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過將這兩個(gè)三萜化合物分別和多西他賽進(jìn)行聯(lián)合用藥，對(duì)vcap細(xì)胞進(jìn)行體外抗癌活性測(cè)試。結(jié)果表明，簕菜中兩個(gè)三萜類化合物和多西他賽的聯(lián)合使用對(duì)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生存率有非常明顯的效果，很大程度上降低其生存率，使vcap細(xì)胞的細(xì)胞凋亡形態(tài)發(fā)生強(qiáng)烈的變化，并且使細(xì)胞遷移程度的速率顯著降低，顯示出聯(lián)合用藥對(duì)于前列腺癌vcap細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞的生長(zhǎng)，增值等抑制作用。本發(fā)明還對(duì)可能引起抑制nf-κb通路轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行測(cè)定，有望成為較為安全可靠的新型治療前列腺癌的候選藥物。其與傳統(tǒng)的單藥治療相比具有多種優(yōu)點(diǎn)，如可以同時(shí)靶向多種重要信號(hào)通路、克服腫瘤耐藥、降低毒副作用等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1.本發(fā)明以前列腺中的vcap細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過將這兩個(gè)三萜化合物分別和多西他賽進(jìn)行聯(lián)合用藥，對(duì)vcap細(xì)胞進(jìn)行體外抗癌活性測(cè)試。結(jié)果表明，三萜類化合物和多西他賽的聯(lián)合使用對(duì)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生存率有非常明顯的效果，很大程度上降低其生存率，使vcap細(xì)胞的細(xì)胞凋亡形態(tài)發(fā)生強(qiáng)烈的變化，并且使細(xì)胞遷移程度的速率顯著降低，顯示出聯(lián)合用藥對(duì)于前列腺癌vcap細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞的生長(zhǎng)和增值抑制作用。本發(fā)明還對(duì)可能引起抑制nf-κb通路轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行測(cè)定，有望成為較為安全可靠的新型治療前列腺癌的候選藥物。2.本發(fā)明通過將簕菜中的兩個(gè)活性較強(qiáng)的三萜類化合物分別與抗前列腺癌一線臨床藥物多西他賽進(jìn)行聯(lián)合用藥。由于其兩個(gè)三萜類化合物能增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性和減少其耐藥性。兩者聯(lián)合用藥產(chǎn)生了協(xié)同作用，不僅提供更多用藥安全性，而且降低了多西他賽的臨床使用劑量，減少大劑量使用多西他賽所產(chǎn)生的毒副作用，提高臨床治療安全指數(shù)，為多西他賽臨床應(yīng)用提供了更多的可能性。3.本發(fā)明藥物聯(lián)用可以顯著地抑制vcap-n細(xì)胞中的nf-kb的轉(zhuǎn)錄活性，且藥物聯(lián)用的作用比單藥增強(qiáng)了20％左右，且藥物連用的藥效要強(qiáng)于單藥給藥產(chǎn)生了協(xié)同作用。附圖說明圖1是3α，11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(e12-1)(a)，3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23(b)，28-二酸(e13-1)和多西他賽(c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2是三萜化合物e12-1、e13-1和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖3是三萜化合物e12-1、e13-1和多西他賽被pi染色代表性的顯微照片。圖4是三萜化合物e12-1、e13-1和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)比率。圖5是三萜化合物e12-1和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后0h，5h和24h細(xì)胞劃痕愈合細(xì)胞形態(tài)顯微照片。圖6是三萜化合物e13-1和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后0h，5h和24h細(xì)胞劃痕愈合細(xì)胞形態(tài)顯微照片。圖7是三萜化合物e12-1、e13-1和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后遷移結(jié)果。圖8是三萜化合物e12-1、e13-1和多西他賽對(duì)vcap-n細(xì)胞處理后nf-κb轉(zhuǎn)錄活性的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。在下面實(shí)施例中所采用的實(shí)驗(yàn)儀器有thermoscientificseries8000co2培養(yǎng)箱(美國(guó)thermo公司)；classiia/b3水平流凈化工作臺(tái)(美國(guó)thermo公司)；mdf-382e超低溫冰箱(日本sanyo公司)；cpkr高速離心機(jī)(美國(guó)beckmancoulter公司)；allegrax-22r冷凍離心機(jī)(美國(guó)beckmancoulter公司)；locator4型液氮罐(美國(guó)thermo公司)；hotpack型高溫消毒柜(美國(guó)thermo公司)；移液槍(德國(guó)eppendorf公司)；nikonoptiphot光學(xué)顯微鏡(日本nikon公司)；nikoneclipsete200熒光顯微鏡(日本nikon公司)；nikonefd-3顯微鏡(日本nikon公司)；infinitem200pro多功能酶標(biāo)儀(奧地利tecan公司)；sirius單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(德國(guó)bertholddetectionsystems公司)；chemidoctmxrsimager成像系統(tǒng)(美國(guó)bio-rad公司)。所采用的實(shí)驗(yàn)試劑有rpmi-1640培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司)：將rpmi-1640干粉(1l用)溶于約800ml蒸餾水中，攪拌至完全溶解，加入青霉素和鏈霉素混合液(終濃度：青霉素100units/ml，鏈霉素100μg/ml)，加入2g碳酸鈉，定容至1000ml。然后加入10％胎牛血清，過濾除菌后分裝到無菌血清瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩ＬヅＱ?fbs)(美國(guó)serumsourceinternational公司)；胰蛋白酶-edta溶液(1×)(美國(guó)sigma-aldrich公司)；0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液(美國(guó)cambrexbioscience公司)；蛋白測(cè)定試劑盒(美國(guó)bio-rad公司)；熒光素酶檢測(cè)試劑盒(美國(guó)promega公司)；supersignalwestfemto最高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物(美國(guó)thermo公司)；mtt、pi、dmso(美國(guó)sigma-aldrich公司)；其他試劑均為美國(guó)sigma公司分析純以上等級(jí)。實(shí)施例1一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-18000份，多西他賽1份，微晶纖維素3600份，充分混勻后，灌裝膠囊1000粒。實(shí)施例2一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-15000份，多西他賽1.5份，微晶纖維素2850份，充分混勻后，灌裝膠囊100粒。實(shí)施例3一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-110000份，多西他賽1份，乳糖7600份，混合均勻后，加入5000份淀粉制成的10％的淀粉漿，進(jìn)行噴霧制粒。再加入硬脂酸鎂800份和pvp3000份，混合均勻后，壓片制成2000片。實(shí)施例4一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-15850份，多西他賽1份，乳糖400份，混合均勻后，加入7300份淀粉制成的10％的淀粉漿，進(jìn)行噴霧制粒。再加入硬脂酸鎂100份和pvp5150份，混合均勻后，壓片制成5000片。實(shí)施例5一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-18000份，多西他賽1.5份，淀粉9100份，羧甲基纖維素6200份，真空干燥，混合均勻，過100目篩，制成顆粒劑。實(shí)施例6一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-145000份，多西他賽0.8份，淀粉9800份，羧甲基纖維素3500份，真空干燥，混合均勻，過80目篩，制成顆粒劑。實(shí)施例7一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-145000份，多西他賽3份，二氧化硅4000份，淀粉漿3000份，蔗糖2000份，混勻，直至均勻的液體，過濾滅菌，分裝，制成口服液劑。實(shí)施例8一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-15000份，多西他賽3份，二氧化硅8500份，淀粉漿800份，蔗糖7000份，混勻，直至均勻的液體，過濾滅菌，分裝，制成口服液劑。實(shí)施例9一種具有協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-15000份，多西他賽0.8份，羧甲基淀粉鈉6400份，預(yù)膠化淀粉5550份，混勻，過120目篩，制粒，干燥，整粒，加入8500份硬脂酸鎂混合，壓片制成5000粒。實(shí)施例10一種具有協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-16500份，多西他賽2.5份，羧甲基淀粉鈉5200份，預(yù)膠化淀粉7300份，混勻，過60目篩，制粒，干燥，整粒，加入4600份硬脂酸鎂混合，壓片制成5000粒。實(shí)施例11一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-16500份，多西他賽0.9份，預(yù)膠化淀粉500份，乳糖6800份，混合均勻，制粒，干燥，加入二氧化硅7500份作為潤(rùn)滑劑，再次混勻，過120目篩，填充，制成100粒膠囊。實(shí)施例12一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-130000份，多西他賽0.9份，預(yù)膠化淀粉4200份，乳糖7500份，混合均勻，制粒，干燥，加入二氧化硅400份作為潤(rùn)滑劑，再次混勻，過60目篩，填充，制成5000粒膠囊。實(shí)施例13一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-130000份，多西他賽2.5份，二氧化硅6000份，淀粉漿800份，蔗糖8000份，混勻，直至均勻的液體，過濾滅菌，分裝，制成口服液。實(shí)施例14一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-16000份，多西他賽2.5份，二氧化硅8800份，淀粉漿3000份，蔗糖7000份，混勻，直至均勻的液體，過濾滅菌，分裝，制成口服液。上述實(shí)施例1-14中添加的藥物學(xué)上可接受的輔料可有效防潮，同時(shí)也利于藥物成型。實(shí)施例15mtt比色法mtt是一種能接收h+的黃色染料。在活細(xì)胞線粒體呼吸鏈中，琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素c可使mtt的四氮唑環(huán)開裂，生成藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞中不含這種脫氫酶。甲瓚結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，可通過檢測(cè)甲瓚結(jié)晶的量來評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。vcap細(xì)胞以接種濃度1×105個(gè)/ml的濃度接種于96孔板(100μl/孔)，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔(培養(yǎng)基鋪板孔)和對(duì)照孔(二甲基亞砜dmso處理孔)，5％co2，37℃培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度的化合物以及多西他賽進(jìn)行處理，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔，5％co2，37℃孵育72h后小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μl培養(yǎng)基配制的mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)；繼續(xù)培養(yǎng)1h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100μldmso，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；用酶標(biāo)儀測(cè)量570nm處各孔的吸光值，用式(1)計(jì)算實(shí)施例1-14中藥物中含有的三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，結(jié)果如表1所示。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)＝(1-a樣品組/a對(duì)照組)×100％式(1)表1三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞的增值抑制作用(mtt法)e12-1e13-1多西他賽docetaxelic5080.16±6.58μm61.18±3.79μm15.71±1.35nm采用mtt法分別測(cè)定了萜類化合物3α，11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(e12-1)，3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸(e13-1)和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞增殖的抑制活性。結(jié)果表明，所有的化合物具有較強(qiáng)的抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，其ic50分別為：80.16，61.17μm和15.71nm。實(shí)施例16臺(tái)盼藍(lán)拒染法臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)原理：正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因此，借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。vcap細(xì)胞以接種濃度0.2×105個(gè)/ml的濃度接種于直徑35mm培養(yǎng)皿(2ml/培養(yǎng)皿)(6孔板，2ml/孔)，5％co2，37℃培養(yǎng)過夜。加入溶解于二甲基亞砜(dmso)中的高、中、低濃度的化合物以及多西他賽，并且將其進(jìn)行聯(lián)合給藥，對(duì)vcap細(xì)胞進(jìn)行處理72h后，使用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法測(cè)定化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡的影響。具體方法為：使用胰酶消化貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液80μl與0.4％的臺(tái)盼藍(lán)溶液20μl均勻混合，靜置2min后，使用顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)。視野下，光亮透明細(xì)胞計(jì)為活細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染為藍(lán)色細(xì)胞計(jì)為死細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)二甲基亞砜濃度不超過0.1％。結(jié)果如表2所示。表2三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞存活率的影響用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)試了化合物e12-1，e13-1與多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞的致死率，選擇藥物聯(lián)用所需的濃度根據(jù)其ic50，選擇細(xì)胞致死率為20％時(shí)藥物的濃度值，確定e12-1，e13-1所需濃度為20μm，多西他賽濃度為2nm。確定給藥濃度后，對(duì)其進(jìn)行藥物聯(lián)用，結(jié)果如圖1所示，聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞的致死率比單藥給藥的致死率效果好。單藥時(shí)，e12-1，e13-1，綠原酸和烏蘇酸和多西他賽細(xì)胞的生存率分別是80.3％，74.1％和70.9％。而實(shí)施例1-14中藥物中含有的三萜化合物和多西他賽聯(lián)用后，vcap細(xì)胞的生存率分別僅為46.8％和48.5％。細(xì)胞生存率通過藥物聯(lián)合后下降了35％-40％左右。由此證明，在同等濃度下聯(lián)合用藥可以更有效的抑制vcap細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)生了協(xié)同增效的作用。實(shí)施例17細(xì)胞凋亡檢測(cè)將臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)中聯(lián)用化合物處理72h后的vcap細(xì)胞懸浮液，用細(xì)胞離心涂片器制成細(xì)胞涂片，經(jīng)丙酮/甲醇(1:1)溶液固定10min后，用碘化丙啶(pi)pbs溶液(10μg/ml)染色，使用熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察和形態(tài)分析，dna呈紅色熒光。細(xì)胞凋亡是由經(jīng)典的形態(tài)特征確定，包括核固縮，細(xì)胞收縮，和凋亡小體的形成。觀察時(shí)細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。每個(gè)樣品于顯微鏡下隨機(jī)觀察數(shù)個(gè)視野，總共不少于200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)視野(×200)中包含的凋亡細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)通過單藥和實(shí)施例1-14中藥物中含有的三萜化合物和多西他賽聯(lián)用進(jìn)行對(duì)比，對(duì)vcap細(xì)胞進(jìn)行72h處理后，經(jīng)固定并通過pi染色后，使用熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。圖3是三萜化合物和多西他賽被pi染色代表性的顯微照片。其中，(a)為以dmso為陽性對(duì)照，作用于細(xì)胞后被pi染色后的顯微照片，(b)、(c)、(d)、(e)和(f)分別為e12-1、e13-1和多西他賽單藥給藥和聯(lián)合用藥后，細(xì)胞被pi染色后的顯微照片。從圖3可知，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈紅色(圖3中灰色部分)致密濃染，或呈紅色碎塊狀致密濃染，細(xì)胞核部分發(fā)生異變。聯(lián)合藥物的細(xì)胞凋亡情況較單藥較為嚴(yán)重。圖4是三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)比率。從圖4可知，單藥時(shí)，e12-1、e13-1和多西他賽細(xì)胞的凋亡率分別是18.6％，21.1％和19.9％。藥物聯(lián)合時(shí)，細(xì)胞凋亡率大幅度提高，e12-1，e13-1分別與多西他賽聯(lián)用，vcap細(xì)胞凋亡率分別提高到36.5％和35.6％。結(jié)果說明，e12-1和e13-1分別與多西他賽藥物聯(lián)用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用比單藥給藥的效果提高，使細(xì)胞凋亡增加了15％～18％。進(jìn)一步說明，e12-1和e13-1分別與多西他賽藥物聯(lián)用的效果強(qiáng)于單藥給藥。實(shí)施例18細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)vcap細(xì)胞以接種濃度4×106個(gè)/ml的濃度接種于直徑35mm培養(yǎng)皿(2ml/培養(yǎng)皿)(6孔板，2ml/孔)，5％co2，37℃培養(yǎng)36-48h。觀察培養(yǎng)皿的細(xì)胞融合度達(dá)到90％-100％時(shí)，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，加入溶解于dmso中的化合物以及多西他賽，并且將其進(jìn)行聯(lián)合給藥，對(duì)vcap細(xì)胞進(jìn)行處理后，觀察0h，5h和24h時(shí)，細(xì)胞的愈合情況。具體方法為：用微量槍頭在培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，確保劃線部位粗細(xì)均勻，用pbs洗兩遍細(xì)胞，去除中央部分的細(xì)胞和部分漂浮細(xì)胞，換成無血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)設(shè)定好的藥物濃度加入培養(yǎng)基中。在藥物加入后，分別于0h，5h和24h時(shí)，觀察并拍照，記錄下細(xì)胞形態(tài)和其遷移情況。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，可以測(cè)定e12-1和e13-1分別與多西他賽藥物對(duì)vcap細(xì)胞的愈合能力以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的形態(tài)，實(shí)驗(yàn)通過單藥和藥物聯(lián)用進(jìn)行對(duì)比，使vcap細(xì)胞生長(zhǎng)融合到90％-100％后，對(duì)其進(jìn)行劃痕處理。圖5和圖6分別是三萜化合物e12-1和e13-1對(duì)vcap細(xì)胞處理后0h，5h和24h細(xì)胞劃痕愈合細(xì)胞形態(tài)顯微照片。從圖5和6可知，通過不同時(shí)間段的跟蹤觀察，細(xì)胞的形態(tài)與其愈合程度，分析藥物對(duì)細(xì)胞的愈合能力。結(jié)果表明，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的增加，被劃傷的細(xì)胞逐漸恢復(fù)原來的形態(tài)，一些不能恢復(fù)的細(xì)胞不斷死去，細(xì)胞的愈合程度不斷增強(qiáng)，劃痕面積逐漸變小。但是聯(lián)合用藥組的細(xì)胞，愈合能力明顯比單藥給藥的愈合能力弱。圖7是三萜化合物e12-1、e13-1和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后遷移結(jié)果。從圖7可知，e12-1和e13-1分別與多西他賽藥物聯(lián)合后對(duì)vcap細(xì)胞的愈合能力明顯低于單藥給藥，其愈合能力較單藥給藥降低了15％-20％左右，即藥物聯(lián)用的效果更能使細(xì)胞無法正常生長(zhǎng)。實(shí)施例19熒光素酶報(bào)告基因法熒光素酶報(bào)告基因法是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段。將熒光素酶表達(dá)序列插入到靶啟動(dòng)子的特定片段后方，如果目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與其靶啟動(dòng)子片段有作用。本發(fā)明使用vcap-n細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。vcap-n細(xì)胞是熒光素酶質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染vcap細(xì)胞后得到的單個(gè)穩(wěn)定克隆，通過檢測(cè)報(bào)告基因熒光素酶活性間接反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子nf-κb的活性。以0.5×105個(gè)/ml的濃度接種在12孔板中(1ml/孔)，5％co2，37℃培養(yǎng)過夜。然后加入e12-1、e13-1和多西他賽單藥以及e12-1和e13-1分別與多西他賽藥物連用，與細(xì)胞共同孵育24小時(shí)。然后吸棄所有溶液，使用冰浴的pbs清洗細(xì)胞2次后，加入1×細(xì)胞裂解緩沖液(0.1ml/次，兩次)并收集細(xì)胞裂解液。-80℃凍存樣品過夜，然后立即解凍，渦旋樣品30秒，在4℃離心(12，000rpm)5min。采用bio-rad蛋白定量試劑盒測(cè)定裂解液中蛋白濃度。蛋白濃度測(cè)定：在1ml反應(yīng)液a中加入20μl反應(yīng)液s配制反應(yīng)液a’；以pbs配制牛血清白蛋白bsa16mg/ml，并依次用水稀釋成0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/ml系列bsa標(biāo)準(zhǔn)溶液；各取5μl蛋白樣品(如果蛋白濃度過高，進(jìn)行適當(dāng)稀釋)和bsa標(biāo)準(zhǔn)溶液于96孔板中，依次加入25μl反應(yīng)液a’，200μl反應(yīng)液b，混勻，室溫振搖反應(yīng)15min；于波長(zhǎng)650nm處讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)樣品濃度。取上清液5μl與25μl的底物混合后立即用sirius單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每孔測(cè)定5次，取平均值。熒光素酶活性用發(fā)光強(qiáng)度與蛋白濃度的比值表示，并且換算為空白對(duì)照組(dmso處理)的百分比表示。研究證明nf-kb信號(hào)通路在前列腺癌的生長(zhǎng)、腫瘤形成、血管生成和轉(zhuǎn)移的過程中都發(fā)揮著重要作用，在很多前列腺癌中都存在nf-kb的組成性活化。圖8是三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap細(xì)胞處理后三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap-n細(xì)胞處理后核轉(zhuǎn)錄因子nf-kb活性表達(dá)結(jié)果。結(jié)果從表3和圖8可知，單藥時(shí)，e12-1、e13-1和多西他賽細(xì)胞抑制vcap-n細(xì)胞中的nf-kb的轉(zhuǎn)錄活性分別為57.8％，74.5％和83.6％，而藥物聯(lián)合時(shí)，藥物對(duì)vcap-n細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子nf-kb的抑制作用大幅度提高，e12-1，e13-1分別與多西他賽聯(lián)用，nf-kb的轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果分別降低為39.6％和53.4％。結(jié)果顯示，e12-1和e13-1分別與多西他賽藥物聯(lián)用可以顯著地抑制vcap-n細(xì)胞中的nf-kb的轉(zhuǎn)錄活性，且藥物聯(lián)用的作用比單藥增強(qiáng)了20％左右，因此，e12-1和e13-1分別與多西他賽藥物聯(lián)用的抗腫瘤作用可能與抑制nf-κb轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，并且藥物連用的藥效要強(qiáng)于單藥給藥產(chǎn)生了協(xié)同作用。表3三萜化合物和多西他賽對(duì)vcap-n細(xì)胞熒光素酶活性影響實(shí)施例20統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果用means±sd的形式表示。樣品處理組與對(duì)照組間數(shù)據(jù)差異性分析均采用student'st檢驗(yàn)進(jìn)行。p<0.05(*)和p<0.001(**)分別代表差異顯著和差異極顯著。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合和簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12